CN102166260B

CN102166260B - 具有抗肿瘤作用的丁香提取物及其药物制剂

Info

Publication number: CN102166260B
Application number: CN201010533613.3A
Authority: CN
Inventors: 林秀坤; 刘海洲; 廖德忠; 魏鉴腾; 刘明
Original assignee: 林秀坤
Current assignee: Shandong Nuzhuoge Biomedical Co., Ltd.
Priority date: 2010-11-07
Filing date: 2010-11-07
Publication date: 2015-03-11
Anticipated expiration: 2030-11-07
Also published as: CN102166260A

Abstract

本发明公开了丁香提取物在抗肿瘤方面的医药新用途，同时也公开了丁香提取物的制备方法，即以丁香为原料，用水和/或有机溶剂提取得到，以及用丁香提取物为原料制备成片剂、胶囊剂、丸剂、注射剂等临床上可接受的药物制剂，其中含有重量百分比为1%-99%的丁香提取物和99%-1%的药用赋形剂（包括其它配伍用的药物）。本发明提供的丁香提取物及其药物制剂具有很好的抗肿瘤作用。表现在：对体外人卵巢癌、人宫颈癌、人肝癌、人结肠癌、人乳腺癌、人胰腺癌细胞6种肿瘤细胞具有明显的抑制活性，并对此6种肿瘤细胞的裸鼠移植瘤具有显著的抑瘤活性。此外，由于该药物制剂的主要活性成分为中药提取物，因而相对化学治疗药物而言具有毒副作用小的优点。

Description

具有抗肿瘤作用的丁香提取物及其药物制剂

一、技术领域

本发明涉及丁香提取物在制备抗肿瘤药物中的应用及其药物制剂，属于中药领域。

二、背景技术

丁香（Eugenia caryophyllata Thunb）为桃金娘科蒲桃属植物，以花蕾和其果实入药。花蕾称公丁香或雄丁香，果实称母丁香或雌丁香。在花蕾开始呈白色，渐次变绿色，最后呈鲜红色时可采集。将采得的花蕾除去花梗晒干即成。丁香性温，味辛。已知功能主治为治呃逆、呕吐、反胃、痢疾、心腹冷痛、痃癖、疝气、癣症等。丁香中含有的丁香酚成分有局部麻醉止痛作用；水或醇提取物对猪蛔虫有麻醉和杀灭作用；对细菌及致病性真菌均有抑制作用。

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的常见病和多发病，抗癌药物的开发已成为本世纪新药研究的重大课题。目前，从植物中寻找高效低毒的抗肿瘤药物，已成为国内外抗肿瘤药物研究的重点。我们在筛选抗肿瘤药物过程中发现丁香提取物具有很强的抑制肿瘤细胞和实体瘤生长的作用。

在本发明之前未见以丁香提取物为原料制备药物剂型并用于预防和治疗肿瘤疾病的报道。

三、发明内容

本发明的目的之一是提供了丁香提取物的制备方法；

本发明的目的之二是提供了丁香提取物的药物制剂；

本发明的目的之三是提供了丁香提取物的抗肿瘤新用途。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明的丁香提取物是按照如下方法制备：用水和/或有机溶剂作为提取剂，从丁香的干燥花蕾中提取得到丁香提取物。其中，所述有机溶剂具体可为甲醇、乙醇、石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、苯或甲苯。所述提取剂优选体积百分含量为60%-99%的乙醇水溶液，最好选择体积百分含量为80%-95%的乙醇水溶液。所述提取可为回流提取，提取温度可为60-100℃，至少提取一次，每次提取的时间为1-4小时。

本发明的药物制剂含有1%-99%的丁香提取物和99%-1%的赋形剂（包括其它配用的药物），优选含有20%-80%的丁香提取物和80%-20%的赋形剂（包括其它配用的药物），最好含有40%-60%的丁香提取物和60%-40%的赋形剂（包括其它配用的药物）。

按药剂学方法，可以将本发明的丁香提取物制备成多种临床药物剂型作为抗肿瘤药物，包括口服制剂或非肠道给药的剂型。所说的口服制剂选于片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、微囊片剂、混悬剂、滴丸、口服液体制剂中的任何一种；所说的非肠道给药剂型选自于注射剂、气雾剂、栓剂或皮下给药剂型当中的一种。

本发明的抗肿瘤药物中的辅料是指常规的赋形剂，如溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂、粘合剂等。本发明的抗肿瘤药物中的其它配伍用的药物，指的是以有效剂量的丁香提取物为一定的药物原料，再配伍其它已允许合用的中药或化学药品。上述预防和/或治疗肿瘤药物的用量一般为200-1000mg丁香提取物/kg体重/天，疗程为10至15天。

本发明的丁香提取物药物制剂具有抗肿瘤作用，是通过以下的药效学试验得到证实的。

试验例1 考察了丁香提取物对体外6种肿瘤细胞的抑制作用

细胞：人卵巢癌细胞（Skov-3）、人宫颈癌上皮细胞（Hela）、人肝癌细胞（BEL-7402）、人结肠癌细胞（HT-29）、人乳腺癌细胞（MCF-7）、人胰腺癌细胞（PANC-1）。以上细胞均为中科院海洋所海洋药物实验室提供。

药品及试剂：丁香提取物：中科院海洋所海洋药物实验室提供，膏状物；5-氟脲嘧啶（5-FU）江苏南通精华制药有限公司产品，批号为100402； MTT（SIGMA，USA）；DMSO（SIGMA，USA）；胰蛋白酶（SIGMA，USA）；RPMI1640（GIBCO，Invitragen Co.，USA）；DMEM（GIBCO，Invitragen Co.，USA）；优级胎牛血清（GIBCO，Invitragen Co.，USA）；特级胎牛血清Fetal Bovine Serum（Hyclone）。

仪器：超低温冰箱（Nature，USA），细胞培养箱（SANYO，Japan），倒置显微镜（NIKON，Japan），酶标仪（Bio-Tek Instruments，Inooski，VT，USA），PH计（Thermo orion，USA），超净工作台（FLC-哈尔滨东联仪器厂）。

实验方法MTT法：各种人的肿瘤细胞株按照常规方法培养传代，收集对数生长期细胞，调节细胞悬液浓度5×10⁴个/ml左右。将细胞悬液加入96孔培养板中，每个孔加入180 μl。置于37℃恒温培养箱中培养24 h后，实验组加入各浓度丁香提取物（以5-FU作为阳性对照组）20 μl/孔，每组各设4个平行孔，并分别设空白孔（只加入溶剂）以调零。在培养箱37℃，培养48 h后，用移液枪将96孔板中液体洗净后每孔加入MTT（1 mg/ml）30 μl，置CO₂培养箱37℃ 培养4 h，弃去上清，每孔加入DMSO 150 μl，置摇床摇匀30 min，用酶标仪在492 nm下检测，利用SPSS统计软件，计算细胞死亡率，求取IC₅₀。

实验结果表明，经SPSS软件统计，丁香提取物对用于试验的6种肿瘤细胞，人卵巢癌细胞（Skov-3）、人宫颈癌上皮细胞（Hela）、人肝癌细胞（BEL-7402）、人结肠癌细胞（HT-29）、人乳腺癌细胞（MCF-7）、人胰腺癌细胞（PANC-1）均有不同程度的抑制作用，并且呈一定的剂量依赖关系，不同浓度的丁香提取物对各种肿瘤细胞的抑制率、IC₅₀值详见表1。

表1 不同浓度的丁香提取物对6种肿瘤细胞的抑制率

试验例2 丁香提取物对6种裸鼠移植瘤的抑瘤作用

实验动物：BALB/c裸鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物许可证编号：SYXK(沪)2010-0047，共140只，7~9周龄，体重20~22g，均为雄鼠。动物饲养及实验为无特殊病原菌级屏障系统，饲养于青岛大学医学院实验动物中心。

肿瘤细胞接种：分别取对数生长期的人卵巢癌细胞（Skov-3）、人宫颈癌上皮细胞（Hela）、人肝癌细胞（BEL-7402）、人结肠癌细胞（HT-29）、人乳腺癌细胞（MCF-7）、人胰腺癌细胞（PANC-1）制成瘤细胞悬液（1×10⁷个/ml），分别植入BALB/c雄性裸鼠腋部皮下（约0.3ml/只），接种后定期观察小鼠精神、饮食及排便等情况。传代一次后，将肿瘤组织无菌取出并切成大小相同2mm³的小块，用套管针接种在裸鼠腋部皮下。

实验分组及方法：游标卡尺测量肿瘤结节的长径（a）、短径（b），按公式V=a×b²×0.52计算肿瘤体积，当皮下移植瘤长到100 mm³后，挑选肿瘤大小一致的裸鼠，将裸鼠称重用随机数字表法分成3组，每种肿瘤细胞对应的裸鼠均有阴性对照组、阳性对照组、丁香提取物组各5只裸鼠，即每种肿瘤细胞对应15只裸鼠。药物浓度及具体分组如下：（1）阴性对照组：腹腔注射0.2ml生理盐水；（2）阳性药物对照组：腹腔注射30mg/kg的5-FU；（3）丁香提取物组：100mg/kg腹腔注射。每3天注射一次，连续注射10次，于末次给药24 h 后，取出瘤块，测定瘤重，最后计算平均肿瘤抑制率。采用SPSS软件统计，试验数据以（平均数±标准差）表示，P小于0.01为统计学差异显著性意义标准。

（1）、丁香提取物对Skov-3裸鼠移植瘤的抑制作用。试验结果见表2。

表2 丁香提取物对Skov-3裸鼠移植瘤的抑制作用试验结果（`X ±SD）

注：与对照组比较，**P<0.01 *P<0.05

（2）、丁香提取物对Hela裸鼠移植瘤的抑制作用。试验结果见表3。

表3 丁香提取物对Hela裸鼠移植瘤的抑制作用试验结果（`X ±SD）

注：与对照组比较，**P<0.01 *P<0.05

（3）、丁香提取物对BEL-7402裸鼠移植瘤的抑制作用。试验结果见表4。

表4丁香提取物对BEL-7402裸鼠移植瘤的抑制作用试验结果（`X ±SD）

注：与对照组比较，**P<0.01 *P<0.05

（4）、丁香提取物对HT-29裸鼠移植瘤的抑制作用。试验结果见表5。

表5 丁香提取物对HT-29裸鼠移植瘤的抑制作用试验结果（`X ±SD）

注：与对照组比较，**P<0.01 *P<0.05

（5）、丁香提取物对MCF-7裸鼠移植瘤的抑制作用。试验结果见表6。

表6 丁香提取物对MCF-7裸鼠移植瘤的抑制作用试验结果（`X ±SD）

注：与对照组比较，**P<0.01 *P<0.05

（6）、丁香提取物对PANC-1裸鼠移植瘤的抑制作用。试验结果见表7。

表7 丁香提取物对PANC-1裸鼠移植瘤的抑制作用试验结果（`X ±SD）

注：与对照组比较，**P<0.01 *P<0.05

由表2~7可见，丁香提取物治疗组与5-FU治疗组的各裸鼠移植瘤较对照组均受到了不同程度的抑制，并且丁香提取物组对裸鼠体重的影响很小，表明丁香提取物无明显毒副作用。

上述离体试验和整体试验表明，丁香提取物对离体和整体肿瘤细胞均具有明显的抑制作用，且无明显毒副作用，提示丁香提取物是一种很有前景的抗肿瘤药物。

四、具体实施方式

实施例1、丁香提取物的制备

取丁香（青岛北京同仁堂药店，货号100812）500g，将其以1:3（丁香：95%乙醇）的重量份数比与95%乙醇（乙醇：水=95:5，体积比）混合，60℃回流提取3h，抽滤，收集提取液；将滤渣中加入与第一次等量的95%乙醇，60℃再回流提取3h，收集提取液，与第一次合并；滤渣加入与第一次等量95%乙醇，60℃再一次回流提取3h，抽滤，收集第三次回流提取液，与前两次回流提取液合并，将所得的提取液进行真空减压浓缩、真空干燥（去除乙醇和水）至恒重，得到4.1g丁香提取物。

实施例2 丁香提取物药物制剂的制备

（1）片剂的制备

丁香提取物 100g，药用淀粉 100g，混合均匀，用适量乙醇作为粘合剂制粒，干燥，经整粒机整粒，压片，每片0.30g，口服，每次1-2片，每日两次。

（2）胶囊剂的制备

丁香提取物 100g，药用淀粉 100g，混合均匀，用适量乙醇作为粘合剂制粒，干燥，过120目筛整粒，装0#胶囊，每粒0.300g，每次口服1-2粒，每日两次。

（3）滴丸剂的制备

聚乙二醇₄₀₀₀ 1200g，在水浴上熔化，加入丁香提取物原料750g，搅拌均匀，倾入保温管中，调节恒温装置，使药液在80-90℃下滴入冷却过的液体石蜡中（温度±4℃），滴完后，将药丸倾入滤纸上吸干石蜡油，再加入少量滑石粉，混匀，得丁香提取物滴丸 10000粒。每次口服1-2粒，每日两次。

（4）颗粒剂的制备

丁香提取物原料100g，淀粉1000g，糖粉500g，混合均匀，用适量乙醇制粒，干燥、整粒、分装即得。口服，一次5g，一日两次。

（5）注射剂的制备

丁香提取物 40g，丙二醇 50ml，聚乙二醇400 100ml，注射用水600ml，混合，水浴加热30分钟，加苯甲醇90ml，再用注射用水加至1800ml，在超声波中处理10分钟，再在水浴上加热30分钟，调pH值为5.5-6.5，过滤，灌封，灭菌即得。每支3ml，肌肉注射，一次3ml，一日两次。

Claims

1.具有抗肿瘤作用的丁香提取物，所述丁香提取物按照如下方法制备：

用有机溶剂作为提取剂，从丁香干燥花蕾中提取得到丁香提取物；所述的提取剂为乙醇；并且所述乙醇为体积百分含量为80％-95％的乙醇水溶液；所述提取为回流提取，提取的温度为60-100℃，至少提取一次，每次提取的时间为1-4小时。

2.一种用于肿瘤治疗的药物制剂，其由治疗有效剂量的权利要求1所述的丁香提取物和一种或多种药学上可接受的药用赋形剂组成。

3.根据权利要求2所述的药物制剂，其由1％-99％的丁香提取物和99％-1％的药用赋形剂组成。

4.根据权利要求2所述的药物制剂，其特征在于所述的药物制剂是口服制剂或非肠道给药的剂型。

5.根据权利要求2所述的药物制剂，其特征在于所述的口服制剂选自于片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸、口服液体制剂中的任何一种；所述的非肠道给药剂型选自于注射剂、气雾剂、栓剂当中的任何一种。

6.根据权利要求5所述的药物制剂，其中，所述口服制剂为混悬剂。

7.根据权利要求5所述的药物制剂，其中，所述非肠道给药剂型为皮下给药剂型。

8.权利要求1所述的丁香提取物在制备抗肿瘤药物中的用途；其中，所述的抗肿瘤是指抑制肿瘤细胞和实体瘤的生长；所述的肿瘤细胞选自以下5种：人卵巢癌细胞(Skov-3)、人肝癌细胞(BEL-7402)、人结肠癌细胞(HT-29)、人乳腺癌细胞(MCF-7)和人胰腺癌细胞(PANC-1)；所述的实体瘤选自上述5种肿瘤细胞的裸鼠移植性肿瘤。