CN106565849B - 一种景天三七多糖的制备方法及其应用 - Google Patents

一种景天三七多糖的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种景天三七多糖的制备方法及其应用，有效解决从景天三七药材中提取纯化得到多糖及制备抗乳腺癌药物的问题，取景天三七药材粗粉，用乙醇回流提取，浓缩离心得沉淀，将沉淀依次用与药材粗粉相同重量的无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤，加水溶解，再加入三氯乙酸溶液，搅拌离心取上清液，用水透析，减压浓缩，离心得沉淀，将沉淀依次用与药材粗粉相同重量的无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤2次，得景天三七多糖，本发明制备工艺简单，易操作，成本低，具有制备临床上抗乳腺癌药物的前景，实现在制备抗乳腺癌药物方面的应用，开拓了景天三七药材的应用价值，经济和社会效益显著。

Description

一种景天三七多糖的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及中药制药领域，特别是一种景天三七多糖的制备方法及其应用。
背景技术
多糖是一类由单糖组成的高分子化合物，作为生命物质的组成成分之一，除了储存能量和支持结构外，还是一类重要的信息分子，广泛参与了细胞的各种生命现象及生理过程的调节，如免疫细胞间信息的传递与感受，细胞的转化、分裂及再生等活动。近年来，人们发现一些多糖如香菇多糖、云芝多糖、茯苓多糖，能够治疗免疫系统受到损伤而引发的一些疾病，且无毒副作用。作为癌症的辅助治疗药物，具有抑瘤效果好、安全性高等优点。为此，多糖在医药方面的应用渐渐引起人们的兴趣。多糖近几年还被证实具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖、降血脂等良好的生物活性，在生物体内起着重要作用，是国内外众多学科领域研究的热点之一。
景天三七是景天科景天属植物费菜(Sedum aizoon L.)的全草。广泛分布于我国福建、浙江、江苏、河南等省。景天三七味甘、微酸，性平，归心、肝经。作为民间常用中草药，具有散瘀止血、安心凝神、解毒等功效，常用于治疗各类出血症、失眠、跌打损伤等。化学研究表明，景天三七主要含有生物碱、黄酮类化合物。杨艳俊等报道景天三七多糖的超声提取方法，提取溶剂为水、提取温度为50℃、料液比1：50、超声时间为40min、超声提取次数3次。其不足之处在于没有除去粗多糖中的蛋白质和苷类化合物等水溶性成分。经蒸馏水直接提取后得到的粗多糖一般含有大量的蛋白质、无机盐、苷类等物质，这些物质的存在对多糖的生物活性会产生了严重的干扰。因此，选择合适的方法富集得到高纯度的多糖类化合物是进行后续相关研究的的关键环节。截止目前，关于如何对景天三七多糖进行纯化及其在抗乳腺癌方面的应用未见相关专利和文献报道。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种景天三七多糖的制备方法及其应用，可有效解决从景天三七药材中提取纯化得到多糖及制备抗乳腺癌药物的问题。
解决的技术方案是：一种景天三七多糖的制备方法，包括以下步骤，取景天三七药材粗粉，每次用药材粗粉重量5-7倍的体积浓度95%乙醇，在90-95℃下回流提取2次，每次提取时间为1-1.5h，过滤得药渣，将药渣置通风处晾干，向药渣中每次加入药材粗粉重量8-12倍的水，在95-98℃下依次回流提取3次，每次提取时间为1-2h，过滤，合并滤液，浓缩至相对密度1.1-1.2，用体积浓度95%的乙醇调至含醇量为75-85%，静置24h，13000r/min离心10min得沉淀，将沉淀依次用与药材粗粉相同重量的无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤2次，得粗多糖，粗多糖加水溶解，再加入等体积的质量浓度为30%的三氯乙酸溶液，搅拌30min，混匀后，4℃静置24h，13000r/min离心10min，取上清液，向上清液中加入0.01mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.0，用水透析，透析液减压浓缩至相对密度1.1-1.2，再用体积浓度95%的乙醇调至含醇量为80%，静置24h，13000r/min离心10min得沉淀，将沉淀依次用与药材粗粉相同重量的无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤2次，得景天三七多糖。
景天三七多糖作为唯一活性部位在制备抗乳腺癌药物中的应用，所述的药物为片剂、胶囊剂、颗粒剂或丸剂等。
本发明制备工艺简单，易操作，成本低，节能环保，采用95%乙醇对景天三七药材进行提取除去苷类，然后采用水对药渣进行提取得到粗多糖，通过醇沉，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤进一步除去脂溶性杂质，通过透析的方法除去无机盐和小分子水溶性杂质，制备出的景天三七多糖经研究表明，对乳腺癌细胞MCF-7的增殖具有抑制作用，具有制备临床上抗乳腺癌药物的前景，实现在制备抗乳腺癌药物方面的应用，开拓了景天三七药材的应用价值，为其进一步的开发与利用奠定了基础，经济和社会效益显著。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
实施例1
一种景天三七多糖的制备方法，包括以下步骤：
取景天三七药材粗粉125g，每次用药材粗粉重量7倍的体积浓度95%乙醇（即875ml），在90℃下回流提取2次，第一次提取时间为1.5h，第二次提取时间为1h，过滤得药渣，将药渣置通风处晾干，向药渣中每次加入药材粗粉重量8倍的水（即1000ml），在95℃下依次回流提取3次，提取时间分别为2h、1.5h、1h，过滤，合并滤液，浓缩至相对密度1.1，用体积浓度95%的乙醇调至含醇量为75%，静置24h，13000r/min离心10min得沉淀，将沉淀依次用与药材粗粉相同重量的无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤2次，得粗多糖，粗多糖加水溶解至75mL，再加入等体积的质量浓度为30%的三氯乙酸溶液，搅拌30min，混匀后，4℃静置24h，13000r/min离心10min，取上清液，向上清液中加入0.01mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.0，用水透析，透析液减压浓缩至相对密度1.1，再用体积浓度95%的乙醇调至含醇量为80%，静置24h，13000r/min离心10min得沉淀，将沉淀依次用与药材粗粉相同重量的无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤2次，得景天三七多糖。
实施例2
一种景天三七多糖的制备方法，包括以下步骤：
取景天三七药材粗粉1250g，每次用药材粗粉重量7倍的体积浓度95%乙醇（即8750ml），在95℃下回流提取2次，第一次提取时间为1.5h，第二次提取时间为1h，过滤得药渣，将药渣置通风处晾干，向药渣中每次加入药材粗粉重量12倍的水（即15000ml），在98℃下依次回流提取3次，提取时间分别为2h、1.5h、1h，过滤，合并滤液，浓缩至相对密度1.2，用体积浓度95%的乙醇调至含醇量为85%，静置24h，13000r/min离心10min得沉淀，将沉淀依次用与药材粗粉相同重量的无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤2次，得粗多糖，粗多糖加水溶解至750mL，再加入等体积的质量浓度为30%的三氯乙酸溶液，搅拌30min，混匀后，4℃静置24h，13000r/min离心10min，取上清液，向上清液中加入0.01mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.0，用水透析，透析液减压浓缩至相对密度1.2，再用体积浓度95%的乙醇调至含醇量为80%，静置24h，13000r/min离心10min得沉淀，将沉淀依次用与药材粗粉相同重量的无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤2次，得景天三七多糖。
实施例3
一种景天三七多糖的制备方法，包括以下步骤：
取景天三七药材粗粉250g，每次用药材粗粉重量6倍的体积浓度95%乙醇（即1500ml），在92℃下回流提取2次，提取时间分别为1.5h、1h，过滤得药渣，将药渣置通风处晾干，向药渣中每次加入药材粗粉重量10倍的水（即2500ml），在97℃下依次回流提取3次，提取时间分别为2h、1.5h、1h，过滤，合并滤液，浓缩至相对密度1.1，用体积浓度95%的乙醇调至含醇量为80%，静置24h，13000r/min离心10min得沉淀，将沉淀依次用与药材粗粉相同重量的无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤2次，得粗多糖，粗多糖加水溶解至150mL，再加入等体积的质量浓度为30%的三氯乙酸溶液，搅拌30min，混匀后，4℃静置24h，13000r/min离心10min，取上清液，向上清液中加入0.01mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.0，用水透析，透析液减压浓缩至相对密度1.1，再用体积浓度95%的乙醇调至含醇量为80%，静置24h，13000r/min离心10min得沉淀，将沉淀依次用与药材粗粉相同重量的无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤2次，得景天三七多糖。
实施例4
一种景天三七多糖的制备方法，包括以下步骤：
取景天三七药材粗粉750，每次用药材粗粉重量7倍的体积浓度95%乙醇，在94℃下回流提取2次，提取时间分别为1.5h、1h，过滤得药渣，将药渣置通风处晾干，向药渣中每次加入药材粗粉重量9倍的水，在95℃下依次回流提取3次，提取时间分别为2h、1.5h、1h，过滤，合并滤液，浓缩至相对密度1.2，用体积浓度95%的乙醇调至含醇量为80%，静置24h，13000r/min离心10min得沉淀，将沉淀依次用与药材粗粉相同重量的无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤2次，得粗多糖，粗多糖加水溶解，再加入等体积的质量浓度为30%的三氯乙酸溶液，搅拌30min，混匀后，4℃静置24h，13000r/min离心10min，取上清液，向上清液中加入0.01mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.0，用水透析，透析液减压浓缩至相对密度1.2，再用体积浓度95%的乙醇调至含醇量为80%，静置24h，13000r/min离心10min得沉淀，将沉淀依次用与药材粗粉相同重量的无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤2次，得景天三七多糖。
本发明方法稳定可靠，其制备得到的景天三七多糖经多次反复试验，对人乳腺癌细胞MCF-7具有较强的生长抑制作用，作为唯一活性部位在制备抗乳腺癌药物中的应用，并经实验得到充分证明，有关实验资料如下：
1. 实验材料
人乳腺癌细胞株MCF-7由中国医学科学院药物研究所提供，胎牛血清购自Gibco公司。
2. 细胞培养
MCF-7细胞培养于含有10% 经加热灭活的胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的RPMI1640培养基中，将培养瓶置于37℃，5% CO2饱和湿度培养箱培养，每1~2天换培养液一次。当细胞生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面时，用0.25%胰蛋白酶消化，传代。
3. MTT法
对数生长期细胞培养于96孔培养板内，每孔100 μL(含4000个肿瘤细胞)，置37℃、5% CO2温箱中培养。次日，给药组加入景天三七多糖的稀释液。对照组加入与给药组等体积的溶剂。置37℃、5% CO2温箱中培养。2天后弃培养液，每孔加50 μL (1 mg/mL) MTT溶液(培养基配置)。37°C孵育4小时，弃去上清液，每孔加入DMSO 200 μL溶解甲簪颗粒，轻度振荡溶解。用酶标仪，在检测波长490 nm条件下测定光密度值(OD)，以溶剂对照处理的细胞为对照组，用下面公式计算药物对细胞的抑制率。
4.实验结果
景天三七多糖经MTT实验，对乳腺癌细胞MCF-7具有较强的抑制作用。具体见表1。
本发明经过多次反复实验证实，景天三七多糖对人乳腺癌细胞MCF-7的增殖具有较强的抑制作用，具有制备临床上抗乳腺癌药物的前景，并经过临床对58例乳腺癌患者试用，除2人无明显效果外，其余均有不同程度的症状改善，效果之好，未曾料到。本发明方法制备的活性部位，在实际应用中，可制备成片剂、胶囊剂、颗粒剂，丸剂等剂型。实现在制备抗乳腺癌药物方面的应用，还开拓了景天三七药材的应用价值，为其进一步的开发与利用奠定了基础，经济和社会效益显著。

Claims (5)

1.一种景天三七多糖作为唯一活性部位在制备抗乳腺癌药物中的应用，所述的景天三七多糖是，取景天三七药材粗粉，每次用药材粗粉重量5-7倍的体积浓度95%乙醇，在90-95℃下回流提取2次，每次提取时间为1-1.5h，过滤得药渣，将药渣置通风处晾干，向药渣中每次加入药材粗粉重量8-12倍的水，在95-98℃下依次回流提取3次，每次提取时间为1-2h，过滤，合并滤液，浓缩至相对密度1.1-1.2，用体积浓度95%的乙醇调至含醇量为75-85%，静置24h，13000r/min离心10min得沉淀，将沉淀依次用与药材粗粉相同重量的无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤2次，得粗多糖，粗多糖加水溶解，再加入等体积的质量浓度为30%的三氯乙酸溶液，搅拌30min，混匀后，4℃静置24h，13000r/min离心10min，取上清液，向上清液中加入0.01mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.0，用水透析，透析液减压浓缩至相对密度1.1-1.2，再用体积浓度95%的乙醇调至含醇量为80%，静置24h，13000r/min离心10min得沉淀，将沉淀依次用与药材粗粉相同重量的无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤2次，得景天三七多糖。
2.根据权利要求1所述的景天三七多糖作为唯一活性部位在制备抗乳腺癌药物中的应用，其特征在于，所述的景天三七多糖是，取景天三七药材粗粉125g，每次用药材粗粉重量7倍的体积浓度95%乙醇，在90℃下回流提取2次，提取时间分别为1.5h、1h，过滤得药渣，将药渣置通风处晾干，向药渣中每次加入药材粗粉重量8倍的水，在95℃下依次回流提取3次，提取时间分别为2h、1.5h、1h，过滤，合并滤液，浓缩至相对密度1.1，用体积浓度95%的乙醇调至含醇量为75%，静置24h，13000r/min离心10min得沉淀，将沉淀依次用与药材粗粉相同重量的无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤2次，得粗多糖，粗多糖加水溶解至75mL，再加入等体积的质量浓度为30%的三氯乙酸溶液，搅拌30min，混匀后，4℃静置24h，13000r/min离心10min，取上清液，向上清液中加入0.01mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.0，用水透析，透析液减压浓缩至相对密度1.1，再用体积浓度95%的乙醇调至含醇量为80%，静置24h，13000r/min离心10min得沉淀，将沉淀依次用与药材粗粉相同重量的无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤2次，得景天三七多糖。
3.根据权利要求1所述的景天三七多糖作为唯一活性部位在制备抗乳腺癌药物中的应用，其特征在于，所述的景天三七多糖是，取景天三七药材粗粉1250g，每次用药材粗粉重量7倍的体积浓度95%乙醇，在95℃下回流提取2次，提取时间分别为1.5h、1h，过滤得药渣，将药渣置通风处晾干，向药渣中每次加入药材粗粉重量12倍的水，在98℃下依次回流提取3次，提取时间分别为2h、1.5h、1h，过滤，合并滤液，浓缩至相对密度1.2，用体积浓度95%的乙醇调至含醇量为85%，静置24h，13000r/min离心10min得沉淀，将沉淀依次用与药材粗粉相同重量的无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤2次，得粗多糖，粗多糖加水溶解至750mL，再加入等体积的质量浓度为30%的三氯乙酸溶液，搅拌30min，混匀后，4℃静置24h，13000r/min离心10min，取上清液，向上清液中加入0.01mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.0，用水透析，透析液减压浓缩至相对密度1.2，再用体积浓度95%的乙醇调至含醇量为80%，静置24h，13000r/min离心10min得沉淀，将沉淀依次用与药材粗粉相同重量的无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤2次，得景天三七多糖。
4.根据权利要求1所述的景天三七多糖作为唯一活性部位在制备抗乳腺癌药物中的应用，其特征在于，所述的景天三七多糖是，取景天三七药材粗粉250g，每次用药材粗粉重量6倍的体积浓度95%乙醇，在92℃下回流提取2次，提取时间分别为1.5h、1h，过滤得药渣，将药渣置通风处晾干，向药渣中每次加入药材粗粉重量10倍的水，在97℃下依次回流提取3次，提取时间分别为2h、1.5h、1h，过滤，合并滤液，浓缩至相对密度1.1，用体积浓度95%的乙醇调至含醇量为80%，静置24h，13000r/min离心10min得沉淀，将沉淀依次用与药材粗粉相同重量的无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤2次，得粗多糖，粗多糖加水溶解至150mL，再加入等体积的质量浓度为30%的三氯乙酸溶液，搅拌30min，混匀后，4℃静置24h，13000r/min离心10min，取上清液，向上清液中加入0.01mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.0，用水透析，透析液减压浓缩至相对密度1.1，再用体积浓度95%的乙醇调至含醇量为80%，静置24h，13000r/min离心10min得沉淀，将沉淀依次用与药材粗粉相同重量的无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤2次，得景天三七多糖。
5.根据权利要求1所述的景天三七多糖作为唯一活性部位在制备抗乳腺癌药物中的应用，其特征在于，所述的景天三七多糖是，取景天三七药材粗粉750，每次用药材粗粉重量7倍的体积浓度95%乙醇，在94℃下回流提取2次，提取时间分别为1.5h、1h，过滤得药渣，将药渣置通风处晾干，向药渣中每次加入药材粗粉重量9倍的水，在95℃下依次回流提取3次，提取时间分别为2h、1.5h、1h，过滤，合并滤液，浓缩至相对密度1.2，用体积浓度95%的乙醇调至含醇量为80%，静置24h，13000r/min离心10min得沉淀，将沉淀依次用与药材粗粉相同重量的无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤2次，得粗多糖，粗多糖加水溶解，再加入等体积的质量浓度为30%的三氯乙酸溶液，搅拌30min，混匀后，4℃静置24h，13000r/min离心10min，取上清液，向上清液中加入0.01mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.0，用水透析，透析液减压浓缩至相对密度1.2，再用体积浓度95%的乙醇调至含醇量为80%，静置24h，13000r/min离心10min得沉淀，将沉淀依次用与药材粗粉相同重量的无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤2次，得景天三七多糖。
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