CN105477068B - 一种桑枝叶活性部位的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种桑枝叶活性部位的制备方法及其应用。所述制备方法包括包括溶剂提取桑枝叶总浸膏、醇沉去除多糖、鞣质等成分，大孔树脂吸附、分离纯化、ODS柱精制等步骤。经实验验证，本发明制备的桑枝叶提取物SangA对肿瘤干细胞表现出显著抑制作用，是制备抗肿瘤药物的理想成分。

Description

一种桑枝叶活性部位的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种桑枝叶活性部位的制备方法及其在抗肿瘤领域的应用。

背景技术

恶性肿瘤是威胁人类健康的重大疾病，已经成为人类死亡的第一位或第二位的原因，是当今医学界尚未攻克的难题。肿瘤的发生是一个多因素、多步骤的病理过程，涉及到一系列的分子变化过程，其本质表现为细胞不受控制的异常增殖，这种异常生长的能力除了表现为肿瘤本身的持续生长之外，还表现为对邻近正常组织的侵犯及经血管、淋巴管等转移到身体其它部位的能力，90%以上由恶性肿瘤导致的死亡归咎于这种肿瘤的侵袭与转移。

手术治疗、放射治疗及药物治疗是目前肿瘤治疗的三大主要方法，对于不适于手术治疗及放射治疗的患者，药物治疗仍是首选，传统抗肿瘤药物的着眼点是杀灭肿瘤细胞，虽然取得了一些积极的治疗效果，但在化疗过程中出现的耐药性及肿瘤的侵袭与转移，导致治疗的最终失败。为什么在临床上认为已得到彻底杀灭的肿瘤细胞会出现复发和转移，是科学界一直在不断探索的问题。肿瘤干细胞理论认为在肿瘤组织中，存在着占肿瘤细胞总量很小的一部分细胞（0.1%～4%左右），称之为肿瘤干细胞，它们具有无限自我更新和产生异质性肿瘤细胞的能力，能促使肿瘤组织的形成和无限生长，对化疗和放疗具有很强的抗药性，是肿瘤发生发展、复发、转移及治疗耐受性的根本原因。目前临床抗肿瘤治疗，主要杀灭的是增殖肿瘤细胞，而不能清除肿瘤干细胞，由于肿瘤干细胞的无限自我更新和分裂，会迅速出现肿瘤的复发和转移，最终导致临床肿瘤治疗的失败。因此，根除肿瘤干细胞是治愈肿瘤的关键。以肿瘤干细胞为靶点的药物开发具有重要意义。

目前在许多人类恶性肿瘤中，人们证实了肿瘤干细胞的存在，如乳腺癌、脑肿瘤、宫颈癌、肝癌、肺癌、结（直）肠癌、前列腺癌、鼻咽癌等。肿瘤干细胞具有3个主要特点：无限自我更新能力、多向分化潜能和高致瘤性，近年来，研究者们报道了一些特异性靶向肿瘤干细胞的活性化合物，如中药青黛中活性成分靛玉红，中药藜芦中的甾体生物碱cyclopamine，小白菊中活性成分小白菊内酯，葡萄中的活性成分白藜芦醇，西兰花中的莱菔硫烷等。

桑枝叶为桑科桑属植物桑（Morus alba L.）的枝及叶子，其药用始载于《神农本草经》，具有疏风散热，益肝通气之功效。

发明内容

本发明的目的在于提供一种桑枝叶活性部位的制备方法及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种桑枝叶活性部位（SangA）的制备方法，包括如下步骤：

（1）桑枝叶粉碎后，以水或乙醇水溶液为提取溶媒，经浸泡、煎煮、渗漉、超声或回流方法进行提取，提取液浓缩后加入乙醇沉淀多糖、鞣质，收集滤液，进一步浓缩滤液得到桑枝叶浓缩液；

（2）选择非极性或弱极性大孔树脂对上述桑枝叶浓缩液进行分离纯化：将桑枝叶浓缩液上样到净化好的大孔树脂柱中，上样量以生药计与干树脂质量比为1：3～20，吸附平衡后，用水洗脱至无色，然后用20%～40%配比范围的乙醇水溶液洗脱至无色，再用50%～100%配比范围的乙醇水溶液洗脱至无色，收集该部分洗脱液，浓缩干燥，得到SangA粗提物；

（3）SangA粗提物进一步精制：用含乙腈的水溶液溶解SangA粗提物，上ODS柱分离，以35%～100%配比范围的乙腈水溶液洗脱，收集该部分洗脱液，浓缩干燥，获得SangA精制物；

以上“%”均指体积百分比。

作为优选的，所述提取溶媒的用量为桑枝叶体积的2～30倍。

作为优选的，步骤（1）所得到的桑枝叶浓缩液为0.2～20g生药/mL。

作为优选的，步骤（2）所述非极性大孔树脂为D101、HPD100、XAD-1、H-20等，弱极性大孔树脂为D101B、AB-8、CAD-40、D201、H-40、H-50或HPD100。

作为优选的，步骤（3）所述乙腈水溶液的浓度为35%～100%。

以上所述的方法制备得到的SangA粗提物和/或SangA精制物在制备抗肿瘤药物、保健食品或抗肿瘤功能性食品中的应用。

所述抗肿瘤药物、保健食品或抗肿瘤功能性食品中还含有药学上可接受的辅料或添加剂

所述辅料或添加剂为以下至少一种：蔗糖、乳糖、糊精、淀粉、β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、微晶纤维素、微粉硅胶、羟丙基纤维素、羧甲淀粉钠、交联聚维酮、交联聚乙烯吡咯烷酮、阿斯帕坦、甜菊苷、香精、甘露醇、山梨醇、硬脂酸、硬脂酸镁、丙烯酸树脂、半合成脂肪酸脂，凡士林、液状石蜡、吐温-20、吐温-80、卵磷脂、十二烷基硫酸钠、甘油、明胶、聚乙二醇、聚维酮等。

所述抗肿瘤药物、保健食品或抗肿瘤功能性食品可以是片剂、胶囊剂、口服液、注射剂、颗粒剂、丸剂、滴丸剂、泡腾剂、合剂、糖浆剂、缓释剂、控释剂或靶向制剂等。

所述肿瘤为各种肿瘤包括鼻咽癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、胃癌、大肠癌、卵巢癌等。

本发明的有益效果是：

由本发明方法制备得到的SangA，经紫外分光光度法测定总黄酮重量百分含量为30%-60%，重量为药材重量的0.5%-5%。经系统分离后收集的各个分离条带进行称重，并进行质谱及高效液相色谱电喷雾串联质谱分析，鉴定SangA的化学成分组成及化合物结构，发现SangA的主要成份组成为：桑辛素D、桑辛素E、桑辛素G重量百分含量约0.1%-7%；桑查耳酮B重量百分含量约0.1%-3% ；桑辛素P、桑辛素O重量百分含量约0.1%-4%；桑辛素A重量百分含量约0.1%-6%；桑辛素C、桑辛素S重量百分含量约0.1%-2%。

我们在研究中发现SangA在较低浓度下即能显著降低鼻咽癌、肺癌细胞中侧群细胞比例，说明SangA具有显著的抗肿瘤干细胞活性。通过无血清悬浮培养肿瘤细胞球技术，我们发现SangA能明显抑制肿瘤球的形成，形成的肿瘤球明显小于对照组，而且形成的肿瘤球数量也明显减少，再次证明了SangA具有显著的抗肿瘤干细胞活性。体内高致瘤能力是判断肿瘤干细胞的一个重要指标，我们通过荷瘤裸鼠模型，评价了SangA对肿瘤生长的抑制作用，发现SangA高、中剂量组能显著抑制肿瘤的生长，但对裸鼠的体重、活动状态等无影响，未表现出任何毒副作用。将对照组、SangA治疗组动物肿瘤剥离，制成活细胞悬液，再次接种在二代裸鼠皮下，发现经SangA治疗组需要的成瘤时间更长，肿瘤体积也更小。说明SangA在体内也具有显著抗肿瘤干细胞活性。通过体内外实验的研究，我们证明SangA具有显著的抗肿瘤干细胞的作用，可作为新的作用靶点药物在抗肿瘤治疗中发挥重大作用。

附图说明

图1：不同浓度SangA对鼻咽癌5-8F细胞增殖的影响；

图2：不同浓度SangA对鼻咽癌CNE2细胞增殖的影响；

图3：不同浓度SangA对宫颈癌Hela细胞增殖的影响；

图4：不同浓度SangA对肺癌A549细胞增殖的影响；

图5：SangA对CNE-2中SP细胞比例的影响；

图6：SangA对无血清悬浮培养鼻咽癌CNE-2细胞形成肿瘤球的影响；

图7：SangA对无血清悬浮培养鼻咽癌CNE-2细胞形成肿瘤球数量的影响；

图8：SangA不同剂量对荷鼻咽癌裸鼠肿瘤体积及体重的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。如无特殊说明，以下实施例中的“%”均指体积百分比。

实施例1

桑枝叶活性部位的制备方法，步骤如下：

（1）桑枝叶4kg，加20倍体积30%的乙醇水溶液，浸渍2h后，加热回流提取2次，每次1.5h，过滤，合并两次滤液，减压浓缩至原体积的1/10，加入75%乙醇至含醇量50%，静置过夜，过滤，滤液再加入95%乙醇至含醇量60%，静置过夜，过滤，减压浓缩至10g生药/mL。

（2）利用D101大孔树脂对桑枝叶浓缩液进行分离纯化。具体步骤为：取该桑枝叶浓缩液适量，加入到已净化好的大孔树脂柱中，上样量以生药计与干树脂质量比例为1：10，吸附平衡12h，用40%的乙醇水溶液洗脱至无色，然后用100%乙醇洗脱至无色，收集该部分洗脱液，减压浓缩干燥，得SangA粗提物约120g。

（3）将SangA粗提物用50%乙腈水溶液溶解，上ODS柱分离，然后用不同比例的乙腈水溶液进行梯度洗脱：先以35%的乙腈水溶液洗脱，收集第2-8个条带；然后以50%的乙腈水溶液洗脱，收集第1-7个条带；然后以70%乙腈水溶液洗脱，收集第1-3个条带；最后以100%乙腈洗脱，收集第3-6个条带，各条带分别减压浓缩、干燥，称重，并进行质谱以及高效液相色谱电喷雾串联质谱分析，推测化合物结构。

合并各条带洗脱液，经回收乙腈和真空减压干燥，获得精制的SangA约90g。经上述检测，SangA的化学成分表征如下（见表1）：桑辛素D、桑辛素E、桑辛素G重量百分含量约7%；桑查耳酮B重量百分含量约3% ；桑辛素P、桑辛素O重量百分含量约4%；桑辛素A重量百分含量约6%；桑辛素C、桑辛素S重量百分含量约2%。其余成分需要进一步鉴定。

表1 SangA化学成分的质谱表征

（4）SangA中总黄酮重量百分含量的测定：以芦丁为对照，比色法测定SangA中总黄酮含量。吸取一定量样品液于10ml容量瓶中，加入50%乙醇至5ml，加入5%亚硝酸钠溶液.4ml，放置6min，加入10%的Al（NO₃）₃ 0.4ml，放置6min，加入4%NaOH溶液4ml，用50%乙醇定容至刻度。上紫外分光光度计测定，不同批次SangA中总黄酮含量见表2。

表2 不同批次SangA中总黄酮含量

实施例2

桑枝叶活性部位的制备方法，步骤如下：

（1）桑枝叶4kg，加20倍体积80%乙醇水溶液，浸渍1h后，加热回流提取2次，每次1.5h，过滤，合并两次滤液，减压浓缩至10g生药/mL。

（2）利用HPD100大孔树脂对桑枝叶浓缩液进行分离纯化。具体步骤为：取该桑枝叶浓缩液适量，加入到已净化好的大孔树脂柱中，上样量以生药计与干树脂质量比例为1：5，吸附平衡12h，用50%的乙醇水溶液洗脱至无色，然后用100%乙醇水溶液洗脱至无色，收集该部分洗脱液，减压浓缩干燥，得SangA粗提物约100g。

（3）将SangA粗提物用50%乙腈水溶液溶解，上ODS柱分离，然后用不同比例的乙腈水溶液进行梯度洗脱：先以35%的乙腈水溶液洗脱，收集第2-8个条带；然后以50%的乙腈水溶液洗脱，收集第1-5个条带；然后以70%乙腈水溶液洗脱，收集第1-3个条带；最后以100%乙腈洗脱，收集第3-6个条带，各条带分别减压浓缩、干燥，称重，并进行质谱以及高效液相色谱电喷雾串联质谱分析，推测化合物结构。

合并各条带洗脱液，经回收乙腈和真空减压干燥，获得精制的SangA约90g。经上述检测，SangA的化学成分表征如下（见表3）：桑辛素D、桑辛素E、桑辛素G重量百分含量约7%；桑查耳酮B重量百分含量约2% ；桑辛素P、桑辛素O重量百分含量约4%；桑辛素A重量百分含量约6%；桑辛素C、桑辛素S重量百分含量约1%。其余成分需要进一步鉴定。

表3 SangA的化学成分表征

（4）SangA中总黄酮重量百分含量的测定：以芦丁为对照，比色法测定SangA中总黄酮含量。吸取一定量样品液于10ml容量瓶中，加入50%乙醇至5ml，加入5%亚硝酸钠溶液.4ml，放置6min，加入10%的Al（NO₃）₃ 0.4ml，放置6min，加入4%NaOH溶液4ml，用50%乙醇定容至刻度。上紫外分光光度计测定，不同批次SangA中总黄酮含量见表4。

表4不同批次SangA中总黄酮含量

实施例3

桑枝叶活性部位的制备方法，步骤如下：

（1）桑枝叶4kg，加15倍体积水溶液，浸渍1h后，加热回流提取2次，每次1.5h，过滤，合并两次滤液，减压浓缩至原体积的1/10，加入75%乙醇至含醇量50%，静置过夜，过滤，滤液再加入95%乙醇至含醇量80%，静置过夜，过滤，减压浓缩至20g生药/mL。

（2）利用H-40大孔树脂对桑枝叶浓缩液进行分离纯化。具体步骤为：取该桑枝叶浓缩液适量，加入到已净化好的大孔树脂柱中，上样量以生药计与干树脂质量比为1：8，吸附平衡12h，用50%的乙醇水溶液洗脱至无色，然后用100%乙醇水溶液洗脱至无色，收集该部分洗脱液，减压浓缩干燥，得SangA粗提物约80g。

（3）将SangA粗提物用35%乙腈水溶液溶解，上ODS柱分离，然后用不同比例的乙腈水溶液进行梯度洗脱：先以35%的乙腈水溶液洗脱，收集第2-8个条带；然后以50%的乙腈水溶液洗脱，收集第1-5个条带；然后以70%乙腈水溶液洗脱，收集第1-3个条带；最后以100%乙腈洗脱，收集第2-8个条带，各条带分别减压浓缩、干燥，称重，并进行质谱以及高效液相色谱电喷雾串联质谱分析，推测化合物结构。

合并各条带洗脱液，经回收乙腈和真空减压干燥，获得精制的SangA约70g。经上述检测，SangA的化学成分表征如下（见表5）：桑辛素D、桑辛素E、桑辛素G重量百分含量约5%；桑查耳酮B重量百分含量约2% ；桑辛素P、桑辛素O重量百分含量约2%；桑辛素A重量百分含量约4%；桑辛素C、桑辛素S重量百分含量约1%。其余成分需要进一步鉴定。

表5 SangA的化学成分表征

（4）SangA中总黄酮重量百分含量的测定：以芦丁为对照，比色法测定SangA中总黄酮含量。吸取一定量样品液于10ml容量瓶中，加入50%乙醇至5ml，加入5%亚硝酸钠溶液.4ml，放置6min，加入10%的Al（NO₃）₃ 0.4ml，放置6min，加入4%NaOH溶液4ml，用50%乙醇定容至刻度。上紫外分光光度计测定，不同批次SangA中总黄酮含量见表6。

表6 不同批次SangA中总黄酮含量

下面将以实施例1制备得到的SangA进行肿瘤细胞抑制试验和荷瘤裸鼠模型试验，以验证SangA的抗肿瘤活性。

实施例4SangA对人宫颈癌Hela细胞、鼻咽癌CNE-2细胞、鼻咽癌5-8F细胞、肺癌A549细胞的毒性评价

各肿瘤细胞常规传代培养，待长满后用胰酶消化，用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液制成细胞悬液，以8×10⁵个/mL的细胞密度，加入96孔板中，每孔200μl，37℃，5%CO₂孵箱中培养24h，待细胞长成单层。吸出培养液，加入各浓度SangA溶液200μl，每个浓度8个复孔。正常对照只加入等体积2%的维持液。37℃，5%CO₂孵箱中培养，72h后，将药液吸出，每孔加入5mg/mLMTT（用PBS配制）200μl，37℃，5%CO₂孵箱中孵育2h后，弃上清，每孔加入DMSO200μl，室温下振荡混匀10min，在490nm下，酶联免疫检测仪测定吸光度值。并以下公式计算细胞存活率。

细胞存活率=药物组平均吸光度值×100%

细胞正常对照组吸光度值

研究表明SangA表现出一定的细胞毒性，不同浓度的SangA（以生药浓度计）对体外培养的宫颈癌Hela细胞、鼻咽癌CNE-2细胞、鼻咽癌5-8F细胞、肺癌A549细胞均具有不同程度的抑制作用（图1-图4），IC₅₀值分别1.443mg/ml,3.8mg/ml,1.235mg/ml,1.646mg/ml（以生药含量计）。在倒置显微镜下观察，正常对照组细胞贴壁生长良好，呈多边形，折光性好，给药组细胞出现细胞病变，表现为细胞粘连、壁厚、变圆、破碎、脱落, 并且吸光值明显下降。

实施例5SangA对人鼻咽癌细胞CNE-2中侧群（SP）细胞的影响

我们研究了SangA对人鼻咽癌细胞CNE-2细胞中SP细胞的影响，SP细胞富集了肿瘤干细胞，具有干细胞特征，我们发现SangA对体外培养的CNE-2细胞具有一定毒性（图1-图4），IC₅₀=3.8mg/mL（以生药计），而SangA浓度为0.1mg/mL（以生药计）时，SP细胞比例就降至0.3%，表明SP细胞对SangA较普通增殖肿瘤细胞更为敏感，当SangA浓度为0.2mg/mL（以生药计）时，SP细胞比例降至0.1%，呈现出量效关系，对照组SP细胞比例为0.9%，阳性对照组（维拉帕米组）为0.1%（图5）。表明SangA具有抑制鼻咽癌肿瘤干细胞的作用。

具体实验方法为取对数期生长的CNE-2细胞，分别用不同浓度SangA处理24h后 ，胰酶消化贴壁培养的肿瘤细胞，离心后用PBS 清洗，37℃预热的含2%小牛血清的改良型RPIM-1640培基重悬，再用Hoechst33342染色剂以5µg/ml 的终浓度标记，将标记的细胞在37℃孵育90min，避光，每隔10min 混匀一次，之后4℃，3000rpm离心2min，预冷的PBS 洗涤，重悬，检测前加入1µl Propidium iodide标记死细胞，采用流式细胞仪检测，激发波长350nm ，检测波长675nm 。考察药物对鼻咽癌CNE-2细胞SP细胞比例的影响。

实施例6 SangA对鼻咽癌CNE2细胞形成肿瘤球的影响

无血清悬浮培养肿瘤细胞球（tumorspheres）富集了肿瘤干细胞，并反映了肿瘤干细胞自我更新的关键特征，是肿瘤干细胞研究的重要技术之一，我们研究了不同浓度SangA对鼻咽癌CNE-2细胞形成tumorspheres能力的影响。发现SangA能显著抑制肿瘤球的形成，其形成的肿瘤球数量及大小均明显小于对照组（p<0.001）。阳性对照药顺铂对肿瘤球的大小无明显影响（p>0.05）（图6），但能显著减少肿瘤球数量（p<0.001）（图7）。表明SangA具有抑制CSCs的活性。

具体实验方法为CNE-2细胞培养于无血清培养基中，设DMSO组（溶剂对照组）、空白对照组、阳性药物顺铂1μg/ml、顺铂2μg/ml、 SangA 0.6mg/ml、SangA 0.3mg/ml组，生长7d后，观察肿瘤球数目及大小。

实施例7 SangA对荷鼻咽癌裸鼠的药效研究

我们建立了荷鼻咽癌裸鼠模型（皮下成瘤），待模型动物肿瘤长至100mm³时，将模型动物分为空白对照组、阳性药物组（顺铂组）、SangA高、中、低剂量组（生药浓度10g/ml，5g/ml，2.5g/ml）每组8只动物。分别给药治疗，观察肿瘤生长情况。模型对照组在治疗后第4天，体重稍有增加，达到初始体重的107%左右，稍后体重开始降低，在治疗末期，逐渐趋于平稳，为初始体重的96%左右；SangA高、中、低剂量组体重趋势与对照组基本相似，与对照组无显著性差异（P=0.998，0.956，1.000＞0.05），说明SangA高、中、低剂量对荷鼻咽癌裸鼠的体重无明显影响，无明显毒副作用。顺铂组在开始治疗后，与对照组相比，裸鼠体重开始显著下降，在治疗末期，体重下降为初始体重的75%左右，与对照组有显著性差异（P=0.017＜0.05），说明顺铂显著降低裸鼠的体重，表现出一定的毒副作用。

在实验观察期内，根据肿瘤生长曲线，可见随着时间的延长，各组肿瘤体积都呈逐步增大趋势，与对照组相比，顺铂组（P=0.011＜0.05） ，SangA高、中剂量组（P=0.036，0.041＜0.05）能抑制肿瘤的生长，SangA低剂量组与对照组无显著性差异（P=0.068＞0.05）。说明SangA在一定剂量下能显著抑制肿瘤的生长，具有一定的抗肿瘤活性。各组肿瘤相对增殖率见表7。结果表明SangA高、中剂量组能显著抑制肿瘤生长（p<0.01），与对照组相比，对裸鼠体重无明显影响（p>0.05），说明SangA具有体内抑制肿瘤生长的活性，并且毒性很小（图8）。

表7各组相对肿瘤增殖率

具体实验方法为：取对数生长期的CNE-2细胞，分别于裸鼠皮下接种 3×10⁶个细胞，细胞接种 2周后（皮下肿瘤基本长至100mm³左右），随机分为五组，即模型对照组、顺铂组、SangA高、中、低剂量组，每组8 只裸鼠，模型对照组给予蒸馏水(200ul/只，灌胃 ，每天一次)，顺铂组(5mg/kg ，腹腔注射，每周一次) ，SangA高浓度（10g/ml，200ul/只，灌胃，每天一次），SangA中浓度（5g/ml，200ul/只，灌胃，每天一次），SangA低浓度（2.5g/ml，200ul/只，灌胃，每天一次），连续给药33天，观察肿瘤生长情况如下：

开始给药治疗后，每周2次称量各组裸鼠体重，及用游标卡尺测量肿瘤大小，根据公式 V=1/2ab²（V为肿瘤体积，a为长径，b为短径）计算肿瘤体积，绘制体重-时间变化曲线及肿瘤生长曲线。

实施例8 SangA对荷鼻咽癌裸鼠生存期的影响

各组从给药治疗之日起算，观察生存周期，共观察80天。如表8所示，在观察期末，对照组裸鼠生存率为42.9%，顺铂组裸鼠生存率为57.1%，SangA高、低剂量组裸鼠生存率为85.7%，中剂量组为57.1%。对照组平均生存期为62.0天，中位生存期为57.0天；顺铂组平均生存期为59.7天，中位生存期>80天。SangA高、中、低剂量组平均生存期分别为78.4天、76天、75.8天，中位生存期均>80天。结果表明SangA对荷鼻咽癌裸鼠的生存期有一定的延长作用。

表8 SangA不同剂量对荷鼻咽癌裸鼠生存率的影响

以上实施例表明，本发明制备的桑枝叶提取物SangA对肿瘤干细胞表现出显著抑制作用，是制备抗肿瘤药物的理想成分。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

Claims (10)

1.一种桑枝叶活性部位，其特征在于，所述桑枝叶活性部位的制备方法，包括如下步骤：

(1)桑枝叶粉碎后，以水或乙醇水溶液为提取溶媒，经浸泡、煎煮、渗漉、超声或回流方法进行提取，提取液浓缩后加入乙醇沉淀多糖、鞣质，收集滤液，进一步浓缩滤液得到桑枝叶浓缩液；

(2)选择非极性或弱极性大孔树脂对上述桑枝叶浓缩液进行分离纯化：将桑枝叶浓缩液上样到净化好的大孔树脂柱中，上样量以生药计与干树脂质量比为1：3～20，吸附平衡后，用水洗脱至无色，然后用20％～40％配比范围的乙醇水溶液洗脱至无色，再用50％～100％配比范围的乙醇水溶液洗脱至无色，收集该部分洗脱液，浓缩干燥，得到桑枝叶活性部位粗提物；

(3)桑枝叶活性部位粗提物进一步精制：用含乙腈的水溶液溶解桑枝叶活性部位粗提物，上ODS柱分离，以35％～100％配比范围的乙腈水溶液洗脱，收集该部分洗脱液，浓缩干燥，获得桑枝叶活性部位精制物；

以上“％”均指体积百分比。

2.根据权利要求1所述的桑枝叶活性部位，其特征在于，所述提取溶媒的用量为桑枝叶体积的2～30倍。

3.根据权利要求1所述的桑枝叶活性部位，其特征在于，步骤(1)所得到的桑枝叶浓缩液为0.2～20g生药/mL。

4.根据权利要求1所述的桑枝叶活性部位，其特征在于，步骤(2)所述非极性大孔树脂为D101、HPD100、XAD-1、H-20，弱极性大孔树脂为D101B、AB-8、CAD-40、D201、H-40、H-50或HPD100。

5.根据权利要求1所述的桑枝叶活性部位，其特征在于，步骤(3)所述乙腈水溶液的浓度为35％～100％。

6.权利要求1～5任一项所述的桑枝叶活性部位在制备抗肿瘤药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物中还含有药学上可接受的辅料或添加剂。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述辅料或添加剂为以下至少一种：蔗糖、乳糖、糊精、淀粉、β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、微晶纤维素、微粉硅胶、羟丙基纤维素、羧甲淀粉钠、交联聚维酮、交联聚乙烯吡咯烷酮、阿斯帕坦、甜菊苷、香精、甘露醇、山梨醇、硬脂酸、硬脂酸镁、丙烯酸树脂、半合成脂肪酸脂，凡士林、液状石蜡、吐温-20、吐温-80、卵磷脂、十二烷基硫酸钠、甘油、明胶、聚乙二醇、聚维酮。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物是片剂、胶囊剂、口服液、注射剂、颗粒剂、丸剂、滴丸剂、泡腾剂、合剂、糖浆剂、缓释剂、控释剂或靶向制剂。

10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为鼻咽癌、肺癌或宫颈癌。

Images