CN109867649B

CN109867649B - 一种双黄酮类化合物及其制备方法与应用

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Publication number: CN109867649B
Application number: CN201810098902.1A
Authority: CN
Inventors: 曾小斌; 葛兰兰; 李华英; 朱富强; 李洁媚; 万浩强; 周伯平; 吴诗品
Original assignee: Shenzhen Bainuo Kantai Biotechnology Co ltd; Shenzhen Peoples Hospital
Current assignee: Shenzhen Bainuo Kantai Biotechnology Co ltd; Shenzhen Peoples Hospital
Priority date: 2018-01-31
Filing date: 2018-01-31
Publication date: 2022-08-23
Anticipated expiration: 2038-01-31
Also published as: CN109867649A

Abstract

本发明提供了一种双黄酮类化合物，其具有以下结构式：

本发明还提供了该双黄酮类化合物的制备方法，还涉及包含该双黄酮类化合物的药物制剂，以及该双黄酮类化合物在制备治疗肝癌药物、保肝护肝药物中的应用。(5,7,8,4’‑四羟基黄酮)‑3’‑4‑(5,7‑二羟基黄酮)作为一种天然小分子化合物，对正常细胞毒性较低，副作用较小；所述双黄酮类化合物除了具有很好的保肝护肝作用外，还表现出显著的抗肝癌作用，能够为肝癌患者提供新的治疗药物及治疗途径，所述双黄酮类化合物具有有效剂量适中，疗效显著，毒副作用小等优点，因此，具有广阔的应用前景。

Description

一种双黄酮类化合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于药物化学技术领域，特别涉及一种双黄酮类化合物，并涉及该双黄酮类化合物的制备方法，还涉及包含该双黄酮类化合物的药物制剂，以及该双黄酮类化合物在制备治疗肝癌药物、保肝护肝药物中的应用。

背景技术

肝脏是人体内以代谢功能为主的一个重要器官，并在身体里面起着去氧化、储存肝糖、分泌性蛋白质的合成等作用。肝脏对来自体内和体外的许多非营养性物质如各种药物、毒物以及体内某些代谢产物，具有生物转化作用，通过新陈代谢将它们彻底分解或以原形排出体外，这种作用也被称作“解毒功能”。可见，肝脏是最主要的药物代谢器官。

众所周知，肝病一直以来都是危害人类健康的重大疾病。日常生活中，许多疾病的治疗药(如抗结核药)都会带来肝损，甚至用药物防治肝病的同时往往也会造成肝脏的再度损伤，导致转氨酶等肝功能异常、肝组织病变，并伴有肝脏脂肪堆积、肝纤维化，最终转变为不可逆转的肝硬化。在亚洲，肝纤维化和肝硬化都是常见的慢性肝病，90％的肝硬化可转化为肝癌；而肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一种原发于肝细胞的恶性肿瘤，其平均生存时间为6-16个月，严重危害人类生命健康。据统计，全世界每年约有78.2万人罹患肝癌，位列癌症疾病中男性发病率和女性发病率的第5位和第7位，死亡率则分别高居第2位和第6位。在我国，HCC也是常见高发的恶性肿瘤之一，数据显示，我国肝癌患者数约占全球总患者数的50％，排在肿瘤发病率的第二位。肝癌大多数是由乙型肝炎或丙型肝炎发展而来，在这个过程中还伴有肝纤维化和肝硬化。如何有效预防和治疗高发性的肝癌以及伴随的肝并发症已经成为各国政府及相关医疗机构都需共同承担和亟需解决的重大难题。

目前，手术切除被认为是早期肝细胞癌的最佳治疗方案，但很多患者被确诊时已经处于晚期阶段，而且术后复发率高、肝功能损伤大，因此化学治疗是大多数肝癌患者的首选治疗方案。然而，在过去的几十年中，传统的化学治疗方法并没有显著延长肝癌患者的总体生存期，其五年生存率仅为7％，其主要原因归结为：大多数化疗药物存在急性(短期)毒性、慢性(长期)毒性及肝细胞癌对多数化疗药物具有天然的或获得性的耐药。近些年，抗肿瘤新药的研发开始从非特异性免疫疗法转向肿瘤的靶向治疗，如索拉菲尼(商品名多吉美)的问世，这是目前FDA唯一批准的多激酶抑制剂。可惜的是，索拉菲尼的使用仅延长患者三个月的生存期。与化学药物不同，天然药物具有天然无毒、调节免疫、多靶点的特性，在肝癌的治疗中占有越来越重要的地位。因此，从天然产物中寻找开发新型靶点疗效高且毒性低的化疗药物是临床上治疗肝癌及其并发症的研发方向之一。

金银花(Flos Lonicerae Japonicae)是忍冬科忍冬属植物忍冬(Lonicerajaponica Thunb.)的干燥花蕾或带初开的花，其可入药，首载于《名医别录》；并且，金银花在日常生活中还可用于食疗，如人们经常饮用的金银花茶等。现代化学成分研究表明，金银花含有丰富的黄酮类化合物，而某些黄酮类化合物能够对多种肿瘤有明显的抗增殖作用，且已发现一些黄酮类化合物是潜在的Nrf-2抑制剂。特别是，发明人前期对大量古方的梳理研究发现，金银花在古代就有用于治疗肝癌的先例，如奇灵膏古方。

发明内容

本发明旨在从金银花中提取有效的活性化合物，以提供一种全新的天然化合物，该天然化合物为一种双黄酮类化合物；发明人通过一系列实验发现该双黄酮类化合物除了具有很好的保肝护肝作用外，还表现出显著的抗肝癌作用，并且该双黄酮类化合物具有高效、低毒的优点，今后可成为市场上新的保肝护肝和抗肝癌药物。

具体地，本发明第一方面提供了一种双黄酮类化合物，其具有以下结构式(I)：

其中，该化合物的结构经检测确定为(5,7,8,4’-四羟基黄酮)-3’-4-(5,7-二羟基黄酮)。

本发明第二方面提供了第一方面所述的双黄酮类化合物的制备方法，包括以下步骤：

S1：在室温下，用75％乙醇对金银花进行多次冷浸、渗漉提取，合并提取液，接着，减压回收溶剂，并浓缩得乙醇浸膏；

S2：将所述乙醇浸膏混悬于水，然后分别用环己烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，以分别制得环己烷浸膏LJH，乙酸乙酯浸膏LJE，正丁醇浸膏LJB；

S3：将所述乙酸乙酯浸膏LJE用氯仿和甲醇溶解，用柱层析硅胶进行拌样后，装柱，上样，再依次用二氯甲烷、体积比为100：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为50：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为25：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为15：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为5：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为2：1的二氯甲烷-甲醇、甲醇实施梯度洗脱；采用TLC分析，合并相同流分后获得20个组分LJE1～LJE20；

S4：取组分LJE13，用二氯甲烷和甲醇溶解，并进行Sephadex LH-20(23×750mm)柱层析，其中使用的洗脱剂为二氯甲烷-甲醇；采用TLC分析，合并相同流分后获得8个组分LJE13-1～LJE13-8；

S5：取组分LJE13-6，用甲醇溶解，重结晶后即得所述双黄酮类化合物。

优选地，在上述制备方法中，所述柱层析硅胶为100～200目的柱层析硅胶。

优选地，在上述制备方法中，所述洗脱剂为体积比10：1的二氯甲烷-甲醇。

本发明第三方面提供了一种药物制剂，其包含第一方面所述的双黄酮类化合物。

本发明第四方面提供了第一方面所述的双黄酮类化合物在制备治疗肝癌药物中的应用。

本发明第五方面提供了第一方面所述的双黄酮类化合物在制备保肝护肝药物中的应用。

总之，本发明所述的双黄酮类化合物，即(5,7,8,4’-四羟基黄酮)-3’-4-(5,7-二羟基黄酮)，具有以下有益效果：

(5,7,8,4’-四羟基黄酮)-3’-4-(5,7-二羟基黄酮)作为一种天然小分子化合物，对正常细胞毒性较低，副作用较小；所述双黄酮类化合物除了具有很好的保肝护肝作用外，还表现出显著的抗肝癌作用，能够为肝癌患者提供新的治疗药物及治疗途径，所述双黄酮类化合物具有有效剂量适中，疗效显著，毒副作用小等优点，因此，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为(5,7,8,4’-四羟基黄酮)-3’-4-(5,7-二羟基黄酮)的核磁共振¹H NMR图；

图2为(5,7,8,4’-四羟基黄酮)-3’-4-(5,7-二羟基黄酮)的核磁共振¹³C NMR图；

图3为(5,7,8,4’-四羟基黄酮)-3’-4-(5,7-二羟基黄酮)的二维核磁共振¹H-¹HCOSY图；

图4为(5,7,8,4’-四羟基黄酮)-3’-4-(5,7-二羟基黄酮)的DEPT谱图；

图5为(5,7,8,4’-四羟基黄酮)-3’-4-(5,7-二羟基黄酮)的HMQC谱图；

图6为(5,7,8,4’-四羟基黄酮)-3’-4-(5,7-二羟基黄酮)的HMBC谱图；

图7为(5,7,8,4’-四羟基黄酮)-3’-4-(5,7-二羟基黄酮)的NOESY谱图；

图8示出了(5,7,8,4’-四羟基黄酮)-3’-4-(5,7-二羟基黄酮)对肝癌细胞在裸鼠皮下成瘤能力的影响；其中，图8(A)示出了模型组和药物组小鼠体重变化曲线；图8(B)示出了模型组和药物组小鼠体内成瘤大小变化的照片；图8(C)示出了模型组和药物组小鼠的心、肝、脾、肺、肾的变化；图8(D)示出了模型组和药物组小鼠肝癌组织的病理切片；

图9为细胞存活率柱状图，示出了(5,7,8,4’-四羟基黄酮)-3’-4-(5,7-二羟基黄酮)(即本发明化合物)对肝细胞氧化损伤的保护作用。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施方式。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从公开商业途径获得。

根据本发明所述的双黄酮类化合物，其具有以下结构式(I)：

在本发明的一个优选实施方式中，所述双黄酮类化合物(即(5,7,8,4’-四羟基黄酮)-3’-4-(5,7-二羟基黄酮))可由以下方法制备：

在室温下，用75％乙醇对6.5kg金银花进行多次冷浸、渗漉提取，合并提取液，接着，减压回收溶剂，并浓缩得乙醇浸膏1500g；将所述乙醇浸膏混悬于水，然后分别用环己烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，以分别制得130.3g环己烷浸膏LJH，93.7g乙酸乙酯浸膏LJE，199.8g正丁醇浸膏LJB；取83.0g所述乙酸乙酯浸膏LJE，用氯仿和甲醇溶解，用柱层析硅胶(100-200目)进行拌样后，用二氯甲烷溶解该硅胶装柱，并用二氯甲烷平衡柱子至硅胶面不再下降，干法上样，再依次用二氯甲烷、体积比为100：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为50：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为25：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为15：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为5：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为2：1的二氯甲烷-甲醇、甲醇实施梯度洗脱；采用TLC分析，合并相同流分后获得20个组分LJE1～LJE20；然后，取5.50g组分LJE13(由二氯甲烷-甲醇15：1洗脱得到)，用二氯甲烷和甲醇溶解，并进行Sephadex LH-20(23×750mm)柱层析，其中使用的洗脱剂为二氯甲烷-甲醇(10：1)，等度洗脱；采用TLC分析，合并相同流分后获得8个组分LJE13-1～LJE13-8；最后，取组分LJE13-6，用甲醇溶解，重结晶后即得所述双黄酮类化合物。

当然，本发明所述的双黄酮类化合物还可由其它提取工艺或化学合成方法制得。

实施例1(5,7,8,4’-四羟基黄酮)-3’-4-(5,7-二羟基黄酮)的表征

本发明所提供的新的双黄酮类化合物为黄色针状结晶，ESI-MS(Positive)给出准分子离子峰m/z561[M+Na]⁺，以及HR-ESI MS(Negative)给出准分子离子峰m/z 537.0628[M-H]^-，提示其分子量为538；结合¹H和¹³C NMR确定其分子式为C₃₀H₁₈O₁₀，计算不饱和度为22。

参见图1～7，该双黄酮类化合物的氢谱和碳谱提示其含有2个羟基，1个五元取代A环，1个四元取代A’环，1个1,3,4-三取代B环和1,4-二取代B’环。把A和B环当作整体I，A’和B’环当作整体II。在NOESY谱中，本发明化合物H-3(δ_H 6.85)与H-2’和6’相关及H-3’(δ_H6.81)与H-2”和6”相关，同时本相关进一步在HMBC谱δ_H 6.85(1H,H-3,I)相关δ_C 163.78(C-2),182.02(C-4),103.64(C-10)和120.77(C-1’)及δ_H 6.81(1H,H-3”,II)相关δ_C 163.59(C-2”),181.64(C-4”),103.50(C-10”)和120.06(C-1”’)确证本发明化合物为一双黄酮结构。在氢谱中，δ_H 8.04(1H,s)、8.03(1H,dd,J＝2.0,8.0Hz)、7.16(1H,d,J＝8.0Hz)证实整体I中存在ABX系统的B环，δ_H 7.60(2H,d,J＝8.8Hz)、6.73(2H,d,J＝8.8Hz)证实整体II中存在A₂B₂系统的B’环。同时，在氢谱中，δ_H 6.48(1H,d,J＝2.0Hz)和6.21(1H,d,J＝2.0Hz)分别归属于A’环上H-8”和6”的氢(整体II)；芳香环上的氢δH 6.41(1H,s)在HMBC谱上与δC 159.68(C-8)和103.64(C-10)最终归属在整体I的6位氢。本发明化合物含有2个羰基碳、6个直接连在羟基上的碳和4个连在吡喃酮氧上的碳，这表明两个黄酮整体连接可能方式为4’(B)-4”’(B’)或3’(B)-4”’(B’)。同时，通过HMBC谱确定本发明化合物两个整体I和II以3’(B)-4”’(B’)连接，由H-2’(δ_H 8.04)和C-4’(δ_C 160.47),H-6’(δ_H 8.03)和C-4’(δ_C 160.47),H-5’(δ_H 7.16)和C-3’(δ_C 121.37)，H-2’(δ_H 8.04)和C-4”’(δ_C104.03)及H-3”’/5”’(δ_H 6.73)和C-3’(δ_C 121.37)相关确证推出；因此，该双黄酮类化合物的结构被确定为(5,7,8,4’-四羟基黄酮)-3’-4-(5,7-二羟基黄酮)。

具体地，化合物(5,7,8,4’-四羟基黄酮)-3’-4-(5,7-二羟基黄酮)的核磁数据如下表1所示(参见图1和2)：

表1本发明化合物在的DMSO-d₆中的¹H NMR(400MHz)和¹³C NMR(100MHz)数据

实施例2从金银花中提取(5,7,8,4’-四羟基黄酮)-3’-4-(5,7-二羟基黄酮)

在室温下，用75％乙醇对6.5kg金银花(晾干的)进行3次冷浸、渗漉提取，合并提取液，接着，在55℃下减压回收溶剂，并浓缩得乙醇浸膏1500g；将所述乙醇浸膏混悬于3.5L水中，然后分别用等体积的环己烷、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取三次，分别收集各萃取液并浓缩，分别制得130.3g环己烷浸膏LJH，93.7g乙酸乙酯浸膏LJE，199.8g正丁醇浸膏LJB；取83.0g所述乙酸乙酯浸膏LJE，用氯仿和甲醇溶解，称取120g柱层析硅胶(100-200目)进行拌样，另称取1500g柱层析硅胶(100-200目)，用二氯甲烷溶解该硅胶并装柱，并用二氯甲烷平衡柱子至硅胶面不再下降，干法上样，其中该硅胶柱的规格为10×120cm；再依次用二氯甲烷(50L)、体积比为100：1的二氯甲烷-甲醇(50L)、体积比为50：1的二氯甲烷-甲醇(50L)、体积比为25：1的二氯甲烷-甲醇(50L)、体积比为15：1的二氯甲烷-甲醇(50L)、体积比为5：1的二氯甲烷-甲醇(50L)、体积比为2：1的二氯甲烷-甲醇(50L)、甲醇(10L)实施梯度洗脱，控制流速为1300mL/h，接取各流分；采用TLC分析，合并相同流分后获得20个组分LJE1～LJE20；然后，取5.50g组分LJE13(由二氯甲烷-甲醇15：1洗脱得到)，用二氯甲烷和甲醇溶解，并进行Sephadex LH-20(23×750mm)柱层析，使用的洗脱剂为2000mL二氯甲烷-甲醇(10：1)，等度洗脱，流速为3mL/min，每接5mL为一个流分；采用TLC分析，合并相同流分后获得8个组分LJE13-1～LJE13-8；最后，取组分LJE13-6，用甲醇溶解，重结晶后即得(5,7,8,4’-四羟基黄酮)-3’-4-(5,7-二羟基黄酮)。

实施例3(5,7,8,4’-四羟基黄酮)-3’-4-(5,7-二羟基黄酮)的体外抑瘤活性实验

发明人实施了化合物(5,7,8,4’-四羟基黄酮)-3’-4-(5,7-二羟基黄酮)的体外抑瘤活性实验，其中，瘤株为肝癌SMCC 7721细胞。

MTT法：将SMCC 7721细胞接种于96孔细胞培养板，每孔200μL(含有2.5×10⁴个肿瘤细胞)，在37℃、5％CO₂培养箱中，并且在含10％FBS的RPMI1640培养基中，培养24h，加入不同浓度(100、50、25、12.5和6.25)的本发明化合物，继续培养48h；实验结束前4h加20μL的MTT(5mg/mL)，继续在37℃、5％CO₂条件下孵育4h，吸取培养液后加入二甲基亚砜150μL，振摇至结晶完全溶解，然后于酶标仪检测其吸光度，检测波长570nm，参考波长630nm，计算本发明化合物对SMCC 7721细胞的抑制率，实验结果如下表2所示，其中以黄酮Quercetin(槲皮素)为阳性对照。

表2本发明化合物对肝癌细胞SMCC 7721和人胚肝细胞LO-2的抑制作用(n＝6)

其中，实验结果为均值±SD(n＝6)。

可见，化合物(5,7,8,4’-四羟基黄酮)-3’-4-(5,7-二羟基黄酮)对肝癌细胞的抑制作用明显优于黄酮Quercetin(槲皮素)。

实施例4(5,7,8,4’-四羟基黄酮)-3’-4-(5,7-二羟基黄酮)对裸鼠体内肝癌生长的抑制作用

将14只6周龄SPF级BALB/c-nu/nu雌鼠(广东省医学实验动物中心产品)的每只鼠左腹侧皮下注射5×10⁶个SMMC-7721细胞，得到肝癌裸鼠。待肿瘤大小长至约100mm³大小时将14只上述肝癌裸鼠随机分为两组，一组为对照组(Vehicle)，一组为本发明化合物处理的治疗组，每组7只裸鼠。将本发明化合物溶于橄榄油中，给药剂量为每千克体重25mg本发明化合物，给药体积为100μL，对照组(Vehicle)每只腹腔给药等体积的载体，每两天给药一次，共给药5次。以第一次给药时刻为第0天，于第0、2、4、6、10天测量肿瘤体积及裸鼠的体重，第10天测量肿瘤体积及裸鼠的体重后将裸鼠处死，将肿瘤组织取下来拍照，结果如图8所示。

实验结果表明，实验期间小鼠体重稳定，如图8(A)所示，给药期间并未观察到有明显的毒副作用，也无小鼠死亡。实验结束后，处死小鼠，将肿瘤组织取下来拍照(见图8(B))，收集肿瘤组织及心、肝、脾、肺、肾进行病理检查，结果如图8(C)/(D)所示。本实施例的实验结果表明，本发明化合物能够有效抑制裸鼠体内肿瘤组织生长。

实施例5抑制H₂O₂所致SMCC 7721肝细胞凋亡实验

采用MTT法检测SMCC 7721肝细胞凋亡。取体外培养的SMCC 7721肝细胞，制备单细胞悬液过程同实施例3，按1.0×10⁵个/mL密度接种至96孔板,100μL/孔；置于37℃、5％CO₂培养箱中培养24h后，实验组分别加入最终浓度100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL的本发明化合物((5,7,8,4’-四羟基黄酮)-3’-4-(5,7-二羟基黄酮))溶液，对照组则加入等体积溶剂，每组5孔，重复3次，预培养4h，接着加入80mM的H₂O₂继续培养3h后，通过MTT法测定OD值。实验结果如图9所示，其中以黄酮Quercetin(槲皮素)为阳性对照，通过分析可知，本发明化合物在浓度(25-100μg/mL)对H₂O₂造成的氧化损伤具有不同程度的保护活性，且其保护活性明显优于黄酮Quercetin(槲皮素)。

实施例6(5,7,8,4’-四羟基黄酮)-3’-4-(5,7-二羟基黄酮)对肝细胞氧化损伤的保护作用

将SMCC 7721细胞培养24h，待细胞贴壁后，先加入不同浓度的本发明化合物预培养4h，接着加入80mM的H₂O₂继续培养3h后，收集细胞，测定本发明化合物对SMCC 7721细胞生长中CAT、SOD含量的变化。具体过程见过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒和超氧化物歧化酶(SOD)测试盒使用说明书，试剂盒购自南京建成科技有限公司(南京，中国)。

实验结果如下表3所示：

表3不同浓度的本发明化合物对H₂O₂造成的损伤的保护活性

实验结果为均值±SD(n＝6)；符号代表显著性差异：^#p<0.05，与空白组相比；^###p<0.001，与空白组相比；*p<0.05，与模型组(UV组)对比；***p<0.001，与模型组(UV组)对比。

通过分析可知，仅用H₂O₂培养3h的模型组细胞CAT和SOD活力都发生了显著降低，说明H₂O₂对细胞造成了显著的氧化损伤危害；而加入本发明化合物预培养的各组细胞CAT和SOD活力较模型组都有了显著提高，证明本发明化合物能够提高肝细胞对氧化损伤的保护活性。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims

1.一种双黄酮类化合物，其特征在于，具有以下结构式(I)：

2.一种根据权利要求1所述的双黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S4：取组分LJE13，用二氯甲烷和甲醇溶解，并进行规格为23×750mm的Sephadex LH-20柱层析，其中使用的洗脱剂为二氯甲烷-甲醇；采用TLC分析，合并相同流分后获得8个组分LJE13-1～LJE13-8；

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述柱层析硅胶为100～200目的柱层析硅胶。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述洗脱剂为体积比10：1的二氯甲烷-甲醇。

5.一种药物制剂，其特征在于，包含根据权利要求1所述的双黄酮类化合物。

6.根据权利要求1所述的双黄酮类化合物在制备治疗肝癌药物中的应用。

7.根据权利要求1所述的双黄酮类化合物在制备保肝护肝药物中的应用。