CN111675618B - 一种有柄石韦中的化合物及其分离纯化方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种有柄石韦中的化合物及其分离纯化方法和应用，所述化合物分别为：坝巴酸、山奈酚、绿原酸甲酯、Petiolide A(1)，本发明在采用现代提取分离技术对有柄石韦化学成分进行深入的系统研究，并结合代谢组学、药物辅助设计及药效跟踪筛选，初步明确了石韦利尿通淋的物质基础，为开发“利尿、通淋”药物奠定了基础。

Description

一种有柄石韦中的化合物及其分离纯化方法和应用
技术领域
本发明涉及药学领域，具体涉及一种有柄石韦中的化合物及其分离纯化方法和应用。
背景技术
利尿、通淋属祖国医学“腰痛”“淋证”病范畴,是泌尿系统的一种常见病、多发病,其发病率高,治愈后复发率也高。究其原因主要是尿石症的发病机制至今尚不十分清楚,缺乏有效的防治措施与方法；泌尿系统结石的发病率近年呈上升趋势,尤其是肾结石直接影响肾功能，危害极大；此病男性患者多于女性。临床主要症状为腰痛，并伴有不同程度的血尿及排尿困难、腹胀、恶心、呕吐等，发病部位主要在肾及膀胱。
由于贵州水质偏硬及生活习惯等原因，利尿、通淋的病症较为常见，目前，单纯采用西药疗效欠佳，但如果单纯采用西医西药治疗，往往会出现耐药现象，治疗不彻底，并容易复发；中西医利尿、通淋的方法是不同的，效果迥异；现多采用中西医相结合的手段来实现，其诊断与治疗并不困难。而中药辨证治疗的临床方案的介入，与西医西药相辅相成，共奏清热解毒，利尿通淋之功，具备了无抗药性、副作用少、复发率低的优点，再辅以国际前沿的高新技术，可实现相关疾病的快速康复。中药的应用，可减低医疗费用，减轻患者经济负担，体现了中医实现“利尿、通淋”的优越性，因此，研究“利尿、通淋”的药物基础试验有现实意义。
贺占举、何家扬、侯北平等研究发现清热泻火利水通淋；郭美珠等研究发现清利行气汤能用于尿石症的防治；文献显示，这些均是中药防治利尿通淋的常见方剂，但未见根据中药、民族药方剂开发的化学成分防治利尿通淋的基础研究报道；目前，大多数的方剂中“利尿、通淋”以石韦相关的制剂最为常见，市场上以石韦为主要原料的中成药品种很多，如复方石韦片、复方石韦颗粒、复方石韦胶囊等制剂。
石韦始载于《神农本草经》，列为中品。《字林》云：“韦，柔皮也。”本品常附生于石上，如皮覆石，故名石韦、石皮。石韦味甘、苦，性微寒。归肺、膀胱经。具利尿通淋，清肺止咳，凉血止血之功效。常用于治疗热淋、血淋、石淋，小便不通、淋沥涩痛，肺热喘咳，吐血、衄血、尿血、崩漏等症。由此可见石韦具有“利尿、通淋”的活性作用，有必要对石韦“利尿、通淋”物质基础机理进行系统的研究。因此，研究石韦利尿通淋的药效物质基础，有利于进一步了解石韦利尿、通淋用药的理论依据。
历代本草对石韦多有记载，《中国药典(2015年版)》收载石韦来源为水龙骨科植物Polypodiaceae；黔产的石韦有三种：、石韦Pyrrosia lingua(Thunb.)Farwell、庐山石韦Pyrrosia sheareri(Bak.)Ching，资源丰富，合理开发和利用石韦，有足够的资源基础。
针对以上问题，本发明团队在国家自然科学基金及贵州省科技厅基金项目以及大量文献资料调研的基础上，在采用现代提取分离技术对有柄石韦化学成分进行深入的系统研究，并结合代谢组学、药物辅助设计及药效跟踪筛选，初步明确了石韦利尿通淋的物质基础，为开发“利尿、通淋”药物奠定了基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种有柄石韦中的化合物。
本发明的另一目的是提供一种有柄石韦中的化合物分离纯化方法。
本发明的另一目的是提供一种有柄石韦中的化合物在利尿通淋药物制剂方面的应用。
本发明所述的一种有柄石韦中的化合物分别为：坝巴酸、山奈酚、绿原酸甲酯、Petiolide A(1)。
本发明所述的化合物结构式分别如下：
1)坝巴酸的结构式为：
Figure BDA0002548872490000021
2)山奈酚的结构式为：
3)绿原酸甲酯的结构式为：
Figure BDA0002548872490000022
4)Petiolide A(1)的结构式为：
Figure BDA0002548872490000023
本发明所述化合物坝巴酸的晶体结构为：
Figure BDA0002548872490000024
本发明所述化合物的特征分别为：
坝巴酸具体特征为：白色粉末，易溶于二氯甲烷，乙酸乙酯，甲醇，吡啶，不溶于石油醚，以比例为3∶1的石油醚-乙酸乙酯为展开剂展开，TLC在波长365nm检测下有蓝色荧光，用10％硫酸-乙醇溶液加热显色，呈紫色斑点，且Rf＝0.56，碳谱、质谱数据得出分子式C19H20O7，ESI-MS m/z:360[M]+，在13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)中δ173.25,168.67为两个羰基碳信号，δ55.82(OCH3)为甲氧基碳信号，1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.73(1H,s，COOH)，δ6.70(1H,s,H-5′),6.60(1H,s,H-5)，3.86(3H,s,OMe-4),2.56(3H,s,Me-8′),2.48(3H,s,Me-8),2.00(3H,s,Me-9′),1.99(3H,s,Me-9)；其晶体数据如下：分子式为C20H24O8,分质量为392，晶系为三斜晶系，晶胞总数为
Figure BDA0002548872490000031
α＝88.815(8)°，β＝86.346(8)°，γ＝80.052(9)，/>
Figure BDA0002548872490000032
Z＝2，Rgt(F)＝0.0785,wRref(F2)＝0.2235，T＝205K；
山奈酚具体特征为：化合物为黄色粉末，盐酸-镁粉反应阳性，1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ:8.09(2H,d,J＝8.9Hz),6.91(2H,d,J＝8.9Hz),6.40(1H,d,J＝1.9Hz),6.19(1H,d,J＝2.0Hz)没有归属，将化合物与山奈酚对照品共薄层，采用比例为2:10:0.1的氯仿：乙酸乙酯：乙酸、比例为1：1的甲醇：氯仿、比例为1:5的石油醚：乙酸乙酯系统展开；系统展开Rf值均一致；
绿原酸甲酯具体特征为：淡黄色油状物(甲醇)，以比例为20：1的二氯甲烷：甲醇为展开剂展开，TLC在波长254nm检测下有暗斑，用10％硫酸-乙醇溶液加热显色，呈棕红色斑点，三氯化铁-铁氰化钾反应呈阳性，为酚类化合物，根据碳谱、质谱等数据得出分子式为C17H20O9，ESI-MS m/z:368[M]+；在13C-NMR(400MHz,CD3OD)在δ175.22,168.07为羰基化合物，δ149.48,146.99,146.65,127.43,122.78,116.33,114.91,114.84为8个sp2杂化碳信号；δ75.61,72.31,71.91,70.08,52.77为5个连氧碳信号；1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ:7.53(1H,d,J＝15.9Hz,H-3′),7.05(1H,d,J＝1.7Hz,H-5′),6.98(1H,dd,J＝8.2,1.8Hz,H-9′),6.81(1H,d,J＝8.1Hz,H-8′),6.22(1H,d,J＝15.9Hz,H-2′),5.30(1H,q,J＝7.3Hz,H-3),4.14(1H,m,H-5),3.76(1H,dd,J＝7.3,2.9Hz,H-4),3.70(3H,s,H-8),2.25-2.02(4H,m,H-2,H-6)；13CNMR(400MHz,CD3OD)δ:175.22(C-7),168.07(C-1′),149.48(C-7′),146.99(C-3′),146.65(C-6′),127.43(C-4′),122.78(C-9′),116.33(C-8′),114.91(C-2′),114.84(C-5′),75.61(C-1),72.31(C-4),71.91(C-3),70.08(C-5),52.77(C-8),37.82(C-6),37.55(C-2)；
Petiolide A(1)具体特征为：灰白色絮状物.IR:(KBr)υmax 1734,1691,1610,1478,1372,1319,1224,1152,1091,1074cm-1.1H NMR(400MHz,MeOH-d4):δ7.69(2H,d,J＝8.5Hz,H-2/6),7.56(2H,d,J＝8.5Hz,H-3/5),7.01(1H,d,J＝2.5Hz,H-3′),6.91(1H,d,J＝9.0Hz,H-6′),6.67(1H,dd,J＝9.0,2.5Hz,H-5′),3.81(3H,s,4′-OCH3),3.70(2H,s,H-4″),2.31(3H,s,H-6″).and 13C NMR(100MHz,MeOH-d4):δ175.0(C-5″),170.0(C-7),157.6(C-4′),140.2(C-4),136.8(C-2″),135.8(C-1),132.3(C-2/6),132.26(C-2′),132.23(C-1′),130.2(C-3/5),115.9(C-6′),114.6(C-3″),112.7(C-5′),102.4(C-3′),56.1(4′-OCH3)30.5(C-4″),13.4(C-6″).H R-ESI-MS:m/z 380.0654[M+Na]+(calcd for C19H16O4NClNa,380.0660,err-1.7ppm)。
本发明所述化合物分离纯化方法包括以下步骤：
(一)药材提取与粗分离
取有柄石韦10～30kg，粉碎成过60～80目的药材粗粉，粗粉装入桶里，用70～98％乙醇浸没药材粗粉，每天不定时搅拌药材粗粉，如此反复提取2～5次，每次5～10d，合并提取液，减压浓缩至无醇味得到浸膏1.5～3.0kg，将提取物分散于4L水中，依次用石油醚萃取5～12次，每次2～6L石油醚，二氯甲烷萃取5～12次，每次2～6L二氯甲烷，乙酸乙酯萃取5～12次，每次2～6L乙酸乙酯,正丁醇萃取5～12次，每次2～6L正丁醇，分别合并萃取液，经旋转蒸发仪回收相应溶剂后得到石油醚浸膏300～400g,二氯甲烷浸膏100～210g，乙酸乙酯浸膏260～390g，正丁醇浸膏450～550g，用2800～3200mL石油醚溶解石油醚浸膏，用100～200目硅胶350g拌样，经硅胶柱色谱进行分离，以比例为50∶1、30∶1、20∶1、10∶1、7∶1、5∶1、3∶1、1∶1的石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱，待1∶1的石油醚-乙酸乙酯冲柱完成后，采用乙酸乙酯和甲醇进行冲柱，TLC跟踪，合并相同部分并得到Fr.A、Fr.B、Fr.C、Fr.D、Fr.E、Fr.F、Fr.G、Fr.H共8个组分；用2300～2700mL乙酸乙酯溶解乙酸乙酯浸膏，称取300g聚酰胺拌样，用比例为50％甲醇水1200～1700mL，70％甲醇水1000～1400mL，90％甲醇水1200～1700mL，100％甲醇水1000～1400mL梯度洗脱，合并相同部分进行粗分段，得到Fr.I、Fr.J、Fr.K、Fr.L共4个组分。
(二)化学成分的细分离纯化
1)坝巴酸的分离，即Fr.G部分的分离纯化
将步骤(一)中的Fr.G部分用比例为1∶1的二氯甲烷-甲醇200～300mL溶解，并进行过滤，采用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱色谱除色素，得到Fr.Ga、Fr.Gb、Fr.Gc共3个部分，Fr.Gc用5～11mL乙酸乙酯溶解，用100-200目硅胶拌样，200-300目硅胶干法装柱，用比例为5∶1的石油醚-醋酸乙酯30～50mL洗脱，得到坝巴酸化合物9～17mg。
2)绿原酸甲酯、山奈酚的分离纯化，即乙酸乙酯部分分离纯化
将步骤(一)中的乙酸乙酯部分先用1800～2200mL乙酸乙酯溶解，按1∶1倍称取聚酰胺，在水浴锅上拌样，聚酰胺按方法处理，湿法装柱，干法上样，然后依次用50％甲醇水1200～1700mL，70％甲醇水1000～1400mL，90％甲醇水1300～1700mL，100％甲醇水1000～1400mL梯度洗脱，减压回收溶剂，得到50％甲醇水提取后的浸膏50～61g,70％甲醇水提取后的浸膏95～115g，90％甲醇水提取后的浸膏40～50g,100％甲醇水提取后的浸膏120～140g，其中50％甲醇水提取后的浸膏中，析出白色晶体，抽出晶体，得到58～70mg化合物24，其余部分旋干用比例1∶1的二氯甲烷-甲醇120～180mL溶解，过滤，过葡聚糖层析柱，按色带接出流出液，得到Fr.Ia、Fr.Ib、Fr.Ic、Fr.Id共4个组分，其中Fr.Ib,用80～120mL乙酸乙酯溶解，称取1∶1倍100-200目硅胶水浴锅上拌样，以流动相比例为20∶1的二氯甲烷-甲醇20～50mL，过硅胶柱层析，得到Fr.Ib1、Fr.Ib2、Fr.Ib3共3个组分，其中Fr.Ib1用同法，过硅胶柱层析得到10～16mg化合物绿原酸甲酯,70％甲醇水提取后的浸膏用比例为1∶1二氯甲烷-甲醇100～140mL溶解，过滤，过葡聚糖层析柱，按色带接出流出液，得到Fr.Ja、Fr.Jb、Fr.Jc、Fr.Jd、Fr.Je共5个组分,Fr.Je用10～20mL乙酸乙酯溶解，称取比例为1∶1倍的100-200目硅胶水浴锅上拌样，以流动相比例为30∶1的二氯甲烷-甲醇20～50mL，过硅胶柱层析，得到Fr.Je1、Fr.Je2共2各组分，Fr.Je2用3～8mL乙酸乙酯溶解，称取比例为1∶1倍100-200目硅胶水浴锅上拌样，以流动相比例为15∶1二氯甲烷-甲醇20～50mL，过硅胶柱层析，有黄色颗粒析出，抽出得到12～18mg化合物山奈酚；
3)Petiolide A(1)新化合物的分离纯化，即Fr.E和Fr.F部分的分离纯化
将步骤(一)中的Fr.E和Fr.F部分用乙酸乙酯40～60mL溶解，1～2倍聚酰胺拌样，选用事先预处理后的MCI，湿法装柱，干法上样进行梯度洗脱，以除脱色，用比例为70％甲醇水1000～1400mL，80％甲醇水1200～1700mL，90％甲醇水1000～1400mL，100％甲醇水1200～1700mL进行梯度洗脱，最后用100mL丙酮冲柱，减压回收得到Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4共4个部分，Fr.3用比例为1∶1的二氯甲烷-甲醇溶解，采用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20得到Fr.3a、Fr.3b、Fr.3c、Fr.3d 4个部分，Fr.3d用比例为1∶1的二氯甲烷-甲醇溶解，采用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20得到Fr.3d1、Fr.3d2共2个部分,其中Fr.3d2采用比例为4:1的石油醚：丙酮20～50mL过硅胶柱层析，得到白色固体25～35mg化合物Petiolide A(1)。
优选的，本发明所述化合物分离纯化方法包括以下步骤：
(一)药材提取与粗分离
取有柄石韦20kg，粉碎成过60～80目的药材粗粉，粗粉装入桶里，用95％乙醇浸没药材粗粉，每天不定时搅拌药材粗粉，如此反复提取3次，每次7d，合并提取液，减压浓缩至无醇味得到浸膏2kg，将提取物分散于4L水中，依次用石油醚萃取8次，每次4L石油醚，二氯甲烷萃取8次，每次4L二氯甲烷，乙酸乙酯萃取8次，每次4L乙酸乙酯,正丁醇萃取8次，每次4L正丁醇，分别合并萃取液，经旋转蒸发仪回收相应溶剂后得到石油醚浸膏350g,二氯甲烷浸膏156g，乙酸乙酯浸膏317g，正丁醇浸膏503g，用3000mL石油醚溶解石油醚浸膏，用100～200目硅胶350g拌样，经硅胶柱色谱进行分离，以比例为50∶1、30∶1、20∶1、10∶1、7∶1、5∶1、3∶1、1∶1的石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱，待1∶1的石油醚-乙酸乙酯冲柱完成后，采用乙酸乙酯和甲醇进行冲柱，TLC跟踪，合并相同部分并得到Fr.A、Fr.B、Fr.C、Fr.D、Fr.E、Fr.F、Fr.G、Fr.H共8个组分；用2500mL乙酸乙酯溶解乙酸乙酯浸膏，称取300g聚酰胺拌样，用比例为50％甲醇水1500mL，70％甲醇水1200mL，90％甲醇水1500mL，100％甲醇水1200mL梯度洗脱，合并相同部分进行粗分段，得到Fr.I、Fr.J、Fr.K、Fr.L共4个组分。
(二)化学成分的细分离纯化
1)坝巴酸的分离，即Fr.G部分的分离纯化
将步骤(一)中的Fr.G部分用比例为1∶1的二氯甲烷-甲醇250mL溶解，并进行过滤，采用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱色谱除色素，得到Fr.Ga、Fr.Gb、Fr.Gc共3个部分，Fr.Gc用8mL乙酸乙酯溶解，用100-200目硅胶拌样，200-300目硅胶干法装柱，用比例为5∶1的石油醚-醋酸乙酯40mL洗脱，得到坝巴酸化合物13mg。
2)绿原酸甲酯、山奈酚的分离纯化，即乙酸乙酯部分分离纯化
将步骤(一)中的乙酸乙酯部分先用2000mL乙酸乙酯溶解，按1∶1倍称取聚酰胺，在水浴锅上拌样，聚酰胺按方法处理，湿法装柱，干法上样，然后依次用50％甲醇水1500mL，70％甲醇水1200mL，90％甲醇水1500mL，100％甲醇水1200mL梯度洗脱，减压回收溶剂，得到50％甲醇水提取后的浸膏56g,70％甲醇水提取后的浸膏105g，90％甲醇水提取后的浸膏45g,100％甲醇水提取后的浸膏130g，其中50％甲醇水提取后的浸膏中，析出白色晶体，抽出晶体，得到63mg化合物24，其余部分旋干用比例1∶1的二氯甲烷-甲醇150mL溶解，过滤，过葡聚糖层析柱，按色带接出流出液，得到Fr.Ia、Fr.Ib、Fr.Ic、Fr.Id共4个组分，其中Fr.Ib,用100mL乙酸乙酯溶解，称取1∶1倍100-200目硅胶水浴锅上拌样，以流动相比例为20∶1的二氯甲烷-甲醇30mL，过硅胶柱层析，得到Fr.Ib1、Fr.Ib2、Fr.Ib3共3个组分，其中Fr.Ib1用同法，过硅胶柱层析得到13mg化合物绿原酸甲酯,70％甲醇水提取后的浸膏用比例为1∶1二氯甲烷-甲醇120mL溶解，过滤，过葡聚糖层析柱，按色带接出流出液，得到Fr.Ja、Fr.Jb、Fr.Jc、Fr.Jd、Fr.Je共5个组分,Fr.Je用15mL乙酸乙酯溶解，称取比例为1∶1倍的100-200目硅胶水浴锅上拌样，以流动相比例为30∶1的二氯甲烷-甲醇30mL，过硅胶柱层析，得到Fr.Je1、Fr.Je2共2各组分，Fr.Je2用5mL乙酸乙酯溶解，称取比例为1∶1倍100-200目硅胶水浴锅上拌样，以流动相比例为15∶1二氯甲烷-甲醇30mL，过硅胶柱层析，有黄色颗粒析出，抽出得到15mg化合物山奈酚。
3)Petiolide A(1)新化合物的分离纯化，即Fr.E和Fr.F部分的分离纯化
将步骤(一)中的Fr.E和Fr.F部分用乙酸乙酯50mL溶解，1.5倍聚酰胺拌样，选用事先预处理后的MCI，湿法装柱，干法上样进行梯度洗脱，以除脱色，用比例为70％甲醇水1200mL，80％甲醇水1500mL，90％甲醇水1200mL，100％甲醇水1200mL进行梯度洗脱，最后用100mL丙酮冲柱，减压回收得到Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4共4个部分，Fr.3用比例为1∶1的二氯甲烷-甲醇溶解，采用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20得到Fr.3a、Fr.3b、Fr.3c、Fr.3d 4个部分，Fr.3d用比例为1∶1的二氯甲烷-甲醇溶解，采用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20得到Fr.3d1、Fr.3d2共2个部分,其中Fr.3d2采用比例为4:1的石油醚：丙酮30mL过硅胶柱层析，得到白色固体30mg的化合物Petiolide A(1)。
本发明所述坝巴酸、绿原酸甲酯、山奈酚、Petiolide A(1)在利尿通淋药物方面的应用。
本发明所述坝巴酸、绿原酸甲酯、山奈酚、Petiolide A(1)在利尿通淋药物制剂方面的应用。
本发明所述制剂为加入药学上可接受的辅料按常规工艺制备成药学上可接受的制剂，所述药学上可接受的制剂为固体制剂或液体制剂。
本发明所述固体制剂为颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂、散剂、冻干粉针剂；所述液体制剂为注射制剂、口服液。
本发明所述的药学上可接受的辅料没有限定，可以是填充剂、润滑剂、矫味剂、崩解剂、抗氧化剂、保湿剂、表面活性剂等本领域常用辅料中的一种或几种。
本发明所述的Fr.Ib1用同法是指与Fr.Ib相同的处理方法。
本发明所述的“事先预处理后的MCI”是指用甲醇浸泡22～26小时MCI。
有益效果：
1、现有技术中贺占举、何家扬、侯北平等研究发现清热泻火利水通淋；郭美珠等研究发现清利行气汤能用于尿石症的防治；文献显示，这些均是中药防治利尿通淋的常见方剂，但未见根据中药、民族药方剂开发的化学成分防治利尿通淋的基础研究报道；本发明采用现代提取分离技术对黔产有柄石韦化学成分进行深入的系统研究，并结合代谢组学、药物辅助设计及药效跟踪筛选，首次从有柄石韦中提取了利尿、通淋有效物质坝巴酸、山奈酚、绿原酸甲酯、Petiolide A(1)，明确了石韦利尿通淋的物质基础，为开发“利尿、通淋”药物奠定基础。
2、本发明通过对不同石韦提取单体的在100umol/L给药孵育24小时后，细胞存活率均有所降低，但降低幅度不大，除了里白烯、22-羟基何伯烷、β-谷甾醇、泽屋萜、Hopan-28,22-olide、11-羰基-β-乙酰乳香酸的细胞存活率在60％以下，存在一定的细胞毒性，其余药物孵育下的细胞存活率均在60％以上，毒性较低。
3、在石韦提取单体中，坝巴酸、齐墩果酸、(23E)-cycloart-23，25-ene-3β-ol在给药浓度100umol/L给药24小时后，细胞存活率在造模30和50ug/mL造模24小时均高于模型组，且30ug/mL脂多糖造模24小时具有显著性差异。显示了坝巴酸、齐墩果酸、(23E)-cycloart-23，25-ene-3β-ol的LPS细胞损伤的保护作用。
4、通过实验结果显示：模型组细胞存活OD值与正常组相比显著降低(P<0.05)，表示MDCK细胞损伤模型造模成功。与模型组相比，petiolide A(1)(50umol/L)与模型组相比，其细胞存活率显著升高(P<0.05)，显示其具有抗细胞损伤作用。
5、通过实验结果显示：与正常组细胞存活OD值相比，模型组细胞存活OD值显著降低(P<0.05)，显示造模成功。与模型组相比，坝巴酸组细胞存活OD值显著高于模型组(P<0.05)。显示了坝巴酸对LPS细胞损伤的保护作用。
附图说明
图1化合物坝巴酸的1H-NMR谱
图2化合物坝巴酸的13C-NMR谱
图3化合物山奈酚的1H-NMR谱
图4化合物绿原酸甲酯的1H-NMR谱
图5化合物绿原酸甲酯的13C-NMR谱
图6Petiolide A(1)1H-NMR谱
图7Petiolide A(1)13C-NMR谱
图8Petiolide A(1)1H-1HCOSY谱
图9Petiolide A(1)HSQC谱
图10Petiolide A(1)HMBC谱
图11不同石提取单体对50ug/mL的LPS损伤细胞存活率的影响
图12不同石韦提取单体对50ug/mL的LPS损伤细胞存活率的影响
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步地具体说明。
实施例1化合物的结构式
1)坝巴酸的结构式为：
Figure BDA0002548872490000071
2)山奈酚的结构式为：
Figure BDA0002548872490000072
/>
3)绿原酸甲酯的结构式为：
Figure BDA0002548872490000073
4)Petiolide A(1)的结构式为：
Figure BDA0002548872490000074
实施例2坝巴酸的晶体结构
Figure BDA0002548872490000081
实施例3坝巴酸特征
白色粉末，易溶于二氯甲烷，乙酸乙酯，甲醇，吡啶，不溶于石油醚，以比例为3∶1的石油醚-乙酸乙酯为展开剂展开，TLC在波长365nm检测下有蓝色荧光，用10％硫酸-乙醇溶液加热显色，呈紫色斑点，且Rf＝0.56，碳谱、质谱数据得出分子式C19H20O7，ESI-MS m/z:360[M]+，在13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)中δ173.25,168.67为两个羰基碳信号，δ55.82(OCH3)为甲氧基碳信号，1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.73(1H,s，COOH)，δ6.70(1H,s,H-5′),6.60(1H,s,H-5)，3.86(3H,s,OMe-4),2.56(3H,s,Me-8′),2.48(3H,s,Me-8),2.00(3H,s,Me-9′),1.99(3H,s,Me-9)；其晶体数据如下：分子式为C20H24O8,分质量为392，晶系为三斜晶系，晶胞总数为
Figure BDA0002548872490000082
α＝88.815(8)°，β＝86.346(8)°，γ＝80.052(9)，/>
Figure BDA0002548872490000083
Z＝2，Rgt(F)＝0.0785,wRref(F2)＝0.2235，T＝205K。
实施例4山奈酚特征
化合物为黄色粉末，盐酸-镁粉反应阳性，1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ:8.09(2H,d,J＝8.9Hz),6.91(2H,d,J＝8.9Hz),6.40(1H,d,J＝1.9Hz),6.19(1H,d,J＝2.0Hz)没有归属，将化合物与山奈酚对照品共薄层，采用比例为2:10:0.1的氯仿：乙酸乙酯：乙酸、比例为1：1的甲醇：氯仿、比例为1:5的石油醚：乙酸乙酯系统展开；系统展开Rf值均一致。
实施例5绿原酸甲酯特征
淡黄色油状物(甲醇)，以比例为20：1的二氯甲烷：甲醇为展开剂展开，TLC在波长254nm检测下有暗斑，用10％硫酸-乙醇溶液加热显色，呈棕红色斑点，三氯化铁-铁氰化钾反应呈阳性，为酚类化合物，根据碳谱、质谱等数据得出分子式为C17H20O9，ESI-MS m/z:368[M]+；在13C-NMR(400MHz,CD3OD)在δ175.22,168.07为羰基化合物，δ149.48,146.99,146.65,127.43,122.78,116.33,114.91,114.84为8个sp2杂化碳信号；δ75.61,72.31,71.91,70.08,52.77为5个连氧碳信号；1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ:7.53(1H,d,J＝15.9Hz,H-3′),7.05(1H,d,J＝1.7Hz,H-5′),6.98(1H,dd,J＝8.2,1.8Hz,H-9′),6.81(1H,d,J＝8.1Hz,H-8′),6.22(1H,d,J＝15.9Hz,H-2′),5.30(1H,q,J＝7.3Hz,H-3),4.14(1H,m,H-5),3.76(1H,dd,J＝7.3,2.9Hz,H-4),3.70(3H,s,H-8),2.25-2.02(4H,m,H-2,H-6)；13CNMR(400MHz,CD3OD)δ:175.22(C-7),168.07(C-1′),149.48(C-7′),146.99(C-3′),146.65(C-6′),127.43(C-4′),122.78(C-9′),116.33(C-8′),114.91(C-2′),114.84(C-5′),75.61(C-1),72.31(C-4),71.91(C-3),70.08(C-5),52.77(C-8),37.82(C-6),37.55(C-2)。
实施例6 Petiolide A(1)特征
灰白色絮状物.IR:(KBr)υmax 1734,1691,1610,1478,1372,1319,1224,1152,1091,1074cm-1.1H NMR(400MHz,MeOH-d4):δ7.69(2H,d,J＝8.5Hz,H-2/6),7.56(2H,d,J＝8.5Hz,H-3/5),7.01(1H,d,J＝2.5Hz,H-3′),6.91(1H,d,J＝9.0Hz,H-6′),6.67(1H,dd,J＝9.0,2.5Hz,H-5′),3.81(3H,s,4′-OCH3),3.70(2H,s,H-4″),2.31(3H,s,H-6″).and 13C NMR(100MHz,MeOH-d4):δ175.0(C-5″),170.0(C-7),157.6(C-4′),140.2(C-4),136.8(C-2″),135.8(C-1),132.3(C-2/6),132.26(C-2′),132.23(C-1′),130.2(C-3/5),115.9(C-6′),114.6(C-3″),112.7(C-5′),102.4(C-3′),56.1(4′-OCH3)30.5(C-4″),13.4(C-6″).HR-ESI-MS:m/z 380.0654[M+Na]+(calcd for C19H16O4NClNa,380.0660,err-1.7ppm)。
实施例7坝巴酸、山奈酚、绿原酸甲酯、Petiolide A(1)及分离纯化方法
(一)药材提取与粗分离
取有柄石韦20kg，粉碎成过60～80目的药材粗粉，粗粉装入桶里，用95％乙醇浸没药材粗粉，每天不定时搅拌药材粗粉，如此反复提取3次，每次7d，合并提取液，减压浓缩至无醇味得到浸膏2kg，将提取物分散于4L水中，依次用石油醚萃取8次，每次4L石油醚，二氯甲烷萃取8次，每次4L二氯甲烷，乙酸乙酯萃取8次，每次4L乙酸乙酯,正丁醇萃取8次，每次4L正丁醇，分别合并萃取液，经旋转蒸发仪回收相应溶剂后得到石油醚浸膏350g,二氯甲烷浸膏156g，乙酸乙酯浸膏317g，正丁醇浸膏503g，用3000mL石油醚溶解石油醚浸膏，用100～200目硅胶350g拌样，经硅胶柱色谱进行分离，以比例为50∶1、30∶1、20∶1、10∶1、7∶1、5∶1、3∶1、1∶1的石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱，待1∶1的石油醚-乙酸乙酯冲柱完成后，采用乙酸乙酯和甲醇进行冲柱，TLC跟踪，合并相同部分并得到Fr.A、Fr.B、Fr.C、Fr.D、Fr.E、Fr.F、Fr.G、Fr.H共8个组分；用2500mL乙酸乙酯溶解乙酸乙酯浸膏，称取300g聚酰胺拌样，用比例为50％甲醇水1500mL，70％甲醇水1200mL，90％甲醇水1500mL，100％甲醇水1200mL梯度洗脱，合并相同部分进行粗分段，得到Fr.I、Fr.J、Fr.K、Fr.L共4个组分。
(二)化学成分的细分离纯化
1)坝巴酸的分离，即Fr.G部分的分离纯化
将步骤(一)中的Fr.G部分用比例为1∶1的二氯甲烷-甲醇250mL溶解，并进行过滤，采用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱色谱除色素，得到Fr.Ga、Fr.Gb、Fr.Gc共3个部分，Fr.Gc用8mL乙酸乙酯溶解，用100-200目硅胶拌样，200-300目硅胶干法装柱，用比例为5∶1的石油醚-醋酸乙酯40mL洗脱，得到坝巴酸化合物13mg。
2)绿原酸甲酯、山奈酚的分离纯化，即乙酸乙酯部分分离纯化
将步骤(一)中的乙酸乙酯部分先用2000mL乙酸乙酯溶解，按1∶1倍称取聚酰胺，在水浴锅上拌样，聚酰胺按方法处理，湿法装柱，干法上样，然后依次用50％甲醇水1500mL，70％甲醇水1200mL，90％甲醇水1500mL，100％甲醇水1200mL梯度洗脱，减压回收溶剂，得到50％甲醇水提取后的浸膏56g,70％甲醇水提取后的浸膏105g，90％甲醇水提取后的浸膏45g,100％甲醇水提取后的浸膏130g，其中50％甲醇水提取后的浸膏中，析出白色晶体，抽出晶体，得到63mg化合物24，其余部分旋干用比例1∶1的二氯甲烷-甲醇150mL溶解，过滤，过葡聚糖层析柱，按色带接出流出液，得到Fr.Ia、Fr.Ib、Fr.Ic、Fr.Id共4个组分，其中Fr.Ib,用100mL乙酸乙酯溶解，称取1∶1倍100-200目硅胶水浴锅上拌样，以流动相比例为20∶1的二氯甲烷-甲醇30mL，过硅胶柱层析，得到Fr.Ib1、Fr.Ib2、Fr.Ib3共3个组分，其中Fr.Ib1用同法，过硅胶柱层析得到13mg化合物绿原酸甲酯,70％甲醇水提取后的浸膏用比例为1∶1二氯甲烷-甲醇120mL溶解，过滤，过葡聚糖层析柱，按色带接出流出液，得到Fr.Ja、Fr.Jb、Fr.Jc、Fr.Jd、Fr.Je共5个组分,Fr.Je用15mL乙酸乙酯溶解，称取比例为1∶1倍的100-200目硅胶水浴锅上拌样，以流动相比例为30∶1的二氯甲烷-甲醇30mL，过硅胶柱层析，得到Fr.Je1、Fr.Je2共2各组分，Fr.Je2用5mL乙酸乙酯溶解，称取比例为1∶1倍100-200目硅胶水浴锅上拌样，以流动相比例为15∶1二氯甲烷-甲醇30mL，过硅胶柱层析，有黄色颗粒析出，抽出得到15mg化合物山奈酚。
3)Petiolide A(1)新化合物的分离纯化，即Fr.E和Fr.F部分的分离纯化
将步骤(一)中的Fr.E和Fr.F部分用乙酸乙酯50mL溶解，1.5倍聚酰胺拌样，选用事先预处理后的MCI，湿法装柱，干法上样进行梯度洗脱，以除脱色，用比例为70％甲醇水1200mL，80％甲醇水1500mL，90％甲醇水1200mL，100％甲醇水1200mL进行梯度洗脱，最后用100mL丙酮冲柱，减压回收得到Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4共4个部分，Fr.3用比例为1∶1的二氯甲烷-甲醇溶解，采用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20得到Fr.3a、Fr.3b、Fr.3c、Fr.3d 4个部分，Fr.3d用比例为1∶1的二氯甲烷-甲醇溶解，采用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20得到Fr.3d1、Fr.3d2共2个部分,其中Fr.3d2采用比例为4:1的石油醚：丙酮30mL过硅胶柱层析，得到白色固体30mg的化合物Petiolide A(1)。
化合物的结构式分别为：
1)坝巴酸的结构式为：
Figure BDA0002548872490000101
2)山奈酚的结构式为：
Figure BDA0002548872490000102
3)绿原酸甲酯的结构式为：
Figure BDA0002548872490000103
4)Petiolide A(1)的结构式为：
Figure BDA0002548872490000104
坝巴酸的晶体结构为：
Figure BDA0002548872490000105
化合物的特征分别为：
坝巴酸具体特征为：白色粉末，易溶于二氯甲烷，乙酸乙酯，甲醇，吡啶，不溶于石油醚，以比例为3∶1的石油醚-乙酸乙酯为展开剂展开，TLC在波长365nm检测下有蓝色荧光，用10％硫酸-乙醇溶液加热显色，呈紫色斑点，且Rf＝0.56，碳谱、质谱数据得出分子式C19H20O7，ESI-MS m/z:360[M]+，在13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)中δ173.25,168.67为两个羰基碳信号，δ55.82(OCH3)为甲氧基碳信号，1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.73(1H,s，COOH)，δ6.70(1H,s,H-5′),6.60(1H,s,H-5)，3.86(3H,s,OMe-4),2.56(3H,s,Me-8′),2.48(3H,s,Me-8),2.00(3H,s,Me-9′),1.99(3H,s,Me-9)；其晶体数据如下：分子式为C20H24O8,分质量为392，晶系为三斜晶系，晶胞总数为
Figure BDA0002548872490000111
α＝88.815(8)°，β＝86.346(8)°，γ＝80.052(9)，/>
Figure BDA0002548872490000112
Z＝2，Rgt(F)＝0.0785,wRref(F2)＝0.2235，T＝205K；
山奈酚具体特征为：化合物为黄色粉末，盐酸-镁粉反应阳性，
1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ:8.09(2H,d,J＝8.9Hz),6.91(2H,d,J＝8.9Hz),6.40(1H,d,J＝1.9Hz),6.19(1H,d,J＝2.0Hz)没有归属，将化合物与山奈酚对照品共薄层，采用比例为2:10:0.1的氯仿：乙酸乙酯：乙酸、比例为1：1的甲醇：氯仿、比例为1:5的石油醚：乙酸乙酯系统展开；系统展开Rf值均一致；
绿原酸甲酯具体特征为：淡黄色油状物，以比例为20：1的二氯甲烷：甲醇为展开剂展开，TLC在波长254nm检测下有暗斑，用10％硫酸-乙醇溶液加热显色，呈棕红色斑点，三氯化铁-铁氰化钾反应呈阳性，为酚类化合物，根据碳谱、质谱等数据得出分子式为C17H20O9，ESI-MS m/z:368[M]+；在13C-NMR(400MHz,CD3OD)在δ175.22,168.07为羰基化合物，δ149.48,146.99,146.65,127.43,122.78,116.33,114.91,114.84为8个sp2杂化碳信号；δ75.61,72.31,71.91,70.08,52.77为5个连氧碳信号；1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ:7.53(1H,d,J＝15.9Hz,H-3′),7.05(1H,d,J＝1.7Hz,H-5′),6.98(1H,dd,J＝8.2,1.8Hz,H-9′),6.81(1H,d,J＝8.1Hz,H-8′),6.22(1H,d,J＝15.9Hz,H-2′),5.30(1H,q,J＝7.3Hz,H-3),4.14(1H,m,H-5),3.76(1H,dd,J＝7.3,2.9Hz,H-4),3.70(3H,s,H-8),2.25-2.02(4H,m,H-2,H-6)；13CNMR(400MHz,CD3OD)δ:175.22(C-7),168.07(C-1′),149.48(C-7′),146.99(C-3′),146.65(C-6′),127.43(C-4′),122.78(C-9′),116.33(C-8′),114.91(C-2′),114.84(C-5′),75.61(C-1),72.31(C-4),71.91(C-3),70.08(C-5),52.77(C-8),37.82(C-6),37.55(C-2)；
Petiolide A(1)具体特征为：灰白色絮状物.IR:(KBr)υmax 1734,1691,1610,1478,1372,1319,1224,1152,1091,1074cm-1.1H NMR(400MHz,MeOH-d4):δ7.69(2H,d,J＝8.5Hz,H-2/6),7.56(2H,d,J＝8.5Hz,H-3/5),7.01(1H,d,J＝2.5Hz,H-3′),6.91(1H,d,J＝9.0Hz,H-6′),6.67(1H,dd,J＝9.0,2.5Hz,H-5′),3.81(3H,s,4′-OCH3),3.70(2H,s,H-4″),2.31(3H,s,H-6″).and 13C NMR(100MHz,MeOH-d4):δ175.0(C-5″),170.0(C-7),157.6(C-4′),140.2(C-4),136.8(C-2″),135.8(C-1),132.3(C-2/6),132.26(C-2′),132.23(C-1′),130.2(C-3/5),115.9(C-6′),114.6(C-3″),112.7(C-5′),102.4(C-3′),56.1(4′-OCH3)30.5(C-4″),13.4(C-6″).H R-ESI-MS:m/z 380.0654[M+Na]+(calcd for C19H16O4NClNa,380.0660,err-1.7ppm)。
实施例8坝巴酸、山奈酚、绿原酸甲酯、Petiolide A(1)及分离纯化方法
(一)药材提取与粗分离
取有柄石韦10kg，粉碎成过60～80目的药材粗粉，粗粉装入桶里，用70％乙醇浸没药材粗粉，每天不定时搅拌药材粗粉，如此反复提取2次，每次10d，合并提取液，减压浓缩至无醇味得到浸膏1.5kg，将提取物分散于4L水中，依次用石油醚萃取5次，每次2L石油醚，二氯甲烷萃取5次，每次2L二氯甲烷，乙酸乙酯萃取5次，每次2L乙酸乙酯,正丁醇萃取5次，每次2L正丁醇，分别合并萃取液，经旋转蒸发仪回收相应溶剂后得到石油醚浸膏300g,二氯甲烷浸膏100g，乙酸乙酯浸膏260g，正丁醇浸膏450g，用2800mL石油醚溶解石油醚浸膏，用100～200目硅胶350g拌样，经硅胶柱色谱进行分离，以比例为50∶1、30∶1、20∶1、10∶1、7∶1、5∶1、3∶1、1∶1的石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱，待1∶1的石油醚-乙酸乙酯冲柱完成后，采用乙酸乙酯和甲醇进行冲柱，TLC跟踪，合并相同部分并得到Fr.A、Fr.B、Fr.C、Fr.D、Fr.E、Fr.F、Fr.G、Fr.H共8个组分；用2300mL乙酸乙酯溶解乙酸乙酯浸膏，称取300g聚酰胺拌样，用比例为50％甲醇水1200mL，70％甲醇水1000mL，90％甲醇水1200mL，100％甲醇水1000mL梯度洗脱，合并相同部分进行粗分段，得到Fr.I、Fr.J、Fr.K、Fr.L共4个组分。
(二)化学成分的细分离纯化
1)坝巴酸的分离，即Fr.G部分的分离纯化
将步骤(一)中的Fr.G部分用比例为1∶1的二氯甲烷-甲醇200mL溶解，并进行过滤，采用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱色谱除色素，得到Fr.Ga、Fr.Gb、Fr.Gc共3个部分，Fr.Gc用5mL乙酸乙酯溶解，用100-200目硅胶拌样，200-300目硅胶干法装柱，用比例为5∶1的石油醚-醋酸乙酯30mL洗脱，得到坝巴酸化合物9mg。
2)绿原酸甲酯、山奈酚的分离纯化，即乙酸乙酯部分分离纯化
将步骤(一)中的乙酸乙酯部分先用1800mL乙酸乙酯溶解，按1∶1倍称取聚酰胺，在水浴锅上拌样，聚酰胺按方法处理，湿法装柱，干法上样，然后依次用50％甲醇水1200mL，70％甲醇水1000mL，90％甲醇水1300mL，100％甲醇水1000mL梯度洗脱，减压回收溶剂，得到50％甲醇水提取后的浸膏50g,70％甲醇水提取后的浸膏95g，90％甲醇水提取后的浸膏40g,100％甲醇水提取后的浸膏120g，其中50％甲醇水提取后的浸膏中，析出白色晶体，抽出晶体，得到58mg化合物24，其余部分旋干用比例1∶1的二氯甲烷-甲醇120mL溶解，过滤，过葡聚糖层析柱，按色带接出流出液，得到Fr.Ia、Fr.Ib、Fr.Ic、Fr.Id共4个组分，其中Fr.Ib,用80mL乙酸乙酯溶解，称取1∶1倍100-200目硅胶水浴锅上拌样，以流动相比例为20∶1的二氯甲烷-甲醇20mL，过硅胶柱层析，得到Fr.Ib1、Fr.Ib2、Fr.Ib3共3个组分，其中Fr.Ib1用同法，过硅胶柱层析得到10mg化合物绿原酸甲酯,70％甲醇水提取后的浸膏用比例为1∶1二氯甲烷-甲醇100mL溶解，过滤，过葡聚糖层析柱，按色带接出流出液，得到Fr.Ja、Fr.Jb、Fr.Jc、Fr.Jd、Fr.Je共5个组分,Fr.Je用10mL乙酸乙酯溶解，称取比例为1∶1倍的100-200目硅胶水浴锅上拌样，以流动相比例为30∶1的二氯甲烷-甲醇20mL，过硅胶柱层析，得到Fr.Je1、Fr.Je2共2各组分，Fr.Je2用3mL乙酸乙酯溶解，称取比例为1∶1倍100-200目硅胶水浴锅上拌样，以流动相比例为15∶1二氯甲烷-甲醇20mL，过硅胶柱层析，有黄色颗粒析出，抽出得到12mg化合物山奈酚。
3)Petiolide A(1)新化合物的分离纯化，即Fr.E和Fr.F部分的分离纯化
将步骤(一)中的Fr.E和Fr.F部分用乙酸乙酯40mL溶解，1～2倍聚酰胺拌样，选用事先预处理后的MCI，湿法装柱，干法上样进行梯度洗脱，以除脱色，用比例为70％甲醇水1000mL，80％甲醇水1200mL，90％甲醇水1000mL，100％甲醇水1200mL进行梯度洗脱，最后用100mL丙酮冲柱，减压回收得到Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4共4个部分，Fr.3用比例为1∶1的二氯甲烷-甲醇溶解，采用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20得到Fr.3a、Fr.3b、Fr.3c、Fr.3d 4个部分，Fr.3d用比例为1∶1的二氯甲烷-甲醇溶解，采用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20得到Fr.3d1、Fr.3d2共2个部分,其中Fr.3d2采用比例为4:1的石油醚：丙酮20mL过硅胶柱层析，得到白色固体25mg的化合物Petiolide A(1)。
化合物的结构式分别为：
1)坝巴酸的结构式为：
Figure BDA0002548872490000131
2)山奈酚的结构式为：
3)绿原酸甲酯的结构式为：
Figure BDA0002548872490000132
4)Petiolide A(1)的结构式为：
Figure BDA0002548872490000133
坝巴酸的晶体结构为：
Figure BDA0002548872490000134
化合物的特征分别为：
坝巴酸具体特征为：白色粉末，易溶于二氯甲烷，乙酸乙酯，甲醇，吡啶，不溶于石油醚，以比例为3∶1的石油醚-乙酸乙酯为展开剂展开，TLC在波长365nm检测下有蓝色荧光，用10％硫酸-乙醇溶液加热显色，呈紫色斑点，且Rf＝0.56，碳谱、质谱数据得出分子式C19H20O7，ESI-MS m/z:360[M]+，在13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)中δ173.25,168.67为两个羰基碳信号，δ55.82(OCH3)为甲氧基碳信号，1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.73(1H,s，COOH)，δ6.70(1H,s,H-5′),6.60(1H,s,H-5)，3.86(3H,s,OMe-4),2.56(3H,s,Me-8′),2.48(3H,s,Me-8),2.00(3H,s,Me-9′),1.99(3H,s,Me-9)；其晶体数据如下：分子式为C20H24O8,分质量为392，晶系为三斜晶系，晶胞总数为
Figure BDA0002548872490000141
α＝88.815(8)°，β＝86.346(8)°，γ＝80.052(9)，/>
Figure BDA0002548872490000142
Z＝2，Rgt(F)＝0.0785,wRref(F2)＝0.2235，T＝205K；
山奈酚具体特征为：化合物为黄色粉末，盐酸-镁粉反应阳性，1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ:8.09(2H,d,J＝8.9Hz),6.91(2H,d,J＝8.9Hz),6.40(1H,d,J＝1.9Hz),6.19(1H,d,J＝2.0Hz)没有归属，将化合物与山奈酚对照品共薄层，采用比例为2:10:0.1的氯仿：乙酸乙酯：乙酸、比例为1：1的甲醇：氯仿、比例为1:5的石油醚：乙酸乙酯系统展开；系统展开Rf值均一致；
绿原酸甲酯具体特征为：淡黄色油状物，以比例为20：1的二氯甲烷：甲醇为展开剂展开，TLC在波长254nm检测下有暗斑，用10％硫酸-乙醇溶液加热显色，呈棕红色斑点，三氯化铁-铁氰化钾反应呈阳性，为酚类化合物，根据碳谱、质谱等数据得出分子式为C17H20O9，ESI-MS m/z:368[M]+；在13C-NMR(400MHz,CD3OD)在δ175.22,168.07为羰基化合物，
δ149.48,146.99,146.65,127.43,122.78,116.33,114.91,114.84为8个sp2杂化碳信号；
δ75.61,72.31,71.91,70.08,52.77为5个连氧碳信号；
1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ:7.53(1H,d,J＝15.9Hz,H-3′),7.05(1H,d,J＝1.7Hz,H-5′),6.98(1H,dd,J＝8.2,1.8Hz,H-9′),6.81(1H,d,J＝8.1Hz,H-8′),6.22(1H,d,J＝15.9Hz,H-2′),5.30(1H,q,J＝7.3Hz,H-3),4.14(1H,m,H-5),3.76(1H,dd,J＝7.3,2.9Hz,H-4),3.70(3H,s,H-8),2.25-2.02(4H,m,H-2,H-6)；13CNMR(400MHz,CD3OD)δ:175.22(C-7),168.07(C-1′),149.48(C-7′),146.99(C-3′),146.65(C-6′),127.43(C-4′),122.78(C-9′),116.33(C-8′),114.91(C-2′),114.84(C-5′),75.61(C-1),72.31(C-4),71.91(C-3),70.08(C-5),52.77(C-8),37.82(C-6),37.55(C-2)；
Petiolide A(1)具体特征为：灰白色絮状物.IR:(KBr)υmax
1734,1691,1610,1478,1372,1319,1224,1152,1091,1074cm-1.1H NMR(400MHz,MeOH-d4):δ7.69(2H,d,J＝8.5Hz,H-2/6),7.56(2H,d,J＝8.5Hz,H-3/5),7.01(1H,d,J＝2.5Hz,H-3′),6.91(1H,d,J＝9.0Hz,H-6′),6.67(1H,dd,J＝9.0,2.5Hz,H-5′),3.81(3H,s,4′-OCH3),3.70(2H,s,H-4″),2.31(3H,s,H-6″).and 13C NMR(100MHz,MeOH-d4):δ175.0(C-5″),170.0(C-7),157.6(C-4′),140.2(C-4),136.8(C-2″),135.8(C-1),132.3(C-2/6),132.26(C-2′),132.23(C-1′),130.2(C-3/5),115.9(C-6′),114.6(C-3″),112.7(C-5′),102.4(C-3′),56.1(4′-OCH3)30.5(C-4″),13.4(C-6″).HR-ESI-MS:m/z380.0654[M+Na]+(calcd for C19H16O4NClNa,380.0660,err-1.7ppm)。
实施例9坝巴酸、山奈酚、绿原酸甲酯、Petiolide A(1)及分离纯化方法
(一)药材提取与粗分离
取有柄石韦30kg，粉碎成过60～80目的药材粗粉，粗粉装入桶里，用98％乙醇浸没药材粗粉，每天不定时搅拌药材粗粉，如此反复提取5次，每次5d，合并提取液，减压浓缩至无醇味得到浸膏3.0kg，将提取物分散于4L水中，依次用石油醚萃取12次，每次6L石油醚，二氯甲烷萃取12次，每次6L二氯甲烷，乙酸乙酯萃取12次，每次6L乙酸乙酯,正丁醇萃取12次，每次6L正丁醇，分别合并萃取液，经旋转蒸发仪回收相应溶剂后得到石油醚浸膏400g,二氯甲烷浸膏210g，乙酸乙酯浸膏390g，正丁醇浸膏550g，用3200mL石油醚溶解石油醚浸膏，用100～200目硅胶350g拌样，经硅胶柱色谱进行分离，以比例为50∶1、30∶1、20∶1、10∶1、7∶1、5∶1、3∶1、1∶1的石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱，待1∶1的石油醚-乙酸乙酯冲柱完成后，采用乙酸乙酯和甲醇进行冲柱，TLC跟踪，合并相同部分并得到Fr.A、Fr.B、Fr.C、Fr.D、Fr.E、Fr.F、Fr.G、Fr.H共8个组分；用2700mL乙酸乙酯溶解乙酸乙酯浸膏，称取300g聚酰胺拌样，用比例为50％甲醇水1700mL，70％甲醇水1400mL，90％甲醇水1700mL，100％甲醇水1400mL梯度洗脱，合并相同部分进行粗分段，得到Fr.I、Fr.J、Fr.K、Fr.L共4个组分。
(二)化学成分的细分离纯化
1)坝巴酸的分离，即Fr.G部分的分离纯化
将步骤(一)中的Fr.G部分用比例为1∶1的二氯甲烷-甲醇200～300mL溶解，并进行过滤，采用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱色谱除色素，得到Fr.Ga、Fr.Gb、Fr.Gc共3个部分，Fr.Gc用5～11mL乙酸乙酯溶解，用100-200目硅胶拌样，200-300目硅胶干法装柱，用比例为5∶1的石油醚-醋酸乙酯30～50mL洗脱，得到坝巴酸化合物9～17mg。
2)绿原酸甲酯、山奈酚的分离纯化，即乙酸乙酯部分分离纯化
将步骤(一)中的乙酸乙酯部分先用1800～2200mL乙酸乙酯溶解，按1∶1倍称取聚酰胺，在水浴锅上拌样，聚酰胺按方法处理，湿法装柱，干法上样，然后依次用50％甲醇水1200～1700mL，70％甲醇水1000～1400mL，90％甲醇水1300～1700mL，100％甲醇水1000～1400mL梯度洗脱，减压回收溶剂，得到50％甲醇水提取后的浸膏50～61g,70％甲醇水提取后的浸膏95～115g，90％甲醇水提取后的浸膏40～50g,100％甲醇水提取后的浸膏120～140g，其中50％甲醇水提取后的浸膏中，析出白色晶体，抽出晶体，得到58～70mg化合物24，其余部分旋干用比例1∶1的二氯甲烷-甲醇120～180mL溶解，过滤，过葡聚糖层析柱，按色带接出流出液，得到Fr.Ia、Fr.Ib、Fr.Ic、Fr.Id共4个组分，其中Fr.Ib用80～120mL乙酸乙酯溶解，称取1∶1倍100-200目硅胶水浴锅上拌样，以流动相比例为20∶1的二氯甲烷-甲醇20～50mL，过硅胶柱层析，得到Fr.Ib1、Fr.Ib2、Fr.Ib3共3个组分，其中Fr.Ib1用同法，过硅胶柱层析得到10～16mg化合物绿原酸甲酯,70％甲醇水提取后的浸膏用比例为1∶1二氯甲烷-甲醇100～140mL溶解，过滤，过葡聚糖层析柱，按色带接出流出液，得到Fr.Ja、Fr.Jb、Fr.Jc、Fr.Jd、Fr.Je共5个组分,Fr.Je用10～20mL乙酸乙酯溶解，称取比例为1∶1倍的100-200目硅胶水浴锅上拌样，以流动相比例为30∶1的二氯甲烷-甲醇20～50mL，过硅胶柱层析，得到Fr.Je1、Fr.Je2共2各组分，Fr.Je2用3～8mL乙酸乙酯溶解，称取比例为1∶1倍100-200目硅胶水浴锅上拌样，以流动相比例为15∶1二氯甲烷-甲醇20～50mL，过硅胶柱层析，有黄色颗粒析出，抽出得到12～18mg化合物山奈酚。
3)Petiolide A(1)新化合物的分离纯化，即Fr.E和Fr.F部分的分离纯化
将步骤(一)中的Fr.E和Fr.F部分用乙酸乙酯40～60mL溶解，1～2倍聚酰胺拌样，选用事先预处理后的MCI，湿法装柱，干法上样进行梯度洗脱，以除脱色，用比例为70％甲醇水1000～1400mL，80％甲醇水1200～1700mL，90％甲醇水1000～1400mL，100％甲醇水1200～1700mL进行梯度洗脱，最后用100mL丙酮冲柱，减压回收得到Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4共4个部分，Fr.3用比例为1∶1的二氯甲烷-甲醇溶解，采用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20得到Fr.3a、Fr.3b、Fr.3c、Fr.3d 4个部分，Fr.3d用比例为1∶1的二氯甲烷-甲醇溶解，采用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20得到Fr.3d1、Fr.3d2共2个部分,其中Fr.3d2采用比例为4:1的石油醚：丙酮20～50mL过硅胶柱层析，得到白色固体25～35mg的化合物Petiolide A(1)。
化合物的结构式分别为：
1)坝巴酸的结构式为：
Figure BDA0002548872490000161
2)山奈酚的结构式为：
Figure BDA0002548872490000162
3)绿原酸甲酯的结构式为：
Figure BDA0002548872490000163
4)Petiolide A(1)的结构式为：
Figure BDA0002548872490000164
坝巴酸的晶体结构为：
Figure BDA0002548872490000165
化合物的特征分别为：
坝巴酸具体特征为：白色粉末，易溶于二氯甲烷，乙酸乙酯，甲醇，吡啶，不溶于石油醚，以比例为3∶1的石油醚-乙酸乙酯为展开剂展开，TLC在波长365nm检测下有蓝色荧光，用10％硫酸-乙醇溶液加热显色，呈紫色斑点，且Rf＝0.56，碳谱、质谱数据得出分子式C19H20O7，ESI-MS m/z:360[M]+，在13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)中δ173.25,168.67为两个羰基碳信号，δ55.82(OCH3)为甲氧基碳信号，1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.73(1H,s，COOH)，δ6.70(1H,s,H-5′),6.60(1H,s,H-5)，3.86(3H,s,OMe-4),2.56(3H,s,Me-8′),2.48(3H,s,Me-8),2.00(3H,s,Me-9′),1.99(3H,s,Me-9)；其晶体数据如下：分子式为C20H24O8,分质量为392，晶系为三斜晶系，晶胞总数为
Figure BDA0002548872490000171
α＝88.815(8)°，β＝86.346(8)°，γ＝80.052(9)，/>
Figure BDA0002548872490000172
Z＝2，Rgt(F)＝0.0785,wRref(F2)＝0.2235，T＝205K；
山奈酚具体特征为：化合物为黄色粉末，盐酸-镁粉反应阳性，1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ:8.09(2H,d,J＝8.9Hz),6.91(2H,d,J＝8.9Hz),6.40(1H,d,J＝1.9Hz),6.19(1H,d,J＝2.0Hz)没有归属，将化合物与山奈酚对照品共薄层，采用比例为2:10:0.1的氯仿：乙酸乙酯：乙酸、比例为1：1的甲醇：氯仿、比例为1:5的石油醚：乙酸乙酯系统展开；系统展开Rf值均一致；
绿原酸甲酯具体特征为：淡黄色油状物，以比例为20：1的二氯甲烷：甲醇为展开剂展开，TLC在波长254nm检测下有暗斑，用10％硫酸-乙醇溶液加热显色，呈棕红色斑点，三氯化铁-铁氰化钾反应呈阳性，为酚类化合物，根据碳谱、质谱等数据得出分子式为C17H20O9，ESI-MS m/z:368[M]+；在13C-NMR(400MHz,CD3OD)在δ175.22,168.07为羰基化合物，δ149.48,146.99,146.65,127.43,122.78,116.33,114.91,114.84为8个sp2杂化碳信号；δ75.61,72.31,71.91,70.08,52.77为5个连氧碳信号；1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ:7.53(1H,d,J＝15.9Hz,H-3′),7.05(1H,d,J＝1.7Hz,H-5′),6.98(1H,dd,J＝8.2,1.8Hz,H-9′),6.81(1H,d,J＝8.1Hz,H-8′),6.22(1H,d,J＝15.9Hz,H-2′),5.30(1H,q,J＝7.3Hz,H-3),4.14(1H,m,H-5),3.76(1H,dd,J＝7.3,2.9Hz,H-4),3.70(3H,s,H-8),2.25-2.02(4H,m,H-2,H-6)；13CNMR(400MHz,CD3OD)δ:175.22(C-7),168.07(C-1′),149.48(C-7′),146.99(C-3′),146.65(C-6′),127.43(C-4′),122.78(C-9′),116.33(C-8′),114.91(C-2′),114.84(C-5′),75.61(C-1),72.31(C-4),71.91(C-3),70.08(C-5),52.77(C-8),37.82(C-6),37.55(C-2)；
Petiolide A(1)具体特征为：灰白色絮状物.IR:(KBr)υmax 1734,1691,1610,1478,1372,1319,1224,1152,1091,1074cm-1.1H NMR(400MHz,MeOH-d4):δ7.69(2H,d,J＝8.5Hz,H-2/6),7.56(2H,d,J＝8.5Hz,H-3/5),7.01(1H,d,J＝2.5Hz,H-3′),6.91(1H,d,J＝9.0Hz,H-6′),6.67(1H,dd,J＝9.0,2.5Hz,H-5′),3.81(3H,s,4′-OCH3),3.70(2H,s,H-4″),2.31(3H,s,H-6″).and 13C NMR(100MHz,MeOH-d4):δ175.0(C-5″),170.0(C-7),157.6(C-4′),140.2(C-4),136.8(C-2″),135.8(C-1),132.3(C-2/6),132.26(C-2′),132.23(C-1′),130.2(C-3/5),115.9(C-6′),114.6(C-3″),112.7(C-5′),102.4(C-3′),56.1(4′-OCH3)30.5(C-4″),13.4(C-6″).H R-ESI-MS:m/z 380.0654[M+Na]+(calcd for C19H16O4NClNa,380.0660,err-1.7ppm)。
实施例10
取坝巴酸、山奈酚、绿原酸甲酯、Petiolide A(1)任意一种化合物作为原料药，加入1/11的淀粉，制粒，得颗粒剂。
实施例11
取坝巴酸、山奈酚、绿原酸甲酯、Petiolide A(1)任意一种化合物作为原料药，加入1/10的淀粉，混匀，装入胶囊，得胶囊剂。
实施例12
取坝巴酸、山奈酚、绿原酸甲酯、Petiolide A(1)任意一种化合物作为原料药，加入及1/9的淀粉混合均匀，干燥，制成丸剂。
实施例13
取坝巴酸、山奈酚、绿原酸甲酯、Petiolide A(1)任意一种化合物作为原料药，加入1/12的淀粉，制粒，压片，制成片剂。
实施例14
取坝巴酸、山奈酚、绿原酸甲酯、Petiolide A(1)任意一种化合物作为原料药，加入15倍量的注射用水，过滤，灭菌，得注射剂。
实施例15
取坝巴酸、山奈酚、绿原酸甲酯、Petiolide A(1)任意一种化合物作为原料药，加入6倍量的注射用水，过滤，冻干，得冻干粉剂。
实施例16
取坝巴酸、山奈酚、绿原酸甲酯、Petiolide A(1)任意一种化合物作为原料药，加入16倍量纯净水，混合均匀，过滤，灭菌，得口服液。
为了进一步验证本发明的可行性及有效性，筛选出最佳方案，发明人进行了一系列的试验，具体如下：
1、四个有柄石韦化学成分坝巴酸、山奈酚、绿原酸甲酯、Petiolide A(1)的提取分离技术路线研究。
1.1.提取与分离纯化
1.1.1药材提取与粗分离
有柄石韦20kg，粉碎成粗粉(60-80目)，粗粉用95％乙醇装入桶里，用乙醇浸没药材，每天不定时搅拌药材，如此反复提取3次，每次7d，合并提取液，减压浓缩至无醇味得到浸膏2kg，将提取物分散于4L水中，依次用石油醚(8×4L)，二氯甲烷(8×4L)，乙酸乙酯(8×4L),正丁醇(8×4L)萃取，分别合并萃取液，经旋转蒸发仪回收相应溶剂后得到浸膏350g(石油醚),156g(二氯甲烷)，317g(乙酸乙酯)，503g(正丁醇)。用少量乙酸乙酯溶解石油醚浸膏，用硅胶350g(100～200目)拌样，经硅胶柱色谱进行分离，以石油醚-乙酸乙酯(50∶1、30∶1、20∶1、10∶1、7∶1、5∶1、3∶1、1∶1)梯度洗脱，待1∶1冲柱完成后，采用乙酸乙酯，甲醇进行冲柱，TLC跟踪，合并相同部分并得到8个组分(Fr.A～H)；同法用少量乙酸乙酯溶解乙酸乙酯部位，称取300g聚酰胺拌样，用50％，70％，90％，100％(甲醇-水)梯度洗脱，合并相同部分进行粗分段，得到4个组分(Fr.I-L)。
1.1.2化学成分的细分离纯化
1.1.2.1坝巴酸的分离(G部分的分离纯化)
G部分用二氯甲烷-甲醇＝1∶1溶解，并进行过滤，采用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱色谱除色素，得到3个部分(Fr.Ga～Fr.Gc)，Fr.Gc用少量乙酸乙酯溶解，用硅胶(100-200目)拌样，200-300目硅胶干法装柱，用石油醚-醋酸乙酯(5∶1)得到化合物(13mg)(坝巴酸)。
1.1.2.2绿原酸甲酯、山奈酚的分离纯化(乙酸乙酯分离纯化)
乙酸乙酯部分先用少量乙酸乙酯溶解，按1∶1倍称取聚酰胺，在水浴锅上拌样，聚酰胺按方法处理，湿法装柱，干法上样。然后依次用甲醇-水(50％，70％，90％，100％)梯度洗脱。减压回收溶剂，得到浸膏50％(56g),70％(105g),90％(45g),100％(130g).其中50％溶液中，析出白色晶体，抽出晶体，得到化合物24(63mg),其余部分旋干用二氯甲烷-甲醇(1∶1)溶解，过滤，过葡聚糖层析柱，按色带接出流出液，得到4个组分(Fr.Ia-Fr.Id)，其中Fr.Ib,用少量乙酸乙酯溶解，称取1∶1倍硅胶(100-200目)水浴锅上拌样，以流动相为二氯甲烷-甲醇(20∶1)，过硅胶柱层析，得到3个组分(Fr.Ib1-Fr.Ib3)，其中Fr.Ib1用同法，过硅胶柱层析得到化合物20(13mg)(绿原酸甲酯),70％用二氯甲烷-甲醇(1∶1)溶解，过滤，过葡聚糖层析柱，按色带接出流出液，得到5个组分(Fr.Ja-Fr.Je),Fr.Je用少量乙酸乙酯溶解，称取1∶1倍硅胶(100-200目)水浴锅上拌样，以流动相为二氯甲烷-甲醇(30∶1)，过硅胶柱层析，得到2各组分(Fr.Je1-Fr.Je2)。Fr.Je2用少量乙酸乙酯溶解，称取1∶1倍硅胶(100-200目)水浴锅上拌样，以流动相为二氯甲烷-甲醇(15∶1)，过硅胶柱层析，有黄色颗粒析出，抽出得到化合物22(15mg)(山奈酚)。
1.1.2.3 Petiolide A(1)新化合物的分离纯化(E和F部分的分离纯化)
E和F部分用乙酸乙酯溶解，1.5倍聚酰胺拌样，选用事先预处理后的MCI，湿法装柱，干法上样进行梯度洗脱，以除脱色，用甲醇-水(70％，80％，90％，100％)，最后用丙酮冲柱。减压回收得到4个部分(Fr.1-Fr.4)。Fr.3用二氯甲烷-甲醇＝1∶1溶解，采用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20得到4个部分(Fr.3a～Fr.3d)，Fr.3d用二氯甲烷-甲醇＝1∶1溶解，采用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20得到2个部分(Fr.3d1-Fr.3d2),其中Fr.3d2采用石油醚：丙酮(4:1)过硅胶柱层析得到白色固体(CF-28)化合物(30mg)(Petiolide A(1))。
2.四个有柄石韦化学成分坝巴酸、山奈酚、绿原酸甲酯、Petiolide A(1)(*新化合物)的结构表征
2.1坝巴酸
Figure BDA0002548872490000191
(结构式)
白色粉末，易溶于二氯甲烷，乙酸乙酯，甲醇，吡啶，不溶于石油醚。TLC(石油醚-乙酸乙酯＝3∶1)在波长365nm检测下有蓝色荧光，用10％硫酸-乙醇溶液加热显色，呈紫色斑点，且Rf＝0.56。根据碳谱、质谱等数据得出分子式C19H20O7，ESI-MS m/z:360[M]+。在13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)中δ173.25,168.67为两个羰基碳信号，δ55.82(OCH3)为甲氧基碳信号。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.73(1H,s，COOH)，δ6.70(1H,s,H-5′),6.60(1H,s,H-5)，3.86(3H,s,OMe-4),2.56(3H,s,Me-8′),2.48(3H,s,Me-8),2.00(3H,s,Me-9′),1.99(3H,s,Me-9)。可以看出δ10.73(1H,s,COOH),为羧基信号，δ6.70(1H,s),6.60(1H,s)为两个苯环上质子信号，且均为单峰，δ3.86(3H,s)为一个甲氧基质子信号，从这里可以看出该化合物由两个苯环组成。将以上数据经与文献报道的数据进行比对，该化合物与文献的13C-NMR核磁共振碳谱信号(见表1)，1H-NMR图谱见图1，13C-NMR图谱见图2。
表1坝巴酸的13C-NMR(100MHz,DMSO)
Figure BDA0002548872490000192
因对13C-NMR(100MHz,DMSO)δ:48.65和1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:3.16存在疑问，通过查阅文献，猜测可能是甲醇溶剂信号峰，因为在前期的重结晶过程中，已得到晶型较好的晶体，所用的溶剂的比例为乙酸乙酯：甲醇＝1：1，为了验证这一猜想，并确定其绝对构型，于是做了X-单晶衍射，其晶体数据如下。分子式为C20H24O8,分质量为392，晶系为triclinic，晶胞总数为
Figure BDA0002548872490000203
α＝88.815(8)°，β＝86.346(8)°，γ＝80.052(9)，/>
Figure BDA0002548872490000204
Z＝2，Rgt(F)＝0.0785,wRref(F2)＝0.2235，T＝205K.根据晶体数据及核磁共振数据鉴定化合物为化合物5为坝巴酸。晶体数据见表2-3，结构式及晶体结构如下：
表2数据的收集与整理
Figure BDA0002548872490000201
表3部分原子坐标和原子位移参数
Figure BDA0002548872490000202
/>
Figure BDA0002548872490000211
化合物(坝巴酸)的结构式：
Figure BDA0002548872490000221
化合物(坝巴酸)的晶体结构
Figure BDA0002548872490000222
通过X-单晶衍射证实了13C-NMR(100MHz,DMSO)δ:48.65和1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:3.16为甲醇的溶剂峰，产生的原因：可能在重结晶时甲醇小分子被坝巴酸晶胞包裹在里面，且形成了含有甲醇的化合物晶胞。
2.2山奈酚
化合物为黄色粉末，盐酸-镁粉反应阳性。1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ:8.09(2H,d,J＝8.9Hz),6.91(2H,d,J＝8.9Hz),6.40(1H,d,J＝1.9Hz),6.19(1H,d,J＝2.0Hz)没有归属。将化合物与山奈酚对照品共薄层，采用比例为2:10:0.1的氯仿：乙酸乙酯：乙酸、比例为1：1的甲醇：氯仿、比例为1:5的石油醚：乙酸乙酯系统展开Rf值均一致，故鉴定化合物为山奈酚。山奈酚1H-NMR图谱见图3。
山奈酚结构式
Figure BDA0002548872490000223
2.3绿原酸甲酯
淡黄色油状物(甲醇)，TLC(二氯甲烷：甲醇＝20：1)在波长254nm检测下有暗斑，用10％硫酸-乙醇溶液加热显色，呈棕红色斑点。三氯化铁-铁氰化钾反应呈阳性，说明具为酚类化合物。根据碳谱、质谱等数据得出分子式为分子式分子式C17H20O9，ESI-MS m/z:368[M]+。在13C-NMR(400MHz,CD3OD)在δ175.22,168.07为羰基化合物，δ149.48,146.99,146.65,127.43,122.78,116.33,114.91,114.84为8个sp2杂化碳信号。δ75.61,72.31,71.91,70.08,52.77为5个连氧碳信号。1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ:7.53(1H,d,J＝15.9Hz,H-3′),7.05(1H,d,J＝1.7Hz,H-5′),6.98(1H,d d,J＝8.2,1.8Hz,H-9′),6.81(1H,d,J＝8.1Hz,H-8′),6.22(1H,d,J＝15.9Hz,H-2′),5.30(1H,q,J＝7.3Hz,H-3),4.14(1H,m,H-5),3.76(1H,dd,J＝7.3,2.9Hz,H-4),3.70(3H,s,H-8),2.25-2.02(4H,m,H-2,H-6)；13CNMR(400MHz,CD3OD)δ:175.22(C-7),168.07(C-1′),149.48(C-7′),146.99(C-3′),146.65(C-6′),127.43(C-4′),122.78(C-9′),116.33(C-8′),114.91(C-2′),114.84(C-5′),75.61(C-1),72.31(C-4),71.91(C-3),70.08(C-5),52.77(C-8),37.82(C-6),37.55(C-2)。可以看出δ7.07(1H,d,J＝1.7Hz),6.98(1H,dd,J＝8.2,1.8Hz),6.81(1H,d,J＝8.1Hz)为苯环的ABX耦合系统质子信号。δ7.55(1H,d,J＝15.9Hz),6.24(1H,d,J＝15.9Hz)为典型的双肩上处于反式的两个质子信号。δ5.30(1H,q,J＝7.3Hz),4.13(1H,m),3.76(1H,dd,J＝7.3,2.9Hz)为3个连氧次甲基质子信号。2.25-2.02(4H,m)为两个亚甲基质子信号。将以上数据经与文献报道的数据进行比对后，数据基本一致，该化合物被确定为绿原酸甲酯，1H-NMR图谱见图4，13C-NMR图见图5；
绿原酸甲酯结构式：
Figure BDA0002548872490000231
2.4*Petiolide A(1)(新化合物)
Petiolide A(1):灰白色絮状物.IR:(KBr)υmax 1734,1691,1610,1478,1372,1319,1224,1152,1091,1074cm-1.1H NMR(400MHz,MeOH-d4):δ7.69(2H,d,J＝8.5Hz,H-2/6),7.56(2H,d,J＝8.5Hz,H-3/5),7.01(1H,d,J＝2.5Hz,H-3′),6.91(1H,d,J＝9.0Hz,H-6′),6.67(1H,dd,J＝9.0,2.5Hz,H-5′),3.81(3H,s,4′-OCH3),3.70(2H,s,H-4″),2.31(3H,s,H-6″).and 13C NMR(100MHz,MeOH-d4):δ175.0(C-5″),170.0(C-7),157.6(C-4′),140.2(C-4),136.8(C-2″),135.8(C-1),132.3(C-2/6),132.26(C-2′),132.23(C-1′),130.2(C-3/5),115.9(C-6′),114.6(C-3″),112.7(C-5′),102.4(C-3′),56.1(4′-OCH3)30.5(C-4″),13.4(C-6″).HR-ESI-MS:m/z 380.0654[M+Na]+(calcd for C19H16O4NClNa,380.0660,err-1.7ppm).
1H-NMR图谱见图6，13C-NMR图谱见图7，1H-1HCOSY图谱见图8，HSQC图谱见图9，HMBC图谱见图10。
Petiolide A(1)结构式
Figure BDA0002548872490000232
3.坝巴酸、绿原酸甲酯、山奈酚、Petiolide A(1)利尿通淋试验研究
3.1有柄石韦提取单体-坝巴酸、绿原酸甲酯、山奈酚、Petiolide A(1)利尿作用筛选研究
不同时间点有柄石韦提取单体-坝巴酸、绿原酸甲酯、山奈酚和氢氯噻嗪对钠离子、氯离子转运影响。
3.1.1对氯离子转运影响
实验结果如表4。在给氯化钠孵育30min后，于给氯化钠的细胞对侧取各组细胞培养液各50微升，进行氯离子检测：与模型组没有给药的MDCK细胞相比，坝巴酸组的氯离子浓度显著降低(P<0.05)。显示出坝巴酸具有抑制氯离子跨细胞转运的作用。
在给氯化钠孵育2小时后，于给氯化钠的细胞对侧取各组细胞培养液各50微升，进行氯离子检测：与正常组没有给药的MDCK细胞相比，绿原酸甲酯组的氯离子浓度显著降低(P<0.05)。显示出绿原酸甲酯具有抑制氯离子跨细胞转运的作用。
表4不同时间点石韦提取单体坝巴酸、绿原酸甲酯、山奈酚和氢氯噻嗪对Cl-转运影响(n＝3，
Figure BDA0002548872490000241
)
Figure BDA0002548872490000242
与同时间段模型组相比，*P<0.05。
3.1.2对钠离子转运影响
实验结果如表5，在给氯化钠孵育30min后，于给氯化钠的细胞对侧取各组细胞培养液各50微升，进行钠离子检测：与模型组没有给药的MDCK细胞相比，氢氯噻嗪组、绿原酸甲酯组的细胞培养液中钠离子浓度显著降低(P<0.05)，显示氢氯噻嗪、绿原酸甲酯具有抑制钠离子跨细胞转运的作用。
在给氯化钠孵育4小时后，于给氯化钠的细胞对侧取各组细胞培养液各50微升，进行钠离子检测：与正常组没有给药的MDCK细胞相比，各组钠离子浓度均无显著性差异。
表5不同时间点石韦提取单体坝巴酸、绿原酸甲酯、山奈酚和氢氯噻嗪对Na+转运影响(n＝3，
Figure BDA0002548872490000243
)
Figure BDA0002548872490000244
与同时间段模型组相比，*P<0.05。
3.1.3 Petiolide A(1)、氢氯噻嗪对氯离子转运影响
实验结果如表6所示，与模型组相比，在给予氯化钠1小时，petiolide A(1)(50umol/L)和氢氯噻嗪组氯离子转运显著降低(P<0.05)；在给予氯化钠3小时时，氢氯噻嗪组氯离子转运显著降低(P<0.05)。
表6 Petiolide A(1)、氢氯噻嗪对氯离子转运影响(n＝3，
Figure BDA0002548872490000245
)
Figure BDA0002548872490000246
Figure BDA0002548872490000251
与同时间段模型组相比，*P<0.05。
结论：有柄石韦利尿作用功效物质基础的四个化学成分为：坝巴酸、绿原酸甲酯、山奈酚、Petiolide A。
3.2石韦提取单体通淋作用筛选
石韦提取单体对LPS诱导的MDCK细胞损伤的保护作用。
为了筛选出石韦提取单体中具有通淋活性的成分，发明人选取犬肾远端小管细胞(MDCK细胞)作为研究对象，采用脂多糖(LPS)诱导形成细菌毒素造成的细胞损伤模型，研究不同石韦提取单体对犬肾细胞损伤模型的保护作用，为进一步研究石韦提取单体利尿通淋作用及其机制奠定基础。发明人对以下21种石韦提取单体的抗细胞损伤作用进行研究：
表7 21种石韦提取单体名称一览表
序号 分组
1 里白烯
2 22-羟基何伯烷
3 β-谷甾醇
4 坝巴酸
5 cycloeucalenone
6 泽屋萜
7 dryocrassol
8 Hopan-28,22-olide
9 齐墩果酸
10 22,28-epoxyhopane
11 cyclohopenol
12 cycloeucalenol
13 木栓酮
14 (23E)-cycloart-23-ene-3β,25-diol
15 (23E)-cycloart-23，25-ene-3β-ol
16 cyclolaudenol
17 11-羰基-β-乙酰乳香酸
18 绿原酸甲酯
19 2',3'-dihydroxy propylpentadecanoate
20 山柰酚
21 β-胡萝卜苷
3.2.1 LPS最佳造模浓度及给药时间的确定
通过查阅文献及前期预实验，确定了最佳LPS造模给药浓度及时间，即30ug/ml，37℃孵育24h。
3.2.2石韦不同提取单体对犬肾细胞(MDCK细胞)的毒性作用
我们研究了不同石韦提取单体在高剂量(100umol/L)时对MDCK细胞的毒性作用，为进一步研究其对LPS造成的细胞损伤保护作用奠定基础。实验结果如下：
图10中数据显示，与正常组细胞存活率为100％相比，不同石韦提取单体的在100umol/L给药孵育24小时后，细胞存活率均有所降低，但降低幅度不大，除了里白烯、22-羟基何伯烷、β-谷甾醇、泽屋萜、Hopan-28,22-olide、11-羰基-β-乙酰乳香酸的细胞存活率在60％以下，存在一定的细胞毒性，其余药物孵育下的细胞存活率均在60％以上，毒性较低。
4.不同有柄石韦提取单体对LPS诱导的犬肾细胞损伤的保护作用活性初筛
在研究了不同石韦提取单体对MDCK细胞的毒性作用之后，我们进一步采用LPS诱导造成MDCK细胞损伤模型，研究石韦不同提取单体对其保护作用。我们分别用不同石韦提取单体各100umol/L孵育MDCK细胞24小时给药，再分别采用30ug/mL和50ug/mL的LPS分别孵育单体给药过后的MDCK细胞24小时，之后对细胞进行细胞存活率检测，结果如下：
4.1 30ug/mL的LPS孵育24小时造模
由图11中数据可以看出，与正常组细胞存活率相比，模型组细胞存活率仅为50％，显示造模成功，与模型组相比，坝巴酸的细胞存活率高于模型组的50％，且有显著性差异。显示了坝巴酸的LPS细胞损伤的保护作用。
4.2 50ug/mL的LPS孵育24小时造模
由图12中数据可以看出，与正常组细胞存活率相比，模型组细胞存活率仅为50％，显示造模成功，与模型组相比，坝巴酸、齐墩果酸、(23E)-cycloart-23，25-ene-3β-ol的细胞存活率均高于模型组的50％。显示了坝巴酸、齐墩果酸、(23E)-cycloart-23，25-ene-3β-ol在LPS为50ug/mL时对细胞损伤具有一定保护作用。
5.总结：由不同石韦提取单体对犬肾细胞毒性试验和对LPS造成的细胞损伤的保护作用实验结果可知：
5.1药物毒性：不同石韦提取单体的在100umol/L给药孵育24小时后，细胞存活率均有所降低，但降低幅度不大，除了里白烯、22-羟基何伯烷、β-谷甾醇、泽屋萜、Hopan-28,22-olide、11-羰基-β-乙酰乳香酸的细胞存活率在60％以下，存在一定的细胞毒性，其余药物孵育下的细胞存活率均在60％以上，毒性较低。
5.2抗细胞损伤作用：在石韦提取单体中，坝巴酸、齐墩果酸、(23E)-cycloart-23，25-ene-3β-ol在给药浓度100umol/L给药24小时后，细胞存活率在造模30和50ug/mL造模24小时均高于模型组，且30ug/mL脂多糖造模24小时具有显著性差异。显示了坝巴酸、齐墩果酸、(23E)-cycloart-23，25-ene-3β-ol的LPS细胞损伤的保护作用。
6.petiolide A(1)通淋作用研究
6.1实验方法：
MDCK细胞接种于96孔板中，分为正常组、模型组、petiolide A(1)(100umol/L)、petiolide A(1)(50umol/L)，细胞贴壁后，除正常组和模型组外，其余每孔分别给药petiolide A(1)(浓度50和100umol/L)孵育24小时，除正常组外，其余各组每孔加LPS100ug/mL孵育24小时造成MDCK细胞损伤模型，MTT法检测各孔OD值。
6.2实验结果：
模型组细胞存活OD值与正常组相比显著降低(P<0.05)，表示MDCK细胞损伤模型造模成功。与模型组相比，petiolide A(1)(50umol/L)与模型组相比，其细胞存活率显著升高(P<0.05)，显示其具有抗细胞损伤作用。
表8不同浓度petiolide A(1)对MDCK细胞损伤保护作用(n＝4，
Figure BDA0002548872490000271
)/>
Figure BDA0002548872490000272
与正常组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05。
7、坝巴酸、绿原酸甲酯、山奈酚通淋作用研究
7.1实验方法：
MDCK细胞接种于96孔板中，分为正常组、模型组、坝巴酸组(100umol/L)、绿原酸甲酯组(100umol/L)、山奈酚组(100umol/L)，细胞贴壁后，除正常组和模型组外，其余每孔分别给予相应药液(浓度100umol/L)孵育24小时，除正常组外，其余各组每孔加LPS30ug/mL孵育24小时造成MDCK细胞损伤模型，MTT法检测各孔OD值。
7.2实验结果：
与正常组细胞存活OD值相比，模型组细胞存活OD值显著降低(P<0.05)，显示造模成功。与模型组相比，坝巴酸组细胞存活OD值显著高于模型组(P<0.05)。显示了坝巴酸对LPS细胞损伤的保护作用。
表9不同浓度petiolide A(1)对MDCK细胞损伤保护作用(n＝4，
Figure BDA0002548872490000273
)
Figure BDA0002548872490000274
与正常组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05。
7.3结论：
有柄石韦通淋作用功效物质基础的化学成分为：坝巴酸、Petiolide A(1)。
有柄石韦利尿作用功效物质基础的四个化学成分为：坝巴酸、绿原酸甲酯、山奈酚、Petiolide A(1)。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.一种有柄石韦中的化合物，其特征在于，所述化合物为：Petiolide A（1），其结构式为：
Petiolide A（1）的结构式为：
Figure QLYQS_1
。
2.一种如权利要求1所述化合物的应用，其特征在于，所述Petiolide A（1）在制备利尿通淋药物方面的应用。
3.根据权利要求2所述化合物的应用，其特征在于，所述Petiolide A（1）在制备利尿通淋药物制剂方面的应用。
4.根据权利要求3所述化合物的应用，其特征在于，所述制剂为加入药学上可接受的辅料按常规工艺制备成药学上可接受的制剂，所述药学上可接受的制剂为固体制剂或液体制剂。
5.根据权利要求4所述化合物的应用，其特征在于，所述固体制剂为颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂、散剂、冻干粉针剂；所述液体制剂为注射制剂、口服液。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101250106A (zh) * 2008-03-27 2008-08-27 北京市农林科学院 一种提取绿原酸的方法
CN101759678A (zh) * 2009-11-20 2010-06-30 南京泽朗医药科技有限公司 一种山奈酚的制备方法
CN101941961A (zh) * 2010-09-20 2011-01-12 河南科技大学 一种从凤仙花中提取分离山奈酚的方法
CN105541601A (zh) * 2015-12-14 2016-05-04 山东省分析测试中心 一种松萝中有机酸单体的分离制备方法及应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101250106A (zh) * 2008-03-27 2008-08-27 北京市农林科学院 一种提取绿原酸的方法
CN101759678A (zh) * 2009-11-20 2010-06-30 南京泽朗医药科技有限公司 一种山奈酚的制备方法
CN101941961A (zh) * 2010-09-20 2011-01-12 河南科技大学 一种从凤仙花中提取分离山奈酚的方法
CN105541601A (zh) * 2015-12-14 2016-05-04 山东省分析测试中心 一种松萝中有机酸单体的分离制备方法及应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
The crystal structure of 2-hydroxy-4......C20H24O8;Fei Chen 等;《Z. Kristallogr. NCS》;20180731;第1013-1014页 *
海绵sarcotragus sP.和中药有柄石韦的次生代谢产物的研究;王楠;《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20071115(第5期);第E057-14页 *
石韦的化学成分;水野瑞夫等;《植物学报》;19861231;第28卷(第3期);第339-340页 *
黔产有柄石韦利尿通淋有效部位化学成分研究;陈飞等;《中药材》;20191231;第42卷(第12期);第2822-2826页 *

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