CN115819241B

CN115819241B - 茵陈中分离的一种新型苯乙醇酯类化合物及其制备方法与应用

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Publication number: CN115819241B
Application number: CN202211547428.9A
Authority: CN
Inventors: 葛岚岚; 曾小斌; 谢秋杰; 李阳芳; 魏晓芳; 沈婉莹
Original assignee: Shenzhen Peoples Hospital
Current assignee: Shenzhen Peoples Hospital
Priority date: 2022-12-05
Filing date: 2022-12-05
Publication date: 2023-09-01
Anticipated expiration: 2042-12-05
Also published as: CN115819241A

Abstract

本发明公开了从茵陈中提取分离的新型苯乙醇酯类化合物及其制备方法与应用。该化合物结构式如式I所示。制备方法如下：以茵陈为原料，干燥、粉碎，经80％乙醇冷浸提取，合并提取液，减压浓缩得总浸膏；总浸膏加水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩后，得到乙酸乙酯部位；乙酸乙酯部位再经ODS、硅胶柱色谱及制备型高效液相色谱分离，得到式I化合物。上述化合物对两种人肝癌细胞株Huh‑7和HepG2均具有很好的抑制作用，IC₅₀分别为40.27和16.56μM，因此可以制成抗肝癌药物。本发明为新型抗肝癌药物提供了物质基础，有利于中药茵陈药用价值及临床应用的进一步开发。

Description

茵陈中分离的一种新型苯乙醇酯类化合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于天然药物化学技术领域，具体涉及从茵陈中分离出的一种新型苯乙醇酯类化合物及其制备方法，还涉及包含该化合物的药物制剂，以及该化合物在制备抗肝癌药物中的应用。

背景技术

肝病是危害人类健康的重大疾病，特别是肝癌。在亚洲，肝纤维化和肝硬化都是常见的慢性肝病，90％的肝硬化可转化为肝癌；而肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一种原发于肝细胞的恶性肿瘤，其平均生存时间为6-16个月，严重危害人类生命健康。全世界范围内每年新增患者超过85万，其中我国约占一半，且该比例逐年上升，是我国恶性肿瘤第二大死因。临床上治疗肝癌的技术手段主要包括手术切除、化疗、放疗等，大部分HCC患者在被确诊时已经处于中、晚期阶段，错失了手术治疗的最佳时机，只能采取药物化疗。目前，世界范围内能够提高肝癌患者生存率的临床一线药物有索拉菲尼、仑伐替尼等，但均存在药物毒性以及耐药性的问题。与化学药物不同，天然药物具有天然无毒、调节免疫、多靶点的特性，在肝癌的治疗中占有越来越重要的地位。因此，从天然产物中寻找开发新型靶点疗效高且毒性低的化疗药物是临床上治疗乙肝及肝癌的研发方向之一。

中药茵陈为菊科Asteraceae植物滨蒿Artemisia scoparia Waldst.et Kit.或茵陈蒿Artemisia capillaris Thunb.的干燥地上部分，我国各地均有分布，主产于山东、陕西、山西、河北等省，国外主要分布于日本朝鲜、蒙古等国家。茵陈味苦、辛，性微寒，无毒，归脾、胃、肝、胆经，具有清热利湿、利胆退黄之功效，可用于治疗黄疸尿少，湿温暑湿，湿疮瘙痒等症。茵陈因其疗效广泛而确切被收录于《神农本草经》《伤寒论》《金匮要略》《千金方》《本草纲目》等历代本草以及《中国药典》。

茵陈中的化学成分丰富且复杂，目前，已从中分离得到了200余个活性化合物。其中，主要包括黄酮及其苷类、色原酮类、炔烃类、酚酸类、香豆素类、萜类和木脂素类化学成分。药理研究表明，茵陈提取物及其活性成分在体内外均表现出良好的生物活性。大量研究表明，茵陈提取物具有解热、抗炎、抗脂解作用、抗氧化、抗菌、抗癌和保肝等活性。茵陈独特而显著的生物活性吸引了世界范围内众多研究者的关注，为其进一步开发利用奠定了良好的基础。此外，茵陈除药用外，也被广泛应用于食品、保健品等行业。在中国民间，现尚有以米粉作茵陈糕、团的习惯。茵陈作菜，要采二月的嫩苗，老的药用是茵陈蒿。故有"二月茵陈，五月蒿"的说法。以茵陈与煎好的鲫鱼用猛火煲一小时饮用，可有效的疏肝、清肝热，这是广东人常用的食疗汤水。煮水洗浴也是老百姓常用的保健方式。

为进一步发现结构新颖活性良好的化合物，本发明采用多种色谱分离手段，如硅胶、Sephadex LH-20、ODS柱层析及分析和制备型HPLC，并运用多种波谱技术，如核磁共振、高分辨质谱、紫外等，从中药茵陈乙酸乙酯部位中发现了1个新型苯乙醇酯类化合物，并包含了其制备方法与抗肝癌方面的应用。

发明内容

本发明的一个目的是提供从中药茵陈(Artemisia capillaris Thunb)中提取分离出的一种新型的苯乙醇酯类化合物，该化合物表现出优异的抗肝癌活性。

本发明所提供的新型苯乙醇酯类化合物，其结构式如式I所示：

该化合物的结构经检测确定为(7S)-2-羟基-2-(4-甲氧基)乙基-3,4,5-三甲氧基基苯甲酸酯。

本发明的另一个目的是提供上述式I所示的新型苯乙醇酯类化合物的制备方法。

本发明所提供的式I所示的新型苯乙醇酯类化合物的制备方法，包括下述步骤：

S1：室温下，将茵陈粉碎，并用乙醇水溶液冷浸提取，收集浸提液、减压浓缩，得总乙醇浸膏；

S2：将所述总乙醇浸膏混悬于水中，然后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，收集乙酸乙酯萃取液、减压浓缩，得乙酸乙酯浸膏(乙酸乙酯部位)；

S3：将所述乙酸乙酯部位用少量甲醇溶解，经反相色谱填料柱层析，甲醇-水(5:95～100:0，v/v)梯度洗脱，薄层色谱分析后合并相同流分后获得10个主流分(Fr.A～Fr.J)；

S4：取干燥后的含式I所示化合物的流分Fr.I，用二氯甲烷和甲醇溶解，进行硅胶柱色谱层析，二氯甲烷-甲醇(10:1～0:10，v/v)梯度洗脱，随后采用薄层TLC分析，合并相同流分后获得6个次级流分(Fr.I1～Fr.I6)；

S5：取干燥后的含式I所示化合物的次级流分Fr.I1，用甲醇溶解过滤，经过反相高效液相色谱粗分离，在保留时间为35.0-40.0min得到式I所示化合物。

作为优选，所述的步骤S1中，所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数为80％；

作为优选，所述的步骤S1中，所述冷浸提取至少进行4次，具体如冷浸提取4次；每次冷浸提取的时间为3-7天；每次冷浸提取时，所述乙醇水溶液的用量为所述茵陈质量的5-10倍。

作为优选，所述的步骤S1中，所述减压浓缩在50-55℃下进行。

作为优选，所述的步骤S2中，所述总乙醇浸膏与水的用量配比为1:1-1:1.5。

作为优选，所述的步骤S2中，所述石油醚或乙酸乙酯或正丁醇的用量为总乙醇浸膏质量的3-5倍。

作为优选，所述的步骤S3中，反相色谱填料为十八烷基硅烷键合硅胶(ODS)。

作为优选，所述的步骤S4中，所述含式I所示化合物的流分Fr.I收集的是所述甲醇-水(5:95～100:0，v/v)梯度洗脱中75％甲醇水的洗脱组分。

作为优选，所述的步骤S4中，所述柱层析硅胶为200～300目的柱层析硅胶。

作为优选，所述的步骤S5中，所述含式I所示化合物的次级流分Fr.I1收集的是所述二氯甲烷-甲醇(10:1～0:10，v/v)梯度洗脱中二氯甲烷：甲醇＝5：1(v/v)的洗脱组分。

作为优选，所述的步骤S5中，所述反相高效液相色谱的色谱条件为：RP-18制备液相色谱柱规格Cosmosil 5C18-MS-II，5μm，20×250mm，流速：8mL/min，检测波长：254nm，流动相为体积百分含量为66％的甲醇水溶液。

本发明的再一个目的是提供上述式I所示的新型苯乙醇酯类化合物的应用。

所述应用包括下述至少一方面：1)在制备肝癌细胞增殖抑制剂中的应用；2)在制备预防和/或治疗肝癌药物中的应用。

所述肝癌细胞具体可为肝癌Huh7细胞、HepG2细胞。

以上述式I化合物为活性成分制备的肿瘤细胞增殖抑制剂、预防和/或治疗肝癌的药物也属于本发明的保护范围。

本发明第四方面还提供了一种药物制剂。

本发明所提供的药物制剂，其包含治疗有效量的式I所示的苯乙醇酯类化合物及药学上可接受的载体。

值得说明的是，所述药学上可接受的载体例如选自稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、润滑剂、崩解剂、吸收促进剂以及表面活性剂中的一种或几种。

优选地，上述药物制剂的剂型选自以下任一种：片剂，胶囊剂，丸剂，颗粒剂，混悬剂，口服液，涂剂，巴布剂，喷雾剂，粉针剂和水针剂。又如，当上述药物制剂采用注射剂时，所述注射剂可以是皮下注射剂、腹腔注射剂、肌肉注射剂以及静脉注射剂中的任一种。

本发明提供的化合物结构全新，具有很好的抗肝癌活性。该化合物对两种人肝癌细胞株Huh-7和HepG2均具有很好的抑制作用，IC₅₀分别为40.27和16.56μM，因此可以制成新型抗肝癌药物。本发明为新型抗肝癌药物提供了物质基础，有利于中药茵陈药用价值及临床应用的进一步开发。

附图说明

图1为本发明化合物的核磁共振¹H NMR图；

图2为本发明化合物的核磁共振¹³C NMR与DEPT图；

图3为本发明化合物的二维核磁共振¹H-¹H COSY图；

图4为本发明化合物的二维核磁共振HSQC谱图；

图5为本发明化合物的二维核磁共振HMBC谱图；

图6为本发明化合物的二维核磁共振NOESY谱图；

图7为本发明化合物的高分辨质谱图；

图8为本发明化合物的主要¹H-¹H COSY,HMBC信号图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施方式。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从公开商业途径获得。

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。

实施例一：化合物的结构式

根据本发明所述的新型苯乙醇酯类化合物，其具有如下式I所示的结构式：

实施例二：式I化合物的提取分离

在室温下，将晾干的茵陈(约7.0kg)粉碎，用体积分数80％的乙醇水溶液(140L)冷浸提取4次(每次提取1周)，合并提取液，接着，55℃下减压回收溶剂，浓缩得1.4kg总乙醇浸膏；将1.4kg总乙醇浸膏混悬于2L水，依次用石油醚(6L)、乙酸乙酯(6L)和正丁醇(6L)萃取，萃取液减压浓缩后，得到石油醚部位94g、乙酸乙酯部位114g、正丁醇部位401g和水部位667g。取上述乙酸乙酯部位114g，用少量甲醇溶解备用。ODS填料装柱，湿法上样，甲醇-水(5:95～100:0，v/v)梯度洗脱，经薄层色谱跟踪合并，合并相同流分后获得10个主流分(Fr.A～Fr.J)。

取干燥后的流分Fr.I(75％甲醇水洗脱组分)，用二氯甲烷和甲醇(10:1，v/v)溶解，进行硅胶柱色谱层析，二氯甲烷-甲醇(10:1～0:10，v/v)梯度洗脱，随后采用薄层TLC分析，合并相同流分后获得6个次级流分(Fr.I1～Fr.I6)。

取干燥后的次级流分Fr.I1(二氯甲烷：甲醇＝5：1(v/v)的洗脱组分)，用甲醇溶解过滤，经过Rp-18高效液相色谱粗分离(Cosmosil 5C18-MS-II，5μm，20×250mm，流速：8mL/min，波长：254nm)，流动相为甲醇：水(66：34,v/v)，在保留时间为36.8min左右得到该化合物。

实施例三：化合物的结构鉴定

黄色油状，HR-ESI-TOF-MS(positive)给出准分子离子峰385.1203[M+Na]⁺，提示其分子量为362；结合¹H和¹³C NMR(表1)确定其分子式为C₁₉H₂₂O₇，计算不饱和度为9。

参见图1～图8，结合表1，在¹H NMR上，该化合物含有6个芳香质子氢[δ_H 7.20(2H,s,H-2and H-6),7.37(2H,d,J＝8.5Hz,H-2'and H-6'),6.92(2H,d,J＝8.5Hz,H-3'and H-5')]、1个次甲基[δ_H 4.88(1H,m,H-7')]、1个亚甲基[δ_H 4.25(2H,m,H-8')]、还有4个甲氧基信号[δ_H 3.81(6H,s,H₃-8 and H₃-10),3.74(3H,s,H₃-9'),3.73(3H,s,H₃-9)]。核磁共振碳谱及DEPT谱显示，该化合物含有19个碳信号，分别归属为12个芳香碳、4个甲氧基、1个羰基、1个次甲基以及1个亚甲基。¹H–¹H COSY谱图显示该化合物存在3个自旋耦合体现(图8中蓝色线条)。结合¹H NMR、¹³C-NMR以及高分辨质谱分析，该化合物还含有1个羟基和1个羰基。HMBC谱中显示δ_H H-2'(δ_H 7.37)与δ_C 69.8(C-7')处的耦合证明这个羟基连接在C-7'位，而δ_HH-2(δ_H 7.20)与δ_C 165.1(C-7)处的耦合证明羰基是在C-1位。此外，四个甲氧基分别连在C-3、C-4、C-5和C-4'上，这是由H-8(δ_H 3.81)和C-3，H-9(δ_H 3.73)和C-4，H-10(δ_H 3.81)和C-5，以及H-9'(δ_H 3.74)和C-4'的HMBC相关推导出的。为了确认7'-OH的构型，我们进行了旋光度测试，最终判定该化合物为7'S，因为其旋光值为[α]_D-4.6°，相似于S-suspensaside([α]_D＝-4.7°)和S-suspensaside methyl ether([α]_D＝-4.7°)。因此，该化合物被确认为(7'S)-2-羟基-2-(4-甲氧基)乙基-3,4,5-三甲氧基基苯甲酸酯。

表1式I化合物在DMSO-d₆中的¹H NMR(400MHz)和¹³C NMR(100MHz)数据

实施例四：式I所示化合物抗肝癌的作用

发明人还对式I所示新型苯乙醇酯类化合物的体外抑瘤活性进行了考察，在相关实验中所采用的瘤株为肝癌Huh7细胞和HepG2细胞。

具体实施CCK8法：将细胞接种于96孔细胞培养板，每孔200μL(含有5×10³个肿瘤细胞)，在37℃、5％CO₂培养箱中，并且在含10％FBS的DMEM培养基中，培养24h；加入不同浓度的上述化合物，继续培养48h，进行CCK8检测，计算该新型苯乙醇酯类化合物对肝癌细胞的抑制率。实验结果如下表2所示，其中以抗肝癌一线药物仑伐替尼作为阳性对照。

表2式I化合物对肝癌细胞Huh7和HepG2的抑制作用(n＝6)

通过分析数据可知，本发明化合物对肝癌细胞的抑制作用优异于阳性对照药仑伐替尼，因此表明其具有较好的抗肝癌活性。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims

1.式I所示化合物：

2.权利要求1中所述的式I所示的化合物的制备方法，包括下述步骤：

S2：将所述总乙醇浸膏混悬于水中，然后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，收集乙酸乙酯萃取液、减压浓缩，得乙酸乙酯浸膏；

S3：将所述乙酸乙酯部位用少量甲醇溶解，经反相色谱填料柱层析，甲醇-水进行梯度洗脱，合并相同流分后获得10个主流分，Fr.A～Fr.J；所述甲醇-水的比例为1:10～10:0，v/v，

S4：取干燥后的含式I所示化合物的流分Fr.I，用二氯甲烷和甲醇溶解，进行硅胶柱色谱层析，二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，随后采用薄层TLC分析，合并相同流分后获得6个次级流分，Fr.I1～Fr.I6；所述二氯甲烷-甲醇的比例为10:1～0:10，v/v，

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤S1中，所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数为80％；

所述的步骤S1中，所述冷浸提取至少进行4次；每次冷浸提取的时间为3-7天；每次冷浸提取时，所述乙醇水溶液的用量为所述茵陈质量的5-10倍；

所述的步骤S1中，所述减压浓缩在50-55℃下进行；

所述的步骤S2中，所述总乙醇浸膏与水的用量配比为1:1-1:1.5；

所述的步骤S2中，所述石油醚或乙酸乙酯的用量为总乙醇浸膏质量的3-5倍。

4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤S3中，反相色谱填料为ODS。

5.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤S4中，所述柱层析硅胶为200～300目的柱层析硅胶。

6.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤S5中，所述反相高效液相色谱的色谱条件为：RP-18制备液相色谱柱规格Cosmosil 5C18-MS-II，5μm，20×250mm，流速：8mL/min，检测波长：254nm，流动相为体积百分含量为66％的甲醇水溶液。

7.权利要求1中所述的式I所示的化合物在制备肝癌细胞增殖抑制剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述肝癌细胞为肝癌Huh7细胞或HepG2细胞。

9.权利要求1中所述的式I所示的化合物在制备预防和/或治疗肝癌药物中的应用。

10.一种药物制剂，其包含治疗有效量的权利要求1所述的式I所示化合物及药学上可接受的载体。

11.根据权利要求10所述的药物制剂，其特征在于：所述药物制剂的剂型选自以下任一种：片剂，胶囊剂，丸剂，颗粒剂，混悬剂，口服液，涂剂，巴布剂，喷雾剂，粉针剂和水针剂。