CN109553623B - 一种单萜类化合物及其提取方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于天然药物化学技术领域，具体涉及一种单萜类化合物，其结构式为：

并涉及所述单萜类化合物的提取方法，还涉及所述单萜类化合物在制备治疗肝癌药物与抗乙肝病毒药物中的应用，以及提供了一种药物制剂。该单萜类化合物Japopenoid A的提取方法的步骤简单，易于操作；该单萜类化合物Japopenoid A的毒副作用较小，既表现出很好的抗肝癌效果，又表现出显著的抗乙肝病毒作用，从而能够为肝癌及乙肝患者提供新的治疗药物及治疗途径。因此，本发明所述的单萜类化合物Japopenoid A与包含该单萜类化合物Japopenoid A的药物制剂均具有广阔的临床应用前景，今后可被开发成市场上新的抗肝癌药物或/和抗乙肝病毒药物。

Description

一种单萜类化合物及其提取方法和应用

技术领域

本发明属于天然药物化学技术领域，具体涉及一种单萜类化合物，并涉及所述单萜类化合物的提取方法，还涉及所述单萜类化合物在制备治疗肝癌药物与抗乙肝病毒药物中的应用，以及提供了一种药物制剂。

背景技术

众所周知，肝病是危害人类健康的重大疾病。在亚洲，肝纤维化和肝硬化都是常见的慢性肝病，研究表明，90％的肝硬化可转化为肝癌。

肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一种原发于肝细胞的恶性肿瘤，其平均生存时间为6-16个月，严重危害人类生命健康。据统计，全世界每年约有78.2万人罹患肝癌，分别位列癌症疾病中男性发病率和女性发病率的第5位和第7位，死亡率则分别高居第2位和第6位。在我国，HCC也是常见高发的恶性肿瘤之一，数据显示，我国肝癌患者数约占全球总患者数的50％，排在肿瘤发病率的第二位。通过大数据分析和研究发现，肝癌大多数是由乙肝病毒(HBV)感染形成乙型肝炎发展而来，在这个过程中还伴有肝纤维化和肝硬化等病症。因此，如何有效预防和治疗高发性的乙肝病毒以及伴随生成的肝癌已经成为各国政府及相关医疗机构都需共同承担和亟需解决的重大难题。

目前，手术切除被认为是早期肝细胞癌的最佳治疗方案，但是，晚期患者只能选择化疗，并伴随术后复发率高和肝功能损伤大的缺点。即便如此，传统的化学治疗方法并没有显著延长肝癌患者的总体生存期，大量数据表明，其五年生存率仅为7％。临床上，对于HBV的控制主要是以接种疫苗预防为主，尽管疫苗效果明显，然而，一旦感染乙肝病毒，则只能终身携带，不能治愈，况且目前的治疗效果不尽令人满意。现有的治疗肝癌的化学药物除药物疗效不佳外，其药物毒性及长期使用所产生的耐药性等缺陷同样亟需克服。然而，与化学药物不同，天然药物具有天然无毒、调节免疫、多靶点的特性，并且在肝癌的治疗中占有越来越重要的地位。因此，如何从合适种类的动植物或矿物中寻找到并提取出疗效高且毒性低的化疗药物是临床上治疗乙肝及肝癌的热点研发方向之一。

植物提取物是以植物为原料，按照对提取的最终产品的用途的需要，经过物理化学提取分离过程，定向获取和浓集植物中的某一种或多种有效成分，而不改变其有效成分结构而形成的产品。按照提取植物的成份不同，一般可获得甙、酸、多酚、多糖、萜类、黄酮、生物碱等；按照性状不同，又可分为植物油、浸膏、粉、晶状体等种类。

金银花(Flos Lonicerae Japonicae)是忍冬科忍冬属植物忍冬(Lonicerajaponica Thunb.)的干燥花蕾或带初开的花，药用历史悠久，首载于梁代陶弘景的《名医别录》中，其为常用中药品种之一；此外，金银花在日常生活中还可用于食疗，如人们经常饮用的金银花茶等。近期的药物化学研究表明，金银花含有丰富的萜类化合物，且其中的某些萜类化合物在抗病毒方面具有较好的疗效。

发明内容

本发明旨在从金银花中提取有效的活性化合物，以提供一种全新的天然化合物，该天然化合物为一种单萜类化合物。发明人在实施一系列实验后意外地发现该单萜类化合物除了具有很好的抗肝癌活性之外，还表现出显著的抗乙肝病毒作用，并且该单萜类化合物具有高效、低毒的优点。因此，该单萜类化合物可作为治疗肝病的先导化合物，有利于相关临床新药的开发，同时，该单萜类化合物本身亦可用于制备抗肝癌药物和/或抗乙肝病毒药物，从而具有广阔的临床应用前景。

具体地，本发明第一方面提供了一种单萜类化合物，其具有以下结构式(I)：

并且，通过一系列检测分析，所述单萜类化合物的结构得到了表征与确认，依据系统命名法可知其名称为：(5R,6S,9R)-3,6,9-trimethyl-10,12-dioxa-tricy clo[7.2.1.0^1,6]dodec-3-en-5-one；据此，发明人将其简称为Japopenoid A。

同时，本发明第二方面提供了第一方面所述的单萜类化合物的提取方法，具体包括以下步骤：

S1：在室温下，用75％乙醇对金银花进行多次冷浸、渗漉提取，合并提取液后，减压回收溶剂，浓缩以制得乙醇浸膏；

S2：将所述乙醇浸膏混悬于水，然后分别用环己烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，以分别制得环己烷浸膏，乙酸乙酯浸膏和正丁醇浸膏；

S3：取所述乙酸乙酯浸膏，用氯仿和甲醇溶解，并用柱层析硅胶进行拌样，装柱，上样，接着进行梯度洗脱；采用TLC分析，合并相同流分后获得20个组分E1～E20；

S4：取组分E3，用二氯甲烷和甲醇溶解，进行第一次Sephadex LH-20(23×750mm)柱层析，其中采用洗脱剂进行等度洗脱；采用TLC分析，合并相同流分后获得7个组分：E3A，E3B，E3C，E3D，E3E，E3F和E3G；

S5：取组分E3F，用二氯甲烷和甲醇溶解，进行第二次Sephadex LH-20(23×750mm)柱层析，其中采用洗脱剂进行等度洗脱；采用TLC分析，合并相同流分后获得6个组分E3F1～E3F6；

S6：取组分E3F4，用甲醇溶解、过滤，然后进行高效液相色谱分离，收集保留时间为20～22min的流分，从而得到所述单萜类化合物Japopenoid A。

优选地，在上述提取方法中，在S3中所述的梯度洗脱包括：依次用二氯甲烷、体积比为100：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为50：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为25：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为15：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为5：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为2：1的二氯甲烷-甲醇、甲醇实施洗脱。

优选地，在上述提取方法中，在S4和S5中所述的洗脱剂为体积比8：2的二氯甲烷-甲醇。

优选地，在上述提取方法中，在S6中所述的高效液相色谱分离的条件包括：

RP-18制备液相色谱柱规格：Cosmosil 5C₁₈-MS-II，5μm，20×250mm；

检测波长：254nm；

流动相：体积比为53：47的甲醇-水，流速为8mL/min。

优选地，在上述提取方法中，所述柱层析硅胶的粒径为100～200目。

并且，本发明第三方面提供了第一方面所述的单萜类化合物在制备治疗肝癌药物中的应用。

本发明第四方面提供了第一方面所述的单萜类化合物在制备抗乙肝病毒药物中的应用。

本发明第五方面还提供了一种药物制剂，其包含治疗有效量的第一方面所述的单萜类化合物和药学上可接受的载体。值得说明的是，所述药学上可接受的载体例如选自稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、润滑剂、崩解剂、吸收促进剂以及表面活性剂中的一种或几种。

优选地，上述药物制剂的剂型选自以下任一种：片剂，胶囊剂，丸剂，颗粒剂，混悬剂，口服液，涂剂，巴布剂，喷雾剂，粉针剂和水针剂。又如，当上述药物制剂采用注射剂时，所述注射剂可以是皮下注射剂、腹腔注射剂、肌肉注射剂以及静脉注射剂中的任一种。

综上所述，本发明所提供的技术方案具有以下有益效果：

首先，所述单萜类化合物Japopenoid A的提取方法的步骤简单，易于操作；其次，所述单萜类化合物Japopenoid A作为一种天然小分子化合物，对正常细胞毒性较低，因此毒副作用较小，既表现出很好的抗肝癌效果，又表现出显著的抗乙肝病毒作用，从而能够为肝癌及乙肝患者提供新的治疗药物及治疗途径。此外，通过相关实验证实，所述单萜类化合物Japopenoid A具有有效剂量适中，疗效显著，毒副作用小等优点，因此，本发明所述的单萜类化合物Japopenoid A与包含该单萜类化合物Japopenoid A的药物制剂均具有广阔的临床应用前景，今后可被开发成市场上新的抗肝癌药物或/和抗乙肝病毒药物。

附图说明

图1为单萜类化合物Japopenoid A的核磁共振¹H NMR图；

图2为单萜类化合物Japopenoid A的核磁共振¹³C NMR与DEPT图；

图3为单萜类化合物Japopenoid A的二维核磁共振¹H-¹H COSY图；

图4为单萜类化合物Japopenoid A的HSQC谱图；

图5为单萜类化合物Japopenoid A的HMBC谱图；

图6为单萜类化合物Japopenoid A的NOESY谱图；

图7为单萜类化合物Japopenoid A的结构式图；其中，(A)示出了HMBC谱图相关的解析情况；(B)示出了NOESY谱图相关的解析情况；(C)示出了单萜类化合物Japopenoid A的球棍模型，示意性地表现出其立体构型；

图8为单萜类化合物Japopenoid A的理论计算值与实验检测结果图；其中，(A)示出了其电子圆二色谱值(ECD)；(B)示出了其紫外吸收度(Abs)；

图9为单萜类化合物Japopenoid A的高分辨质谱图；

图10为单萜类化合物Japopenoid A和对照组(control)在实验第3天的体外HBV活性；其中，(A)示出了HBsAg的相对水平含量；(B)示出了HBeAg的相对水平含量(***p＜0.001与对照组相比)；(C)示出了HBV DNA的相对水平含量。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施方式。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从公开商业途径获得。

根据本发明的第一方面的单萜类化合物Japopenoid A，其结构式如下所示：

在本发明的一个优选实施方式中，该单萜类化合物Japopenoid A通过以下步骤从金银花中提取获得：

S1：在室温下，用75％乙醇对金银花进行多次冷浸、渗漉提取，合并提取液后，减压回收溶剂，浓缩以制得乙醇浸膏；

S2：将所述乙醇浸膏混悬于水，然后分别用环己烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，以分别制得环己烷浸膏，乙酸乙酯浸膏和正丁醇浸膏；

S3：取所述乙酸乙酯浸膏，用氯仿和甲醇(体积比10:1)溶解，并用柱层析硅胶(100～200目)进行拌样，用二氯甲烷溶解该硅胶装柱，并用二氯甲烷平衡柱子至硅胶面不再下降，完成干法上样，接着进行梯度洗脱；采用TLC分析，合并相同流分后获得20个组分E1～E20；

S4：取组分E3，用二氯甲烷和甲醇(体积比8:2)溶解，进行第一次Sephadex LH-20(23×750mm)柱层析，其中采用洗脱剂(体积比8：2的二氯甲烷-甲醇)进行等度洗脱；采用TLC分析，合并相同流分后获得7个组分：E3A，E3B，E3C，E3D，E3E，E3F和E3G；

S5：取组分E3F，用二氯甲烷和甲醇(体积比8:2)溶解，进行第二次Sephadex LH-20(23×750mm)柱层析，其中采用洗脱剂(体积比8：2的二氯甲烷-甲醇)进行等度洗脱；采用TLC分析，合并相同流分后获得6个组分E3F1～E3F6；

S6：取组分E3F4，用甲醇溶解、过滤，然后进行高效液相色谱分离，收集保留时间为21.9min左右的流分，即得所述单萜类化合物Japopenoid A。

当然，本发明所述的单萜类化合物Japopenoid A还可由其它提取工艺或化学合成方法制得。

在一个进一步优选的实施方式中，S3中所述的梯度洗脱包括：依次用二氯甲烷、体积比为100：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为50：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为25：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为15：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为5：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为2：1的二氯甲烷-甲醇、甲醇实施洗脱。

在一个进一步优选的实施方式中，S6中所述的高效液相色谱分离的条件包括：

RP-18制备液相色谱柱规格：Cosmosil 5C₁₈-MS-II，5μm，20×250mm；

检测波长：254nm；

流动相：体积比为53：47的甲醇-水，流速为8mL/min。

实施例1

Japopenoid A的表征

本发明所提供的新的单萜类化合物为浅黄色油状，HR-ESI MS(positive)给出准分子离子峰m/z 223.1324[M+H]⁺，提示其分子量为222；结合氢谱和碳谱数据(详见表1)确定其分子式为C₁₃H₁₈O₃，计算不饱和度为6。

参见图1～6，通过分析可知，该单萜类化合物的碳谱提示其含有13个碳，包括三个甲基、四个亚甲基(其中有一个连氧)，一个次甲基、五个季碳(包括一个羰基、一个烯碳、两个连氧碳)。并且，氢谱及HSQC谱图显示该化合物含有18个相关质子氢信号，分别为三个甲基[δ_H 1.84(3H,s,H-11),1.14(3H,s,H-12),和1.43(3H,s,H-13)]、三个亚甲基[δ_H 2.43(2H,m,H-4a,7a),1.97(1H,s,H-4b),2.02(1H,s,H-8a),1.90(1H,d,J＝4.4Hz,H-8b),1.77(1H,d,J＝4.7Hz,H-7b)]、一个连氧的亚甲基[δ_H 3.73(1H,s,H-10a)和3.35(1H,s,H-10b)]以及一个次甲基[δ_H 5.72(1H,s,H-2)]。通过对¹H-¹H COSY谱图的仔细分析，发现该化合物包含三种自旋系统。第一个自旋系统包含一个烯氢(H-2)和一个亚甲基(H-4)。HMBC谱图上显示H-2(δ_H 5.72)与C-4和C-5有相关，而H_ax-4(δ_H2.43)与C-1和C-6相关，H_eq-4(δ_H 1.97)与C-1和C-5有耦合，这说明该化合物含有一个3,5,6-三取代的环己烯酮。第二个自旋系统包含两个亚甲基(H-7和H-8)。HMBC谱图还提示H-7与C-6和C-8有相关，H-8与C-6和C-7有相关，根据碳的性质，这说明第二个环是一个六元氧环，并与第一个环共用C-5/C-6；第三个自旋系统仅包含一个连氧的亚甲基(H-10)。根据H-10与C-9的HMBC关系，以及C-9和C-10的氧化性质，揭示了在C-9和C-10之间应该有一个oxo桥。此外，H-10与C-4、C-5和C-6在HMBC谱图上都有相关，说明C-5与C-10相连。将上述信息详细分析，可推测该化合物是一种具有两个环氧环的三环单萜类化合物。此外，三个甲基分别连在C-3、C-6和C-9上，这是由H-11(δ_H1.84)和C-2、C-3和C-5，H-12(δ_H 1.14)和C-4、C-5和C-6，H-13(δ_H 1.43)和C-8和C-9的HMBC相关推导出的。

因此，综合以上信息，可知该化合物的结构如图7(A)所示。用¹H-¹H COSY相关、NOESY相关以及与类似化合物的物理和光谱数据的比较阐明了该化合物的立体中心的相对构型如图7(B)所示。据此可知，该单萜类化合物的所有立体中心的相对构型为5R、6S、9R。

为了进一步证明上述相对立体化学判断的正确性，发明人用Gaussian 09软件计算了该单萜类化合物的所有构型，其最低能量优化几何构象如图7(C)所示，与上述核磁共振波谱一致。此外，电子圆二色谱(ECD)和UV的理论计算结果与实验确定的结果也是非常吻合的。因此，该单萜类化合物的最终结构确定为：(5R,6S,9R)-3,6,9-trimethyl-10,12-dioxa-tricyclo[7.2.1.0^1,6]dodec-3-e n-5-one，简称Japopenoid A。

具体地，单萜类化合物Japopenoid A的核磁数据如下表1所示(可同时参见图1和2)，并且其在气态时的稳定构型数据如表2所示：

表1 Japopenoid A在d₆-DMSO中的

¹H NMR(400MHz)和¹³C NMR(100MHz)数据

表2基于B3LYP/6-31G(d,p)基组优化的Japopenoid A分子在气态时的稳定构型数据

实施例2

Japopenoid A的制备

在室温下，用75％乙醇对6.5kg金银花(晾干的)进行3次冷浸、渗漉提取，合并提取液，接着，在55℃下减压回收溶剂，浓缩以制得乙醇浸膏1500g；将所述乙醇浸膏混悬于3.5L水中，然后分别用等体积的环己烷、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取三次，分别收集各萃取液并浓缩，分别制得130.3g环己烷浸膏，93.7g乙酸乙酯浸膏和199.8g正丁醇浸膏；取83.0g所述乙酸乙酯浸膏，用氯仿和甲醇(10:1，500ml)溶解，称取120g柱层析硅胶(100-200目)进行拌样，另称取1500g柱层析硅胶(100-200目)，用二氯甲烷溶解该硅胶并装柱，并用二氯甲烷平衡柱子至硅胶面不再下降，干法上样，其中该硅胶柱的规格为10×120cm；再依次用二氯甲烷(50L)、体积比为100：1的二氯甲烷-甲醇(50L)、体积比为50：1的二氯甲烷-甲醇(50L)、体积比为25：1的二氯甲烷-甲醇(50L)、体积比为15：1的二氯甲烷-甲醇(50L)、体积比为5：1的二氯甲烷-甲醇(50L)、体积比为2：1的二氯甲烷-甲醇(50L)、甲醇(10L)实施梯度洗脱，并且，控制流速为1300mL/h，接取各流分；采用TLC分析，合并相同流分后获得20个组分E1～E20。

然后，取6.90g组分E3(由体积比为100：1的二氯甲烷-甲醇洗脱得到)，用二氯甲烷和甲醇(8:2，5ml)溶解，并进行第一次Sephadex LH-20(23×750mm)柱层析，使用的洗脱剂为2000mL二氯甲烷-甲醇(体积比8：2)，等度洗脱，流速为3mL/min，每接5mL为一个流分；采用TLC分析，合并相同流分后获得7个组分：E3A，E3B，E3C，E3D，E3E，E3F和E3G；取2.4g上述组分E3F，用二氯甲烷和甲醇(8:2，1ml)溶解，进行第二次Sephadex LH-20(23×750mm)柱层析，其中使用的洗脱剂为500mL二氯甲烷-甲醇(体积比8：2)，等度洗脱，合并相同流分后获得6个组分E3F1～E3F6；最后，取组分E3F4(0.2g)，用甲醇溶解、过滤，进行高效液相色谱分离，在保留时间为21.9min得到该单萜类化合物Japopenoid A(2.94mg)；其中，所述高效液相色谱分离的条件包括：

RP-18制备液相色谱柱规格：Cosmosil 5C₁₈-MS-II，5μm，20×250mm；

检测波长：254nm；

流动相：甲醇：水(53：47,v/v)，流速为8mL/min。

实施例3

Japopenoid A的体外抑瘤活性实验

发明人还对所述单萜类化合物Japopenoid A的体外抑瘤活性进行了考察，在相关实验中所采用的瘤株为肝癌HepG2细胞和SMCC 7721细胞。

具体实施MTT法：将细胞接种于96孔细胞培养板，每孔200μL(含有2.5×10⁴个肿瘤细胞)，在37℃、5％CO₂培养箱中，并且在含10％FBS的RPMI1640培养基中，培养24h；加入不同浓度(200、100、50、25、12.5和6.25)的单萜类化合物Japopenoid A，继续培养48h；实验结束前4h加20μL的MTT(5mg/mL)，继续在37℃、5％CO₂条件下孵育4h，吸取培养液后加入二甲基亚砜150μL，振摇至结晶完全溶解，然后于酶标仪检测其吸光度，检测波长570nm，参考波长630nm，计算该单萜类化合物Japopenoid A对肝癌细胞的抑制率。实验结果如下表3所示，其中以黄酮Quercetin(槲皮素)作为阳性对照。

表3Japopenoid A对肝癌细胞HepG2和SMCC 7721以及人胚肝细胞LO-2的抑制作用(n＝6)

其中，实验结果为均值±SD(n＝6)。

通过分析数据可知，该单萜类化合物Japopenoid A对肝癌细胞的抑制作用与阳性对照槲皮素效果相近，因此表明其具有一定抗肝癌活性。

实施例4

Japopenoid A的体外抗乙肝病毒实验

发明人还实施了单萜类化合物Japopenoid A的体外抗HBV(乙型肝炎病毒)试验，其中所采用的细胞株为HepG 2.2.15细胞。值得说明的是，HepG 2.2.15细胞载有HBV全基因组并能稳定转染的HepG 2细胞，因此能够进行病毒复制并稳定分泌感染性病毒颗粒及HBsAg和HBeAg。

具体步骤包括：将HepG 2.2.15细胞接种于24孔细胞培养板，每孔500μL(含有30×10⁴个肿瘤细胞)，在37℃、5％CO₂培养箱中，并且在含10％FBS的DMEM培养基中，培养24h；加入100μg/ml的本发明化合物，继续在37℃、5％CO₂条件下培养；实验第3天收集培养基上清。ELISA法测定培养基上清中的HBsAg和HBeAg含量，PCR法测定HBV DNA含量。

上述实验结果如图10所示，由此可知，所述单萜类化合物Japopenoid A具有较好的体外抗HBV活性，特别是对HBeAg的抑制率达到了-14％(p<0.001)，因此，所述单萜类化合物Japopenoid A能够为肝炎患者提供新的治疗药物及治疗途径。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种单萜类化合物，其特征在于，具有以下结构式(I)：

2.一种根据权利要求1所述的单萜类化合物的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：在室温下，用75％乙醇对金银花进行多次冷浸、渗漉提取，合并提取液后，减压回收溶剂，浓缩以制得乙醇浸膏；

S2：将所述乙醇浸膏混悬于水，然后分别用环己烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，以分别制得环己烷浸膏，乙酸乙酯浸膏和正丁醇浸膏；

S3：取所述乙酸乙酯浸膏，用氯仿和甲醇溶解，并用柱层析硅胶进行拌样，装柱，上样，接着进行梯度洗脱；采用TLC分析，合并相同流分后获得20个组分E1～E20；

S4：取组分E3，用二氯甲烷和甲醇溶解，进行第一次规格为23×750mm的Sephadex LH-20柱层析，其中采用洗脱剂进行等度洗脱；采用TLC分析，合并相同流分后获得7个组分：E3A，E3B，E3C，E3D，E3E，E3F和E3G；

S5：取组分E3F，用二氯甲烷和甲醇溶解，进行第二次规格为23×750mm的Sephadex LH-20柱层析，其中采用洗脱剂进行等度洗脱；采用TLC分析，合并相同流分后获得6个组分E3F1～E3F6；

S6：取组分E3F4，用甲醇溶解、过滤，然后进行高效液相色谱分离，收集保留时间为20～22min的流分，从而得到所述单萜类化合物。

3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，在S3中所述的梯度洗脱包括：依次用二氯甲烷、体积比为100：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为50：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为25：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为15：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为5：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为2：1的二氯甲烷-甲醇、甲醇实施洗脱。

4.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，在S4和S5中所述的洗脱剂为体积比8：2的二氯甲烷-甲醇。

5.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，在S6中所述的高效液相色谱分离的条件包括：

RP-18制备液相色谱柱规格：Cosmosil 5C₁₈-MS-II，5μm，20×250mm；

检测波长：254nm；

流动相：体积比为53：47的甲醇-水，流速为8mL/min。

6.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述柱层析硅胶的粒径为100～200目。

7.根据权利要求1所述的单萜类化合物在制备治疗肝癌药物中的应用。

8.根据权利要求1所述的单萜类化合物在制备抗乙肝病毒药物中的应用。

9.一种药物制剂，其特征在于，包含治疗有效量的根据权利要求1所述的单萜类化合物和药学上可接受的载体。

10.根据权利要求9所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂的剂型选自以下任一种：片剂，胶囊剂，丸剂，颗粒剂，混悬剂，口服液，涂剂，巴布剂，喷雾剂，粉针剂和水针剂。

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