CN111087285A - 一种从铁皮石斛中提取联苄类化合物的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种从铁皮石斛中提取联苄类化合物的方法，包括：将铁皮石斛经过醇提、浓缩得到浸膏，再经过大孔树脂，以乙醇溶液进行洗脱，分别收集洗脱液，继续分离纯化即得；本发明还公开了上述首次从铁皮石斛中提取的联苄类化合物在制备用于预防或/和治疗宫颈癌或肝癌的药物中的应用以及在制备用于免疫调节和/或改善微循环和/或提高生命质量的保健品中的应用。所述联苄类化合物均为首次从铁皮石斛中提取得到且具有很好的HeLa、HepG2抑制活性该提取方法操作简单，分离效果好，易于大规模生产应用。
Description
技术领域
本发明属于中药保健食品领域，具体涉及一种从铁皮石斛中提取联苄类化合物的方法及其应用。
背景技术
铁皮石斛作为保健食品和营养品在中国和东南亚有悠久的应用历史。《中国药典》载，铁皮石斛具有“益胃生津，滋阴清热”的功效，常用于“热病津伤，口干烦渴，胃阴不足，食少干呕”。
铁皮石斛的化学成分包括多糖、联苄、生物碱、菲类、黄酮、萜类、酚酸等多种成分，现有文献中记载了大量的提取方法，例如中国发明专利申请文献CN106977482A公开了利用简单的萃取、分离、提纯提取铁皮石斛中黄酮化合物的方法；中国发明专利申请文献CN103113483A公开了一利用闪提、粗提液离心、醇沉和三脱水，以提取铁皮石斛中的活性成分多糖和生物碱，实现了铁皮石斛资源的综合利用。
现代药理学研究表明，铁皮石斛的提取物及其成分具有抗肿瘤、抗衰老、抗氧化、调节血糖、保肝等作用。癌症是危害人类生命健康的严重疾病之一，近年来肿瘤的发病率逐年上升，寻找恶性肿瘤的有效治疗方法迫在眉睫。
近年来，一些学者发现铁皮石斛的萃取物和单体具有抑制离体肿瘤细胞的活性。如李燕等人对铁皮石斛中抗肿瘤活性成分进行了体外筛选，发现联苄类化合物4,4′-二羟基-3,5-二甲氧基联苄具有抗人卵巢癌细胞株(A2780)的活性，4,4′-二羟基-3,3′,5-三甲氧基联苄具有抗人胃癌细胞株(BGC-823)和人卵巢癌细胞株(A2780)的活性。孙婧等人研究发现铁皮石斛提取物及其活性成分毛兰素对Luminal A型乳腺癌细胞具有明显的抑制效果。
目前，对铁皮石斛化学成分和药理作用的研究尚不全面和深入，现有文献中公开的从铁皮石斛中提取的化合物种类较少，为了解决上述问题，急需找到一种新的提取方法，以提取出更多对人体有益的活性化合物。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种从铁皮石斛中提取具有HeLa、HepG2抑制活性的联苄类化合物方法，该提取方法操作简单，分离效果好，易于大规模生产应用。
本发明的另一目的在于还提供了上述首次从铁皮石斛中提取的联苄类化合物在制备用于预防或/和治疗宫颈癌或肝癌的药物中的应用以及在制备用于免疫调节和/或改善微循环和/或提高生命质量的保健品中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种从铁皮石斛中提取联苄类化合物的方法，包括：将铁皮石斛经过醇提、浓缩得到浸膏，再经过大孔树脂，以乙醇溶液进行梯度洗脱，分别收集洗脱液，继续分离纯化即得；
所述联苄类化合物为下列结构中的任意一种：
上式中，Me为甲基，式(1)～(8)联苄类化合物具体命名如下：
(1)3,4-dihydroxy-5,4′-dimethoxy bibenzyl；
(2)moscatilin；
(3)4,4′-dihydroxy-3,5-dimethoxy bibenzyl；
(4)(S)-3,4,α-trihydroxy-5,4′-dimethoxy bibenzyl；
(5)gigantol；
(6)dendrocandin U；
(7)densiflorol A
(8)dendrocandin B。
上述式(1)、(2)、(4)、(5)、(7)所示结构的联苄类化合物均为首次从铁皮石斛中提取得到，且本发明的提取方法简单易行，提取得到的化合物具有很好的人体肿瘤细胞HeLa、HepG2抑制活性，应用范围及其广泛。
具体分离方法包括：将铁皮石斛经过醇提、浓缩得到浸膏，经过大孔树脂，以乙醇-水体积比依次为0：100、10：90、20：80、30：70、40：60、50：50、60：40、70：30、80：20、95：5的乙醇溶液进行梯度洗脱，每个浓度洗脱液用量为5个柱体积，分别收集乙醇-水体积比为50：50、60：40和70：30的洗脱液，继续分离纯化即得。
其中，收集乙醇-水体积比为50：50的洗脱液进行浓缩干燥，干燥样品经反相树脂柱色谱，用乙醇-水体积比为30:70～95:5的乙醇溶液依次梯度洗脱，收集体积比为50：50乙醇和水的洗脱部分，所得馏分浓缩干燥后经凝胶柱色谱，再用石油醚-乙酸乙酯体积比为11:2～7:1的洗脱剂继续梯度洗脱，收集体积比为11：2的石油醚和乙酸乙酯洗脱部分，浓缩干燥后经凝胶柱色谱，以甲醇洗脱，分别收集第一、第二色谱峰部分的洗脱液；
将第一色谱峰馏出液减压浓缩后经制备液相色谱分离，以乙腈-水的体积比为30:70的乙腈溶液为流动相，收集保留时间为55min的馏出液，浓缩、冷冻干燥得到式(1)所示的化合物；
将第二色谱峰馏出液减压浓缩经制备液相色谱分离，以乙腈-水的体积比为50：50的乙腈溶液为流动相，收集保留时间为57min的馏出液，浓缩、冷冻干燥得到式(2)所示的化合物。
其中，收集乙醇-水体积比为50：50的洗脱液进行浓缩干燥，干燥样品经反相树脂柱色谱，用乙醇-水体积比为30:70～95:5的乙醇溶液依次梯度洗脱，收集体积比为40：60乙醇和水的洗脱液，浓缩干燥后经凝胶柱色谱，以甲醇洗脱，收集第3馏分经制备液相分离，以体积比为59：41甲醇和水为流动相，流速3ml/min，收集保留时间为30min的色谱峰，减压回收溶剂，得到式(3)所示的化合物。
其中，收集乙醇-水体积比为60：40的洗脱液进行浓缩干燥，干燥样品经反相树脂柱色谱，以乙醇-水体积比为40:60～90:10的乙醇溶液进行梯度洗脱，收集体积比为60：40乙醇和水的洗脱液，所得馏分浓缩干燥后经凝胶柱色谱，以甲醇洗脱；
收集第6部分洗脱液浓缩后经制备液相色谱，以50：50体积比的乙腈和水溶液为流动相，收集36min的色谱峰部分，经浓缩冷冻干燥后得式(4)所示的化合物；
收集第7部分洗脱液浓缩后经制备液相色谱，以57:43的乙腈水溶液为流动相，分离得2个色谱峰，分别收集第一、第二色谱峰部分，经浓缩冷冻干燥分别得到式(5)、式(6)所示的化合物。
其中，收集乙醇-水体积比为60：40的洗脱液进行浓缩干燥，干燥样品经反相树脂柱色谱，以乙醇-水体积比为40:60～90:10的乙醇溶液进行梯度洗脱，收集体积比为80：20乙醇和水的洗脱液，所得馏分浓缩干燥后经凝胶柱色谱，以甲醇洗脱；
收集第4部分洗脱液浓缩后经制备液相色谱，以70：30体积比的乙腈和水溶液为流动相，收集主要的色谱峰部分，经浓缩冷冻干燥后得式(7)所示的化合物。
其中，收集乙醇-水体积比为70：30的洗脱液进行浓缩干燥，干燥样品经反相树脂柱色谱，以20：80～90:10的乙醇和水溶液进行梯度洗脱，收集60：40乙醇水溶液洗脱得到的洗脱液，所得馏分浓缩干燥后经凝胶色谱，以90：10乙醇水溶液进行洗脱，收集第6部分洗脱液，浓缩后经制备液相色谱，以50:50乙腈和水溶液为流动相，收集43min的色谱峰部分，浓缩、冷冻干燥得到式(8)所示的化合物。
本发明还公开了上述联苄类化合物在制备用于预防或/和治疗宫颈癌或肝癌的药物中的应用。
所述药物以有效量的联苄类化合物作为活性成分，加入任意药学可接受的稀释剂、辅料或媒介物，制成药物制剂；
所述的制剂包括注射液、滴注液、粉针剂、颗粒剂、片剂、冲剂、散剂、口服液、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口含剂、丸剂、膏剂、丹剂、喷雾剂、滴丸剂、崩解剂、口崩片、微丸。
本发明还公开了上述联苄类化合物在制备用于免疫调节和/或改善微循环和/或提高生命质量的保健品中的应用，其特征在于，所述保健品包含有效量的联苄类化合物以及任意保健品中可接受的载体。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明提供了一种从天然珍贵药材铁皮石斛中提取的具有HeLa、HepG2抑制活性的联苄类化合物，该提取方法操作简单，分离效果好，易于大规模生产应用，所得到的化合物均为首次从铁皮石斛中提取得到。
(2)本发明提取得到的联苄类化合物具有极强的宫颈癌、肝癌细胞抑制活性且安全无毒，因此可应用于制备宫颈癌或肝癌的药物中，又由于其对人体有益，因此还可以应用于保健品的制备中，其具有比铁皮石斛(枫斗)提取物更强的活性，制成制剂易于实现药物和保健品的质量控制，应用范围极广泛且具有极好的应用效果。
附图说明
图1为联苄类化合物(1)的1H NMR谱图；
图2为联苄类化合物(1)的13C NMR谱图；
图3为联苄类化合物(2)的1H NMR谱图；
图4为联苄类化合物(2)的13C NMR谱图；
图5为联苄类化合物(3)的1H NMR谱图；
图6为联苄类化合物(3)的13C NMR谱图；
图7为联苄类化合物(4)的1H NMR谱图；
图8为联苄类化合物(4)的13C NMR谱图；
图9为联苄类化合物(5)的1H NMR谱图；
图10为联苄类化合物(5)的13C NMR谱图；
图11为联苄类化合物(6)的1H NMR谱图；
图12为联苄类化合物(6)的13C NMR谱图；
图13为联苄类化合物(7)的1H NMR谱图；
图14为联苄类化合物(7)的13C NMR谱图；
图15为联苄类化合物(8)的1H NMR谱图；
图16为联苄类化合物(8)的13C NMR谱图。
具体实施方式
下面将结合实施例进一步详细说明本发明的实质内容和有益效果，该实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。
实施例1：化合物(1)的制备
(1)取干燥铁皮石斛11kg，用27L 95％乙醇浸泡提取2次，浸出液过滤，合并所得滤液，高速离心后用旋转蒸发仪浓缩至1.25L，继续减压回收浓药液，得到485.6g浸膏；
(2)将浸膏干法上样，过HP-20大孔树脂柱色谱(40cm×15cm)，洗脱剂为体积比为0：100～95：5的乙醇和水，每个部位洗脱5个柱体积，分别得水部位，体积比为10：90、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、95:5的乙醇和水部位；体积比为50：50的乙醇和水；体积比为60：40的乙醇和水；体积比为70：30的乙醇和水部位；
(3)收集体积比为50：50的乙醇和水洗脱液浓缩干燥后的样品，用MCI反相树脂柱(20cm×3cm)色谱，用乙醇-水溶剂体系(30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10、95:5)梯度洗脱，收集体积比为50:50的乙醇和水洗脱部分，所得馏分浓缩干燥后经Silicagel柱色谱，用石油醚和乙酸乙酯比为11:2、10:2、10:1、9:1、8:1、7:1的洗脱剂继续分离，收集体积比为11:2的石油醚和乙酸乙酯洗脱部分，浓缩干燥后经Sephadex LH-20凝胶柱(220cm×2cm)色谱(甲醇)洗脱，收集第一色谱峰部分，减压浓缩后经制备液相(C18，250mm×10mm，5μm)分离得到(1)化合物(30％乙腈，3ml/min，tR 55min)。
对化合物(1)进行结构鉴定，所用的仪器和试剂：Finnigan TSQ 700型质谱仪(美国Finnigan)；Bruker AX-600核磁共振波谱仪(瑞士布鲁克)；IR Affinity-1傅立叶变换红外色谱仪、UV-1800紫外可见分光光度计(日本岛津)，ZF-20D暗箱式紫外分析仪(上海宝山顾村电光仪器)；Anton Paar微量旋光仪(奥地利安东帕)；HSGF-254薄层层析硅胶板(烟台江友硅胶)；G/T 2354-92薄层层析硅胶H(青岛海洋化工)；色谱纯甲醇；其他所用试剂均为分析纯。
化合物(1)为白色粉末，可溶于甲醇、氯仿。样品薄层板展开后5％三氯化铁乙醇溶液显色为灰色，10％硫酸乙醇溶液显色为黑色。
1H NMR(600MHz,CD3OD)δH 7.07(2H,d,J＝6.6Hz,H-2′,6′),6.81(2H,d,J＝6.6Hz,H-3′,5′),6.30(1H,d,J＝1.8Hz,H-2),6.25(1H,d,J＝1.8Hz,H-6),3.78(3H,s,MeO-4′),3.77(3H,s,MeO-5),2.80(2H,dd,J＝8.7,6.2Hz,H-a),2.72(2H,dd,J＝8.8,6.2Hz,H-a′)；13C NMR(150MHz,CD3OD)δC159.26(C-4′),149.39(C-5),146.26(C-3),135.30(C-1′),134.07(C-1),131.50(C-4),130.47(C-2′,6′),114.61(C-3′,5′),109.9 9(C-2),105.02(C-6),56.52(MeO-5),55.64(MeO-4′),39.24(C-a),38.40(C-a′)。
结构解析表明该化合物为：3,4-dihydroxy-5,4′-dimethoxy bibenzyl。
实施例2：化合物(2)的制备
铁皮石斛的提取、浓缩、大孔树脂富集、反相树脂柱色谱、硅胶柱色谱、凝胶柱色谱的分离过程同实施例1。所不同的是经Sephadex LH-20凝胶柱色谱(甲醇)洗脱，收集第二色谱峰部分，减压浓缩后经制备液相(C18，250mm×10mm，5μm)分离得到(2)化合物(50％乙腈，tR 57min)。
化合物(2)为无色胶状物，可溶于甲醇、氯仿。样品薄层板展开后5％三氯化铁乙醇溶液显色为灰色，10％硫酸乙醇溶液显色为黑色。
1H NMR(600MHz,CD3OD)δH 6.71(1H,d,J＝8.0Hz,H-5′),6.66(1H,d,J＝1.8Hz,H-2′),6.60(1H,dd,J＝8.0,1.8Hz,H-6′),6.39(2H,s,H-2,6),3.79(9H,s,3,3′,MeO-5),2.80(4H,t,H-a,a′)；13C NMR(150MHz,CD3OD)δC 148.97(C-3,5),148.57(C-3′),145.47(C-4′),134.80(C-4),134.48(C-1′),134.03(C-1),122.04(C-6′),115.96(C-5′),113.54(C-2′),106.91(C-2,6),56.64(MeO-3),56.29(MeO-5),39.46(C-a),38.91(C-a′)。
结构解析表明该化合物为：moscatilin。
实施例3：化合物(3)的制备
步骤(1)、(2)同实施例1；
(3)收集体积比为50：50的乙醇和水洗脱液浓缩干燥后的样品，用MCI CHP-20P反相树脂柱(20cm×3cm)色谱，用乙醇-水溶剂体系(30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10、95:5)分部洗脱，收集体积比为40:60的乙醇和水洗脱部分，浓缩干燥后经Sephadex LH-20凝胶柱(220cm×2cm)色谱(甲醇)洗脱，得到4个馏分，收集第3馏分，减压浓缩后经制备液相(C18，250mm×10mm，5μm)分离，以体积比为59：41甲醇和水为流动相，流速3ml/min，收集保留时间为30min的色谱峰，减压回收溶剂，即得到(3)化合物。
化合物(3)为白色无定形粉末，可溶于甲醇、氯仿。样品薄层板展开后5％三氯化铁乙醇溶液显色为灰色，10％硫酸乙醇溶液显色为黑色。
1H NMR(600MHz,CD3OD)δH 6.94(2H,d,J＝8.5Hz,H-2′,6′),6.66(2H,d,J＝8.5Hz,H-3′,5′),6.36(2H,s,H-2,6),3.76(6H,s,MeO-3,5),2.76(4H,s,a,a′-CH2)；13C NMR(150MHz,CD3OD)δC 156.42(C-4′),148.99(C-3,5),134.06(C-1),130.58(C-1′,2′,6′,4),115.95(C-3′,5′),106.86(C-2,6),56.66(MeO-3,5),39.53(C-a),38.51(C-a′)。
结构解析表明该化合物为：4,4′-dihydroxy-3,5-dimethoxybibenzyl。
实施例4：化合物(4)的制备
步骤(1)和(2)同实施例1；
(3)收集体积比为60：40的乙醇和水洗脱液，浓缩干燥后的样品,经MCI CHP-20P反相树脂柱色谱，用乙醇-水溶剂体系(40:60～90:10)梯度洗脱，收集体积比为60:40的乙醇和水洗脱液，所得馏分浓缩干燥后经Sephadex LH-20凝胶柱色谱(甲醇)洗脱，收集第6部分洗脱液，经制备液相(C18，250mm×10mm，5μm)(60％甲醇)分离，进一步制备液相纯化(50％乙腈，流速3ml/min)，收集保留时间为36min的色谱峰洗脱液，经浓缩、冷冻干燥后得(4)化合物。
化合物(4)为白色无定形粉末，可溶于甲醇、氯仿。样品薄层板展开后5％三氯化铁乙醇溶液显色为灰色，10％硫酸乙醇溶液显色为黑色。
1H NMR(600MHz,CD3OD)δH 6.99(2H,d,J＝8.5Hz,H-2′,6′),6.75(2H,d,J＝8.5Hz,H-3′,5′),6.41(1H,d,J＝1.5Hz,H-6),6.36(1H,d,J＝1.5Hz,H-2),4.66(1H,t,J＝7.0Hz,H-a),3.76(3H,s,MeO-5),3.74(3H,s,MeO-4′),2.95(1H,dd,J＝14.0,7.0Hz,H-a′),2.83(1H,dd,J＝14.0,7.0Hz,H-a′)；13C NMR(150MHz,CD3OD)δC 159.48(C-4′),149.28(C-5),146.15(C-3),136.50(C-1),134.24(C-4),131.91(C-2′,6′),131.55(C-1′),114.43(C-3′,5′),108.00(C-2),102.85(C-6),76.87(C-a),56.53(MeO-4′),55.62(MeO-5),45.90(C-a′)。
结构解析表明该化合物为：(S)-3,4,α-trihydroxy-5,4′-dimethoxy bibenzyl。
实施例5：化合物(5)的制备
铁皮石斛的提取、过滤、浓缩、大孔树脂柱色谱富集、反相树脂柱色谱、凝胶柱色谱的分离过程同实施例4。所不同的是经Sephadex LH-20凝胶柱色谱(甲醇)洗脱，收集第7部分洗脱液，减压浓缩后经制备液相(57％甲醇)得到两个色谱峰，收集浓缩第1色谱峰馏分，进一步经制备液相分离纯化得(5)化合物(35％乙腈，tR 47min)。
化合物(5)为白色无定形粉末，可溶于甲醇、氯仿。样品薄层板展开后5％三氯化铁乙醇溶液显色为灰色，10％硫酸乙醇溶液显色为黑色。
1H NMR(600MHz,CD3OD)δH 6.69(1H,d,J＝8.5Hz,H-5′),6.67(1H,d,J＝2.0Hz,H-2′),6.60(1H,dd,J＝8.5,2.0Hz,H-6′),6.21(2H,m,H-2,6),6.18(1H,t,J＝2.0Hz,H-4),3.78(3H,s,MeO-3′),3.70(3H,s,MeO-4),2.77(2H,m,H-a),2.74(2H,m,H-a′)。13C NMR(150MHz,CD3OD)δC162.20(C-3),159.35(C-5),148.65(C-3′),145.54(C-4′),145.54(C-1),134.72(C-1′),121.89(C-6),115.99(C-5′),113.37(C-2′),109.19(C-6′),106.66(C-2),99.87(C-4),56.30(MeO-3),55.51(MeO-3′),39.61(C-a),38.49(C-a′)。
结构解析表明该化合物为：gigantol。
实施例6：化合物(6)的制备
铁皮石斛的提取、过滤、浓缩、大孔树脂柱色谱富集、反相树脂柱色谱、凝胶柱色谱、初级液相制备的分离过程同实施例5。所不同的是经制备液相(C18，250mm×10mm，5μm)(57％甲醇)得到两个色谱峰，收集浓缩第2色谱峰馏分，进一步经制备液相分离纯化得DO29化合物(57％乙腈，tR 40min)。
化合物(6)为淡黄色无定形粉，可溶于甲醇、氯仿。样品薄层板展开后5％三氯化铁乙醇溶液显色为灰色，10％硫酸乙醇溶液显色为黑色。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δH 6.96(2H,d,J＝7.4Hz,H-2′,6′),6.71(2H,s,H-2″,6″),6.69(2H,d,J＝7.4Hz,H-3′,5′),6.39(1H,s,H-2),6.34(1H,s,H-6),4.82(1H,d,J＝7.8Hz,H-7″),3.99(1H,m,H-9″a),3.88(6H,s,MeO-3″,5″),3.79(3H,s,MeO-5),3.67(1H,d,J＝12.3Hz,H-9″b),3.49(1H,dd,J＝12.3,4.6Hz,H-8″),2.78–2.72(4H,m,H-a,a′)；13C NMR(150MHz,CDCl3)δC 156.41(C-4′),149.60(C-5),149.39(C-3″,5″),145.43(C-3),135.68(C-4″),132.90(C-1),132.37(C-1′),131.12(C-4),130.48(C-2′,6′),129.50(C-1″),115.98(C-3′,5′),110.65(C-2),106.36(C-6),105.87(C-2″,6″),79.83(C-8″),77.84(C-7″),62.13(C-9″),56.83(MeO-3″,MeO-5″),56.60(MeO-5),39.15(C-a),38.23(C-a′)。
结构解析表明该化合物为：dendrocandin U。
实施例7：化合物(7)的制备
步骤(1)和(2)同实施例1；
(3)收集体积比为60：40的乙醇和水洗脱液，浓缩干燥后的样品,经MCI CHP-20P反相树脂柱色谱，用乙醇-水溶剂体系(40:60～90:10)梯度洗脱，收集体积比为80:20的乙醇和水洗脱液，所得馏分浓缩干燥后经Sephadex LH-20凝胶柱色谱(甲醇)洗脱，收集第4部分洗脱液，经制备液相(C18，250mm×10mm，5μm)分离纯化(70％乙腈，流速3ml/min)，经浓缩、冷冻干燥后得(7)化合物。
化合物(7)为白色无定形粉，可溶于甲醇、氯仿。样品薄层板展开后5％三氯化铁乙醇溶液显色为灰色，10％硫酸乙醇溶液显色为黑色。1H NMR(600MHz,CD3OD)δH 6.69(1H,d,J＝7.9Hz,H-6),6.66(1H,d,J＝1.5Hz,H-4),6.61(1H,dd,J＝7.9,1.5Hz,H-7),6.22(2H,d,J＝1.6Hz,H-6′),6.18(1H,d,J＝1.6Hz,H-4′),5.87(2H,s,H-2),3.70(3H,s,MeO-3′),2.78(2H,m,H-a),2.74(2H,m,H-a′)；13C NMR(150MHz,CD3OD)δC 162.17(C-5′),159.30(C-3′),148.89(C-3a),147.05(C-7a),145.29(C-1′),136.98(C-5),122.35(C-6),109.85(C-4),109.10(C-7),108.90(C-2′),106.63(C-6′),101.96(C-2),99.91(C-4′),55.55(MeO-3′),39.48(C-a),38.52(C-a′)。
结构解析表明该化合物为：densiflorol A。
实施例8：化合物(8)的制备
铁皮石斛的提取、过滤、浓缩、大孔树脂柱色谱富集的分离过程同实施例1。所不同的是大孔树脂柱色谱，用乙醇和水溶剂体系梯度洗脱时，收集体积比为70：30的乙醇和水洗脱液，浓缩干燥后的样品,经MCI CHP-20P反相树脂柱色谱，用乙醇-水溶剂体系(20:80～90:10)梯度洗脱，收集体积比为60:40的乙醇和水洗脱液，所得馏分浓缩干燥后经SephadexLH-20凝胶柱色谱(甲醇：水＝90:10)洗脱，收集第6部分色谱洗脱液，经制备液相(C18，250mm×10mm，5μm)(50％乙腈)纯化分离，收集43min的色谱峰部分，浓缩冷冻干燥后得(8)化合物。
化合物(8)为淡黄色无定形粉，可溶于甲醇、氯仿。样品薄层板展开后5％三氯化铁乙醇溶液显色为灰色，10％硫酸乙醇溶液显色为黑色。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δH 7.10(2H,d,J＝8.6Hz,H-2′,6′),6.83(2H,d,J＝8.6Hz,H-3′,5′),6.67(2H,s,H-2″,6″),6.51(1H,d,J＝1.9Hz,H-2),6.32(1H,d,J＝1.9Hz,H-6),4.95(1H,d,J＝8.2Hz,H-7″),3.98(1H,m,H-8″),3.90(1H,m,H-9a″),3.55(1H,m,H-9b″),3.91(6H,s,MeO-3″,MeO-5″),3.85(3H,s,MeO-5),3.79(3H,s,MeO-4′),2.86–2.83(2H,m,H-a),2.82–2.79(2H,m,H-a′)；13C NMR(150MHz,CDCl3)δC 158.00(C-4′),148.56(C-5),147.42(C-3″,5″),144.28(C-3),135.40(C-4″),134.69(C-1),133.90(C-1′),131.12(C-4),129.50(C-2′,6′),127.47(C-1″),113.89(C-3′,5′),109.68(C-2),104.96(C-6),104.25(C-2″,6″),78.44(C-8″),76.62(C-7″),61.73(C-9″),56.57(MeO-3″,MeO-5″),56.22(MeO-5),55.43(MeO-4′),38.13(C-a),37.14(C-a′)。
结构解析表明该化合物为：dendrocandin B。
抗肿瘤活性评价：
以HeLa细胞和HepG2细胞为靶点建立抗肿瘤活性评价。
分别选用HeLa细胞株和HepG2肝癌细胞株，以顺铂为阳性对照，采用MTT法对分离得到的7个联苄类化合物进行HeLa细胞和HepG2癌细胞抑制活性的初筛和复筛。
HeLa细胞和HepG2细胞采用DMEM高糖培养基(含10％胎牛血清，1％双抗)，在37℃的5％的CO2培养箱中培养。待细胞生长到对数生长期，酶解离心收集细胞，计数并调整好细胞数量，以5000个每孔的密度接种到96孔板上，各组做3复孔。细胞在96孔板中培育24小时，弃去上清液，每孔用PBS 100μl清洗。
各样品组依次加入50μg/ml的待筛选化合物。复筛时选取具有较好的肿瘤抑制活性的化合物分别配制50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、1.5625μg/ml、0.78125μg/ml、0.390625μg/ml浓度的待筛选化合物溶液，依次加入各样品组中。空白组只加培养基不加细胞和待筛选药物，扣除背景荧光OD值；阴性对照组除不加待筛选化合物外，其他与样品组一致；阳性对照组加入100μl 0.2μg/ml对照药物顺铂。
48小时后，吸去上清液，用PBS清洗。每孔避光加入100μl MTT溶液(20μl MTT和80ml DMEM)，4小时后，避光吸去上清，每孔直接加入100μl DMSO。在570nm波长下，用酶标仪检测荧光OD值。
将以上过程所得的数据，用如下的公式计算每个样品的抑制率(根据药物的浓度以及对应的抑制率，利用GraphPad Prism 7软件计算各样品肿瘤抑制作用的IC50值)。
各化合物的初筛结果与筛选出的化合物的复筛结果如下表1～3所示。
表1化合物(1)～(8)对HeLa肿瘤细胞抑制率
表2化合物(1)～(8)对HepG2肿瘤细胞抑制率
| 化合物 | 抑制率(％) | 化合物 | 抑制率(％) |
| 1 | 25.21％ | 5 | 57.02％ |
| 2 | 120.66％ | 6 | 120.66％ |
| 3 | 133.47％ | 7 | 8.68％ |
| 4 | -26.45％ | 8 | 72.31％ |
| 顺铂 | 84.30％ |
表3具有抑制HeLa肿瘤细胞活性的化合物及其IC50
| 化合物 | IC<sub>50</sub>(μM) |
| 2 | 5.1 |
| 3 | 2.6 |
| 6 | 19.4 |
| 8 | 43.9 |
应用例1
滴丸制剂的制备：称取0.1g式(1)～(7)所示化合物中的任意一种或几种与11.0g聚乙二醇-20000混合均匀，加热熔融，化料后移至滴丸滴灌中，药液滴至6～8℃液体石蜡中，除油，制得滴丸。
应用例2
冻干粉针剂的制备：称取式(1)～(7)所示化合物中的任意一种或几种0.1g、葡萄糖4.5g、硫代硫酸钠0.9g和蒸馏水1000ml，上述组分混合均匀后，分装，冷冻干燥，即得。
应用例3
口含片的制备：称取0.1g式(1)～(7)所示化合物中的任意一种或几种与350g木糖醇，200g安塞蜜，1.5g薄荷脑，5g硬脂酸镁，8g质量分数为17％淀粉浆充分搅拌混匀，过2号筛造粒，40℃热风干燥30分钟，整粒，压片，包装，即得口含片。
Claims (10)
1.一种从铁皮石斛中提取联苄类化合物的方法，其特征在于，包括：将铁皮石斛经过醇提、浓缩得到浸膏，再经过大孔树脂，以乙醇溶液进行梯度洗脱，分别收集洗脱液，继续分离纯化即得；
所述联苄类化合物为下列结构中的任意一种：
2.根据权利要求1所述的从铁皮石斛中提取联苄类化合物的方法，其特征在于，具体分离方法包括：将铁皮石斛经过醇提、浓缩得到浸膏，经过大孔树脂，以乙醇-水体积比依次为0：100、10：90、20：80、30：70、40：60、50：50、60：40、70：30、80：20、95：5的乙醇溶液进行梯度洗脱，每个浓度洗脱液用量为5个柱体积，分别收集乙醇-水体积比为50：50、60：40和70：30的洗脱液，继续分离纯化即得。
3.根据权利要求2所述的从铁皮石斛中提取联苄类化合物的方法，其特征在于，收集乙醇-水体积比为50：50的洗脱液进行浓缩干燥，干燥样品经反相树脂柱色谱，用乙醇-水体积比为30:70～95:5的乙醇溶液依次梯度洗脱，收集体积比为50：50乙醇和水的洗脱部分，所得馏分浓缩干燥后经凝胶柱色谱，再用石油醚-乙酸乙酯体积比为11:2～7:1的洗脱剂继续梯度洗脱，收集体积比为11：2的石油醚和乙酸乙酯洗脱部分，浓缩干燥后经凝胶柱色谱，以甲醇洗脱，分别收集第一、第二色谱峰部分的洗脱液；
将第一色谱峰馏出液减压浓缩后经制备液相色谱分离，以乙腈-水的体积比为30:70的乙腈溶液为流动相，收集保留时间为55min的馏出液，浓缩、冷冻干燥得到式(1)所示的化合物；
将第二色谱峰馏出液减压浓缩经制备液相色谱分离，以乙腈-水的体积比为50：50的乙腈溶液为流动相，收集保留时间为57min的馏出液，浓缩、冷冻干燥得到式(2)所示的化合物。
4.根据权利要求2所述的从铁皮石斛中提取联苄类化合物的方法，其特征在于，收集乙醇-水体积比为50：50的洗脱液进行浓缩干燥，干燥样品经反相树脂柱色谱，用乙醇-水体积比为30:70～95:5的乙醇溶液依次梯度洗脱，收集体积比为40：60乙醇和水的洗脱液，浓缩干燥后经凝胶柱色谱，以甲醇洗脱，收集第3馏分经制备液相分离，以体积比为59：41甲醇和水为流动相，流速3ml/min，收集保留时间为30min的色谱峰，减压回收溶剂，得到式(3)所示的化合物。
5.根据权利要求2所述的从铁皮石斛中提取联苄类化合物的方法，其特征在于，收集乙醇-水体积比为60：40的洗脱液进行浓缩干燥，干燥样品经反相树脂柱色谱，以乙醇-水体积比为40:60～90:10的乙醇溶液进行梯度洗脱，收集体积比为60：40乙醇和水的洗脱液，所得馏分浓缩干燥后经凝胶柱色谱，以甲醇洗脱；
收集第6部分洗脱液浓缩后经制备液相色谱，以50：50体积比的乙腈和水溶液为流动相，收集36min的色谱峰部分，经浓缩冷冻干燥后得式(4)所示的化合物；
收集第7部分洗脱液浓缩后经制备液相色谱，以57:43的乙腈水溶液为流动相，分离得2个色谱峰，分别收集第一、第二色谱峰部分，经浓缩冷冻干燥分别得到式(5)、式(6)所示的化合物。
6.根据权利要求2所述的从铁皮石斛中提取联苄类化合物的方法，其特征在于，收集乙醇-水体积比为60：40的洗脱液进行浓缩干燥，干燥样品经反相树脂柱色谱，以乙醇-水体积比为40:60～90:10的乙醇溶液进行梯度洗脱，收集体积比为80：20乙醇和水的洗脱液，所得馏分浓缩干燥后经凝胶柱色谱，以甲醇洗脱；
收集第4部分洗脱液浓缩后经制备液相色谱，以70：30体积比的乙腈和水溶液为流动相，收集主要的色谱峰部分，经浓缩冷冻干燥后得式(7)所示的化合物。
7.根据权利要求2所述的从铁皮石斛中提取联苄类化合物的方法，其特征在于，收集乙醇-水体积比为70：30的洗脱液进行浓缩干燥，干燥样品经反相树脂柱色谱，以20：80～90:10的乙醇和水溶液进行梯度洗脱，收集60：40乙醇水溶液洗脱得到的洗脱液，所得馏分浓缩干燥后经凝胶色谱，以90：10乙醇水溶液进行洗脱，收集第6部分洗脱液，浓缩后经制备液相色谱，以50:50乙腈和水溶液为流动相，收集43min的色谱峰部分，浓缩、冷冻干燥得到式(8)所示的化合物。
8.一种根据权利要求1所述的联苄类化合物在制备用于预防或/和治疗宫颈癌或肝癌的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物以有效量的联苄类化合物作为活性成分，加入任意药学可接受的稀释剂、辅料或媒介物，制成药物制剂；
所述的制剂包括注射液、滴注液、粉针剂、颗粒剂、片剂、冲剂、散剂、口服液、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口含剂、丸剂、膏剂、丹剂、喷雾剂、滴丸剂、崩解剂、口崩片或微丸。
10.一种根据权利要求1所述的联苄类化合物在制备用于免疫调节和/或改善微循环和/或提高生命质量的保健品中的应用，其特征在于，所述保健品包含有效量联苄类化合物以及任意保健品中可接受的载体。
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