CN114831900A

CN114831900A - 联苄类单体化合物在化妆品中的应用

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Publication number: CN114831900A
Application number: CN202210484488.4A
Authority: CN
Inventors: 胡江苗; 杨柳; 陈定康; 邵会艳
Original assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Priority date: 2022-05-06
Filing date: 2022-05-06
Publication date: 2022-08-02
Anticipated expiration: 2042-05-06
Also published as: CN114831900B

Abstract

本发明属于化妆品技术领域，特别涉及联苄类单体化合物在化妆品中的应用。本发明提供了联苄类单体化合物在化妆品中的应用；所述联苄类单体化合物具有式I所示结构，本发明提供的联苄类单体化合物能够通过DPPH自由基清除、激活SIRT3脱乙酰酶活性保护细胞免受紫外辐射诱导的皮肤衰老，将其可以作为功能添加剂加入化妆品中，实现抗衰老功效。

Description

联苄类单体化合物在化妆品中的应用

技术领域

本发明属于化妆品技术领域，特别涉及联苄类单体化合物在化妆品中的应用。

背景技术

铁皮石斛(Dendrobium officinale)是兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)多年生附生型草本植物，自古以来都是我国应用中药材中的名品，主要分布在安徽、浙江、湖南、福建、广西、四川、云南等地。铁皮石斛中含有多种化学物质，包括多糖、石斛碱、氨基酸、茋类、酚类、木脂素类等活性成分。

线粒体作为细胞内自由基代谢中心，被认为是阻止氧化应激发生发展的关键。研究证明，通过对线粒体内活性氧(ROS)的产生和清除进行严格调控，可以明显延缓衰老。SIRT3是主要的线粒体NAD+依赖性蛋白脱乙酰酶，在调节线粒体代谢和能量产生中起重要作用，并与运动和热量限制的有益作用有关。锰超氧化物歧化酶(MnSOD)是位于线粒体基质中的主要超氧阴离子清除酶，通过将超氧阴离子转化为过氧化氢而减少线粒体氧化应激，其活性受SIRT3介导的去乙酰化作用调节。

现有技术中均未涉及铁皮石斛中联苄类化合物具有抗衰老的作用，也未提及将其作为功能添加剂加入化妆品中。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种联苄类单体化合物在化妆品中的应用。本发明将联苄类单体化合物应用于化妆品中能够起到抗衰老的作用。

为了实现上述发明的目的，本发明提供了联苄类单体化合物在化妆品中的应用；所述联苄类单体化合物具有式I所示结构；

优选地，所述联苄类单体化合物占化妆品的质量分数为0.02％～0.08％。

优选地，所述化妆品包括抗衰老产品、紫外损伤修复产品或抗氧化产品。

优选地，所述联苄类单体化合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)用乙醇水溶液提取铁皮石斛后，进行浓缩，得到浸膏；

(2)将所述浸膏和水混合，所得溶液经乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯相；

(3)将所述乙酸乙酯相经硅胶柱层析，采用氯仿-甲醇体系进行梯度洗脱，得到第一梯度洗脱流分，命名为A流分；

(4)将所述A流分经ODS-反向柱层析，采用甲醇-水体系进行梯度洗脱，得到第二梯度洗脱流分，命名为A-2流分；

(5)将所述A-2流分经葡聚糖凝胶柱层析，所得洗脱液经ODS-反向柱层析，得到所述联苄类单体化合物。

优选地，所述氯仿-甲醇体系中氯仿和甲醇的体积比为50:1～4:1。

优选地，步骤(4)中，所述甲醇-水体系中甲醇的体积浓度为30～100％。

优选地，所述葡聚糖凝胶柱层析的洗脱剂为甲醇-水体系，所述甲醇-水体系中甲醇和水的体积比为95:5。

优选地，步骤(5)中，所述ODS-反向柱层析的洗脱剂为甲醇-水体系，所述甲醇-水体系中的甲醇和水的体积比为10:1～1:1。

优选地，所述乙醇水溶液的体积浓度为0.1～100％。

优选地，所述乙醇水溶液的体积和铁皮石斛的质量比为100～50mL：1g。

本发明提供了联苄类单体化合物在化妆品中的应用；所述联苄类单体化合物具有式I所示结构，本发明提供的联苄类单体化合物能够通过DPPH自由基清除、激活SIRT3脱乙酰酶活性保护细胞免受紫外辐射诱导的皮肤衰老，将其可以作为功能添加剂加入化妆品中，实现抗衰老功效。

附图说明

图1为基于活性氧清除能力实验所得的细胞内活性氧水平检测图；

图2为Mn-SOD酶和SIRT3酶活性检测图。

具体实施方式

本发明提供了联苄类单体化合物在化妆品中的应用，所述联苄类单体化合物式I所示结构；

本发明中，所述化妆品优选包括抗衰老产品、紫外损伤修复产品或抗氧化产品。本发明中，所述联苄类单体化合物(ZDO-6)占化妆品的质量分数优选为0.02％～0.08％，进一步优选为0.04％～0.06％。本发明对所述化妆品的配方以质量分数计，优选包括ZDO-60.05％；硬脂酸8.0％；氧化锌2.0％；自乳化单甘酯2.0％；氢化羊毛脂2.0％；液体石蜡12.0％；甘油7.0％；乳化剂1.5％；防腐剂0.2％；香精0.2％；去离子水65.05％；或优选包括ZDO-60.05％；硬脂酸1.4％；鲸蜡醇0.1％；2-乙基醇鲸蜡基硬脂酸酯1.8％；肉豆蔻酸异丙酯0.2％；2-己基-1-癸醇1.0％；液体石蜡7.5％；甘油3.0％；丙二醇8.0％；三乙醇胺1.0％；羧乙烯基聚合物0.35％；Arlacel乳化剂1652.0％；防腐剂0.2％；香精0.2％；去离子水73.2％。

本发明中，所述联苄类单体化合物的制备方法，优选包括以下步骤：

(1)用乙醇水溶液提取铁皮石斛后，进行浓缩，得到浸膏；

本发明用乙醇水溶液提取铁皮石斛后，进行浓缩，得到浸膏。

本发明中，所述铁皮石斛优选为铁皮石斛茎粉末；所述铁皮石斛茎粉末的获取优选包括将铁皮石斛茎依次干燥和粉碎。

本发明中，所述乙醇水溶液的体积浓度优选为0.1～100％，进一步优选为50～85％。本发明中，所述乙醇水溶液的体积和铁皮石斛的质量比优选为100～50mL：1g。

本发明中，所述提取的方式优选为浸泡或回流；当所述提取的方式为浸泡时，所述浸泡的温度优选为20～30℃，进一步优选为25～30℃；所述浸泡的时间优选为12～48h，进一步优选为20～30h。本发明中，当所述提取的方式为回流时，所述回流的温度优选为25～80℃，进一步优选为72～78℃；所述回流的时间优选为1～5h，进一步优选为2～4h。所述提取的次数优选为2～3次，本发明优选将提取所得提取液合并处理。

本发明中，所述浓缩优选为减压浓缩。本发明对所述减压浓缩的参数不做具体限定，采用本领域技术人员熟知的参数进行调整以得到浸膏即可。

得到浸膏后，将所述浸膏和水混合，所得溶液经乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯相。

本发明中，所述浸膏的质量和水的体积比优选为1～10g：100～200mL，进一步优选为1～10g：120～180mL。本发明中，所述溶液和乙酸乙酯的体积比优选为1:1～3，进一步优选为1:1～2。

得到乙酸乙酯相后，本发明将所述乙酸乙酯相经硅胶柱层析，采用氯仿-甲醇体系进行梯度洗脱，得到第一梯度洗脱流分，命名为A流分。

本发明中，所述硅胶柱层析的上样方式优选为干法上样；所述干法上样优选包括以下步骤：将乙酸乙酯相和硅胶拌合，然后放入层析柱。在本发明中，所述硅胶的粒径优选为200～300目，进一步优选为250～300目。本发明中，所述氯仿-甲醇体系中氯仿和甲醇的体积比优选为50:1～4:1。

本发明中，所述硅胶柱层析优选包括：以氯仿和甲醇体积比为50:1～4:1的氯仿-甲醇体系为洗脱液依次进行洗脱，洗脱液经TLC检测，所得相同流分进行合并，得到A流分、B流分、C流分、D流分、E流分、F流分、G流分、H流分和I流分。

得到A流分后，本发明将所述A流分经ODS-反向柱层析，采用甲醇-水体系进行梯度洗脱，得到第二梯度洗脱流分，命名为A-2流分。

本发明中，所述甲醇-水体系中甲醇的体积分数优选为30～100％。本发明中，所述ODS-反向柱层析优选为以体积浓度为30％～100％的甲醇-水体系为洗脱液依次进行洗脱，洗脱液经TLC检测，所得相同流分进行合并，得到A-1流分、A-2流分、A-3流分、A-4流分、A-5流分、A-6流分、A-7流分、A-8流分和A-9流分。

得到A-2流分后，本发明将所述A-2流分经葡聚糖凝胶柱层析，所得洗脱液经ODS-反向柱层析，得到所述联苄类单体化合物。

本发明中，所述葡聚糖凝胶柱层析的洗脱剂优选为甲醇-水体系；所述甲醇-水体系中甲醇和水的体积比优选为95:5。

本发明中，A-2流分经ODS-反向柱层析时，所述ODS-反向柱层析的洗脱方式优选为梯度洗脱，所述梯度洗脱的洗脱剂为甲醇-水体系，所述甲醇-水体系中的甲醇和水的体积比优选为10:1～1:1。本发明中，所述ODS-反向柱层析优选为：以甲醇和水的体积比为10:1～1:1的甲醇-水体系依次进行洗脱，洗脱液经TLC检测，合并相同流分，得到所述联苄类单体化合物。

本发明提供的联苄类单体化合物的制备方法简单，可操作性强，利于工业化生产。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对上述技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中所用试剂的如下：

成人永生化皮质细胞(HaCat细胞)购自Cascade Biologics；

DMEM(高糖)培养基、青链霉素和胎牛血清(FBS)购自Biological Industries公司；0.25％胰酶(含EDTA)购自Cytiva公司；水溶性维生素E(Trolox)购自南京建成生物工程研究所；MTS试剂购自BestBio公司；人类SIRT3蛋白购自Thermo Fisher Scientific公司；活性氧检测试剂盒、超氧化物歧化酶检测试剂盒和蛋白定量试剂盒购自南京建成生物工程研究所；SIRT3直接荧光筛选分析试剂盒购自Abnova公司；细胞裂解缓冲液购自美仑生物公司。

实施例1

将铁皮石斛茎经干燥粉碎后，在体积分数为50％的乙醇水溶液中于室温下浸泡30h，所得提取液经减压浓缩得到浸膏，然后将10g浸膏溶于200mL水，然后加入200mL乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯相，所述乙酸乙酯相和硅胶(粒径为200～300目)拌样，然后利用氯仿和甲醇体积比为50:1～4:1的氯仿-甲醇体系依次进行洗脱，经TLC检测，合并相同流分，得到9个流分A～I；然后将所述A流分经ODS-反向柱层析，利用体积浓度为30％～100％的甲醇-水体系依次进行洗脱，经TLC检测，合并相同流分，得到A-1～A-9流分；然后，将所述A-1～A-9流分中的A-2流分经葡聚糖凝胶柱层析和ODS-反向柱层析，得到所述联苄类单体化合物；所述葡聚糖凝胶柱层析的洗脱剂为体积比为95:5甲醇-水体系，所述ODS-反向柱层析为：采用甲醇和水的体积比10:1～1:1的甲醇-水体系依次进行洗脱，然后合并相同流分，得到联苄类单体化合物，记作ZDO-6。

本实施例还对13种联苄类化合物(记为ZDO-1～ZDO-13，结构式如下)的抗衰老活性进行了评估，试验过程包括分子对接实验、分子互作实验。

①分子对接实验

分子对接实验采用Maestro 11.9分子对接套件进行，从蛋白质数据库检索通过晶体X射线衍射获得的人类SIRT3蛋白质的晶体结构(PDB ID:4C7B，分辨率：

)，然后，使用ChemBioDraw Office 14.0软件(Cambridge Soft，MA，US)得到铁皮石斛联苄类化合物结构。在制备配体、蛋白质和蛋白质活性位点的网格形成后，Glide对接套件输出GScore，Gscore得分见表1；通过预测与蛋白质靶标的最佳结合方向。

表1基于分子对接的联苄类化合物得Gscore得分

由表1可知，13种联苄类化合物(ZDO-1～ZDO-13)均与SIRT3蛋白表现出一定程度的结合协同作用(GScore<-6)。与其他联苄基衍生物相比，ZDO-6与SIRT3蛋白受体表现出最好的结合作用。(GScore＝-9.821)

②分子互作实验

使用Biacore S200仪器(GE Healthcare，MA，US)进行表面等离子体共振结合分析。通过在醋酸钠缓冲液(10mM，pH 5.0)中注入10μg/mL蛋白质溶液，在S系列CM5传感器芯片(GE Healthcare)表面固定SIRT3蛋白质。将铁皮石斛中的联苄类化合物溶解在运行缓冲液(PBS+5％DMSO)中，并以不同浓度通过固定化SIRT3传感器表面(62.5～1000μM，倍比稀释)，流速为30μL/min。结合时间为120s，解离时间为150s。使用Biacore S200评估软件(GEHealthcare，MA，US)进行进行表面等离子体共振(SPR)结合分析，评估了ZDO-1～ZDO-13与SIRT3蛋白的结合亲和力，得到解离常数，见表2。

表2基于分子互作实验的ZDO-1～ZDO-13的解离常数

由表2可知，铁皮石斛中的联苄类化合物与SIRT3蛋白有不同程度的直接结合，解离常数范围为3.115×10^-4～3.465。

本实施例还对ZDO-1～ZDO-13进行了紫外损伤保护实验，实验具体为：

将HaCat细胞以DMEM(高糖)培养基，含5％FBS和2％青链霉素，4×10⁵个/mL的密度接种于24孔培养板，孵育24小时待细胞长至80％即可用于实验。在超净台去除培养基，然后将细胞中用PBS液洗涤3次，培养板中每孔加100μLPBS液，然后将细胞放入培养箱孵育10min。孵育过程中，将紫外灯放置于距离超净台平面10cm处，开启紫外灯10min使紫外灯发光稳定后，从细胞培养箱中取出细胞，空白组的细胞用锡纸完全包裹住，其余组别细胞紫外光B波段(UV-B)照射10s后，更换含有不同浓度联苄类化合物的完全培养基继续培养12h后，加入MTS试剂，使用MTS法(室温25℃避光静置1小时，波长490nm处测吸光度值)测细胞存活率，计算得细胞存活率，存活率(％)＝(A实验组-A背景孔)/(A空白组-A背景孔)×100％；细胞存活率情况见表3。

表3基于紫外损伤保护实验的细胞存活率

本实施例还对ZDO-6的活性氧(ROS)清除能力进行了检测，检测方法为：

将HaCaT细胞以2×10⁵细胞/500L的密度接种于24孔培养板中，孵育24小时待细胞长至80％即可用于实验。在超净台去除培养基，然后将细胞中用PBS液洗涤3次，培养板中每孔加100μL PBS，然后将细胞放入培养箱孵育10min。孵育过程中，将紫外灯放置于距离超净台平面10cm处，开启紫外灯10min使紫外灯发光稳定后，从细胞培养箱中取出细胞，空白组的细胞用锡纸完全包裹住，其余组别细胞紫外光B波段(UV-B)照射10s后，更换含有不同浓度联苄类化合物的完全培养基继续培养12h，经不同浓度联苄类化合物培养后的HaCaT细胞在含有10μm 2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)探针的培养基中培养1h，以获得稳定的探针细胞内水平。之后，用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞5次，并在200倍放大的荧光显微镜下观察。DCFH-DA可以穿透细胞最初通过细胞内相关酶转化为二氯荧光素(DCFH)，然后在活性氧存在下，活性氧试剂盒检测，DCFH被氧化为二氯荧光素(DCF)，在荧光显微镜下显示绿光。通过检测DCF荧光强度可以反映细胞内活性氧水平，检测结果见图1，经图1可知：空白组紫外线照射后细胞内ROS含量显著增加。当添加ZOL-6后，随着浓度的增加，细胞内ROS的含量逐渐降低，表明ZOL-6可以显著减少紫外线照射诱导的HaCaT细胞中ROS的积累。

本发明还对Mn-SOD酶和SIRT3酶活性进行了检测，检测方法为：

贴壁的HaCaT细胞在6孔板中以每孔1×10⁶个细胞的密度种板，孵育24小时待细胞长至80％即可用于实验。在超净台去除培养基，然后将细胞中用PBS液洗涤3次，培养板中每孔加100μL PBS，然后将细胞放入培养箱孵育10min。孵育过程中，将紫外灯放置于距离超净台平面10cm处，开启紫外灯10min使紫外灯发光稳定后，从细胞培养箱中取出细胞，空白组的细胞用锡纸完全包裹住，其余组别细胞紫外光照射10s后，更换含有不同浓度联苄类化合物为样品组和水溶性维生素E为阳性组的完全培养基继续培养12h。之后，加入0.25％胰酶消化细胞后，通过细胞裂解缓冲液提取总蛋白，利用蛋白测定试剂盒检测蛋白含量。所有样品的蛋白质浓度统一后，利用超氧化物歧化酶和SIRT3直接荧光筛选分析检测试剂盒进一步检测细胞裂解液中Mn-SOD和SIRT3的酶活性，检测结果见图2，从图2可知，紫外照射后，细胞内Mn-SOD和SIRT3酶活性显著降低。在用不同浓度的ZOL-6处理后，Mn-SOD和SIRT3的酶活性显著高于紫外照射组。ZOL-6可以提高细胞内Mn-SOD和SIRT3的酶活性，有助于细胞内活性氧的清除从而减少细胞损伤。

实施例2

化妆品1，以质量百分含量计，配方如下：

化妆品2，以质量百分含量计，配方如下：

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。