CN110559224B

CN110559224B - 一种西兰花提取物及制备方法和用途

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Publication number: CN110559224B
Application number: CN201910811841.3A
Authority: CN
Inventors: 胡露; 孙云起; 聂艳峰; 孙怀庆; 郭朝万
Original assignee: Guangdong Marubi Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Guangdong Marubi Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2019-08-30
Filing date: 2019-08-30
Publication date: 2020-08-21
Anticipated expiration: 2039-08-30
Also published as: CN110559224A

Abstract

本发明涉及化妆品技术领域，具体涉及一种西兰花提取物及制备方法和用途。该方法包括：A)取西兰花茎叶，经预处理后得到西兰花粉；B)取上述西兰花粉，加入提取溶剂，超声辅助提取60～90min，收集提取液，冷却，离心，经减压过滤和滤膜超滤，收集滤液；C)将收集的滤液进行真空冷冻干燥，得西兰花提取物。采用该方法制备得到的西兰花提取物中烟酰胺单核苷酸的含量可达到13.724μg/mg，对DPPH的清除率高达88.31％，对AGEs的物质的抑制率为84.38％，具有优异的抗氧化、抗衰老作用。

Description

一种西兰花提取物及制备方法和用途

技术领域

本发明涉及化妆品技术领域，具体涉及一种西兰花提取物及制备方法和用途。

背景技术

烟酰胺单核苷酸(NMN)是细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+，也称辅酶I)合体的重要前体。NAD+是三羧酸循环的氧化还原辅酶，NMN作为NAD+补救途径中的中间体，具有抗氧化、减少氧化应激的作用，可以增强能量代谢，减缓生物体的生理衰退，延长寿命。Mills等研究发现，NMN能够显著改善小鼠与年龄相关的生理衰退，如抑制年龄相关的体重增加，增强能量代谢，改善胰岛素敏感性和血浆中脂质分布，改善眼部功能；NMN通过组织特异性方式预防年龄相关的基因表达变化，并且增强骨骼肌中的线粒体的氧化代谢，至少部分地介导其抗衰老作用，其分子结构式如下式Ⅰ所示：

目前，烟酰胺单核苷酸(NMN)主要通过微生物发酵、化学合成或体外酶催化制备。但是NMN的合成较为困难，且耗时长、成本高、收率低，同时可能存在有机溶剂残留等问题。

NMN广泛存在于天然食物中，蔬菜、真菌、肉类和虾中都发现了NMN的存在，但是目前未见有成功从西兰花中提取烟酰胺单核苷酸的例子。同时，由于烟酰胺单核苷酸性质特殊，且其在植物中的含量微小，采用现有的植物提取方法，如微波提取、回流提取、超声提取等方法提取普遍存在含量低、需反复多次重复提取、耗时长等缺点。

发明内容

针对上述现有技术存在的问题，本发明旨在提供一种西兰花提取物及制备方法和用途，通过特定的工艺，从西兰花中提取得到含较多烟酰胺单核苷酸的提取物。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：一种西兰花提取物的制备方法，包括以下步骤：

A)取西兰花茎叶，经预处理后得到西兰花粉；

B)取上述西兰花粉，加入提取溶剂，超声辅助提取60～90min，收集提取液，冷却，离心，经减压过滤和滤膜超滤，收集滤液；

C)将收集的滤液浓缩，真空冷冻干燥，得西兰花提取物；

其中，所述西兰花提取物中烟酰胺单核苷酸的含量为13～14μg/mg。

进一步地，所述提取溶剂为含有0.05～1.0wt％月桂酸钾、0.5～2.0wt％乙酸的水溶液。进一步地，所述步骤B)中西兰花粉与提取溶剂的质量比为1:(20～30)。

值得说明的是，本发明实现从西兰花中提取烟酰胺单核苷酸的关键点在于提取溶剂的选择，发明人尝试了采用十二烷基硫酸钠、吐温类表面活性剂辅助超声波提取烟酰胺单核苷酸，但是发现提取物中烟酰胺单核苷酸的含量较低，且耗时较长(4～6h)。出于对上述情况的改进通过大量筛选而选用了月桂酸钾表面活性剂，该表面活性剂加入后，烟酰胺单核苷酸的得率显著提高，提取时间缩短至60～90min。上述效果可能是由于月桂酸钾表面活性剂与超声波结合能够获得比其他表面活性剂更强的空化效应，这种更强的空化效可能与月桂酸钾表面活性剂的性质有关。由于其与十二烷基硫酸钠、吐温类表面活性剂相比，具有更优秀的发泡性能，因此在超声波的作用下能够产生更大，更多的气泡。在声压的连续作用下，这些气泡瞬间收缩爆破，产生更高能量的声化学效应，因此，使得有效成分能够更大程度的溶出。但上述原理仅是发明人的推测，尚未得到进一步的证实。

但是，该种效果需要在较大的料液比(1:60～80)条件下提取才得以实现，意外地发明，如果在提取溶剂中加入一点乙酸，在此条件下，进行超声波提取，可降低工艺中的料液比，由于不清楚加入月桂酸表面活性剂使得提取的料液比增大的原因，所以对于加入乙酸能够抑制这种作用的原理也还在研究之中。推测有可能是因为，乙酸属于弱电解质，其存在充当了表面活性剂促进剂的角色，起到了促进月桂酸表面活性剂发挥协助提取的作用，抑或是其存在在某种程度上降低了月桂酸表面活性剂使的提取料液比增大的影响。

进一步地，所述超声辅助提取温度为45～80℃，所述超声辅助提取的功率为100～400W。

进一步地，所述步骤A)中预处理包括洗涤、切块、干燥、粉碎和过筛步骤。

进一步地，所述步骤B)中用于减压过滤的滤纸孔径为10～25um，用于超滤的超滤膜截留分子量为1KD～5KD。

进一步地，所述真空冷冻干燥中，压力为50～80Pa，温度为-5℃～-20℃，时间为0.5～3h。

进一步地，所述滤液在进行真空冷冻干燥前先进行纯化，所述纯化步骤为：将所述滤液用磷酸溶液调节pH至3.0～6.0，色谱柱采用50～60％的乙醇溶液平衡后，上样，等梯度洗脱，收集目的峰。

本发明还提供了上述西兰花提取物在制备抗衰老护肤品/化妆品中的用途，其在所述护肤品/化妆品中的用量为0.05～99wt％。

除此之外，本发明还提供一种抗衰老护肤品，包含上述的制备方法制备得到的西兰花提取物0.05～99wt％及常用的化妆品助剂。

本发明的有益效果在于：

1)本发明采用含月桂酸钾+乙酸的水溶液作为提取溶剂，协同超声波提取，实现了从西兰花中提取烟酰胺单核苷酸的目的，且提取物中烟酰胺单核苷酸的含量较采用十二烷基硫酸钠、吐温高，耗时短，工艺成本较低。

2)采用本发明制备得到的西兰花提取物中烟酰胺单核苷酸的含量可达到13.724μg/mg，对DPPH的清除率高达88.31％，对AGEs的物质的抑制率为84.38％，具有优异的抗氧化、抗衰老作用。

附图说明

图1为烟酰胺单核苷酸色谱图；

图2为烟酰胺单核苷酸标准曲线图。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。

试验1、提取剂、提取时间及提取料液比对提取物中NMN含量的影响试验

1.1试验方法：

1.1.1西兰花提取物制备：

取西兰花茎叶，用蒸馏水洗涤，切成0.5cm×0.5cm的小块，45℃烘箱干燥至恒重，过80目筛网，得到粒径小于177μm的西兰花粉；加入提取溶剂，70℃超声辅助提取，室温放置使其自然冷却，4500rmp离心20min，然后用孔径为10μm的滤纸减压过滤，收集滤液，用截留分子量为1KD的超滤膜进行超滤，收集滤液；将所述滤液用磷酸溶液调节pH至5.0，色谱柱采用55％的乙醇溶液平衡后，上样，等梯度洗脱，收集目的峰，置于真空冷冻干燥机中冻干，冻干条件：真空压力为60Pa，温度为-10℃，时间为1.5h，得西兰花提取物。其中色谱柱条件：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相：A相为pH3.0的磷酸溶液；B相为乙醇溶液；流速：5ml/min；检测波长：260nm；梯度：B％为2％～10％(40min)；上样量为30-50mL。

在上述提取方法的基础上，考察不同提取剂、提取时间及提取料液比对提取物中NMN含量的影响，具体提取参数如表1和表2。

1.2各组样品中烟酰胺单核苷酸含量测定：

1.2.1样品前处理：称取制备得到的西兰花提取物试样0.2g，精确到1mg，加入10ml纯水溶解，在超声波清洗器中超声20min，然后用纯水定容至20ml，混匀。取部分溶液放入离心管中，4500r/min离心30min，取上清液，经0.45μm滤膜过滤，备用。

1.2.2高效液相色谱色谱条件

色谱柱：Agilent XDB C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；

流动相：乙腈、pH为6的磷酸盐缓冲液，梯度洗脱：

流速：1.0mL/min；进样量：20μL；柱温：25℃；测定波长：260nm。

1.2.3标准曲线绘制

用纯水配制1mg/mL的烟酰胺单核苷酸储备液，用纯水准确稀释至5μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的待测液，按照以上色谱条件注入液相色谱仪，记录色谱图(如图1)，通过色谱图得到烟酰胺单核苷酸的保留时间为2.539min。以烟酰胺单核苷酸浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，见附图2。

1.2.4样品测试

将上述得到的西兰花提取物测试样品按照上述1.2.2的色谱条件注入液相色谱仪，记录色谱图，记录样品在2.539min下色谱峰的峰面积，通过烟酰胺单核苷酸的标准曲线算出各组西兰花测试样品中烟酰胺单核苷酸的含量，结果取平均值，结果如下表1～2所示。

表1提取剂种类及提取时间对NMN含量的影响(料液比为1:20)

注：SDS为十二烷基硫酸钠；Tween20为吐温20；Potassium为月桂酸钾；HAC为乙酸；CA为柠檬酸。

由上表可知，单独采用十二烷基硫酸钠或吐温20协同超声波提取，在提取时间为6h时达到最大的提取得率，提取物中NMN的含量分别可达到6.487μg/mg和5.016μg/mg，随着提取时间的延长，提取物得率虽有提高，但是提取物中NMN的浓度有所降低，总体含量有轻微升高，说明其他成分溶出增加了；单独采用月桂酸钾提取，在料液比为1:20时，提取物中NMN的浓度随提取时间有所降低，且整体提取物得率相比SDS、吐温20较低；提取剂为月桂酸钾+乙酸时，提取70min时，提取物中NMN的含量达到峰值，说明乙酸的加入提高了月桂酸钾的提取效果，而后随着提取时间的延长，提取物中NMN的浓度有所下降，总含量无明显上升。SDS和HAC联用提取效果较SDS单独使用时好，但是比Potassium+HAC低；尝试采用Potassium+CA提取，但是提取效果与Potassium+HAC相比较为明显。同时，从上述表格可看出，各组提取物得率与提取物中NMN的含量不轻易呈正相关关系，说明还需进一步优化工艺。

表2提取溶剂及料液比对NMN含量的影响(提取时间为70min)

由上表可知，0.05％月桂酸钾+1.0％乙酸在料液比为1:20取得最佳的提取效果，西兰花提取物中烟酰胺单核苷酸的含量可达到13.724μg/mg，当料液比逐渐升高时，烟酰胺单核苷酸的含量有所下降，当料液比为1:60时，西兰花提取物中烟酰胺单核苷酸的含量为10.616μg/mg。单独采用月硅酸钾协同超声波提取在料液比＞1:80时，对烟酰胺单核苷酸具有最好的提取效果，NMN含量可达到11.254μg/mg，当料液比继续增大，NMN含量有所下降。

实施例1、西兰花提取物的制备方法

A)取西兰花茎叶，用蒸馏水洗涤，切成0.5cm×0.5cm的小块，45℃烘箱干燥至恒重，过80目筛网，得到粒径小于177μm的西兰花粉；

B)取上述西兰花粉，按1:20的料液比加入含有1.0wt％月桂酸钾、1.0wt％乙酸的水溶液，70℃超声辅助提取70min，室温放置使其自然冷却，4500rmp离心20min，然后用孔径为10μm的滤纸减压过滤，收集滤液，用截留分子量为1000的滤膜进行超滤，收集滤液；

C)将所述滤液用磷酸溶液调节pH至5.0，色谱柱采用55％的乙醇溶液平衡后，上样，等梯度洗脱，收集目的峰，置于真空冷冻干燥机中冻干，冻干条件：真空压力为60Pa，温度为-10℃，时间为1.5h，得西兰花提取物。

其中纯化中色谱柱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相：A相为pH3.0的磷酸溶液；B相为乙醇溶液；流速：5ml/min；检测波长：260nm；梯度：B％为2％～10％(40min)；上样量为30-50ml。

实施例2、西兰花提取物的制备方法

与实施例1的区别在于，料液比为1:30，其余参数与实施例1相同。

实施例3、西兰花提取物的制备方法

与实施例1的区别在于，提取时间为60min，其余参数与实施例1相同。

实施例4、西兰花提取物的制备方法

与实施例1的区别在于，提取时间为90min，其余参数与实施例1相同。

实施例5、西兰花提取物的制备方法

与实施例1的区别在于，提取溶剂为含有1.0wt％月桂酸钾、0.5wt％乙酸的水溶液，其余参数与实施例1相同。

实施例6、西兰花提取物的制备方法

与实施例1的区别在于，提取溶剂为含有1.0wt％月桂酸钾、2.0wt％乙酸的水溶液，其余参数与实施例1相同。

试验2、DPPH清除实验测试

配制0.2mmol/L的DPPH·甲醇(或无水乙醇)溶液；配制200mg/mL浓度的实施例1～3组待测样品溶液；以VC作为阳性对照样品。

分别吸取2mL样品溶液和2mLDPPH·溶液于具塞试管中，混匀，避光反应30min，测定517nm波长下的吸光值A1；分别吸取2mL样品溶液和2mL甲醇于具塞试管中，混匀，避光反应30min，测定517nm波长下的吸光值A2；分别吸取2mLDPPH·溶液和2mL甲醇于具塞试管中，混匀，避光反应30min，测定517nm波长下的吸光值A0；每个样品做3个平行样，结果如表3所示。

样品	DPPH清除率(％)
		实施例1	88.31％
实施例2	86.54％
		实施例3	83.25％
实施例4	82.59％
		实施例5	79.43％
实施例6	80.17％

由上表可知，本发明提供的西兰花提取物对DPPH的清除率最高可达到88.31％，具有优秀的清除自由基的能力。

试验3、晚期糖基化终产物清除实验测试

分别配制以下试剂：①0.1mol/L NaOH溶液；②0.05mol/L的PBS磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)；③10mg/ml牛血清白蛋白溶液；④45mg/ml葡萄糖溶液；⑤0.25mmol/L盐酸氨基胍溶液；⑥200mg/mL⑨～组西兰花提取物待测样品溶液。

将0.05mol/L的PBS磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)、10mg/ml牛血清白蛋白溶液和45mg/ml葡萄糖溶液放置于恒温恒湿培养箱中，然后将西兰花提取物待测样品溶液与0.25mmol/L盐酸氨基胍溶液添加进去，在60℃条件下孵育40h(相当于30℃条件下孵育60天)。40h后取出各样品，用酶标仪对其进行检测，荧光激发/发射波长为370/440nm，记录荧光吸收值。每个样品做3个平行样，结果取其平均值，其中AEGs的抑制率如下式所示，结果如下表4所示。

其中，A样品表示添加有受试物和葡萄糖溶液的荧光强度；A_样品空白表示添加有受试物，不添加葡萄糖溶液的荧光强度；A_阴性对照表示不含受试物，有葡萄糖溶液的荧光强度；A_{缺糖阴性对照}表示不含受试物，也不含葡萄糖溶液的荧光强度。

表4 AEGs抑制率

样品	AEGs抑制率(％)
		实施例1	84.38％
实施例2	82.62％
		实施例3	82.08％
实施例4	80.21％
		实施例5	78.21％
实施例6	75.05％

由上表可知，本发明提供的西兰花提取物对AGEs的抑制率最高可达到84.38％，预示着其具有优异的抗衰老作用。

对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims

1.一种西兰花提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

A)取西兰花茎叶，经预处理后得到西兰花粉；

C)将收集的滤液进行真空冷冻干燥，得西兰花提取物；

其中，所述西兰花提取物中烟酰胺单核苷酸的含量为13～14μg/mg；

所述提取溶剂为含有0.05～1.0wt％月桂酸钾和0.5～2.0wt％乙酸的水溶液；

所述步骤B)中西兰花粉与提取溶剂的质量比为1:(20～30)。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤A)中预处理包括洗涤、切块、干燥、粉碎和过筛步骤。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述超声辅助提取温度为45～80℃，所述超声辅助提取的功率为100～400W。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B)中用于减压过滤的滤纸孔径为10～25μm，用于超滤的超滤膜截留分子量为1～5KD。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述真空冷冻干燥中，真空压力为50～80Pa，温度为-5℃～-20℃，时间为0.5～3h。

6.如权利要求1～5任一所述的制备方法制备得到的西兰花提取物。

7.如权利要求1～5任一所述的制备方法制备得到的西兰花提取物在制备抗衰老化妆品中的用途，其在所述化妆品中的用量为0.05～99wt％。

8.一种抗衰老护肤品，其特征在于，包含如权利要求1～4任一所述的制备方法制备得到的西兰花提取物0.05～99wt％及常用的化妆品助剂。