CN112438917A - 一种卷心菜提取物及其制备方法与应用 - Google Patents

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郭朝万
孙怀庆
曾令椿
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Abstract

本发明属于天然植物提取技术领域，特别涉及一种卷心菜提取物及其制备方法与应用。本发明提供的一种卷心菜提取物的制备方法，包括如下步骤：(1)取卷心菜，洗涤，切块，干燥，粉碎，过筛，得到卷心菜粉；(2)取步骤(1)获得的卷心菜粉，加入去离子水中，超声辅助提取，冷却，离心，先后进行减压过滤和滤膜超滤，收集滤液得样品溶液；(3)将步骤(2)所得样品溶液冷冻干燥，得到卷心菜提取物。本发明提供的卷心菜提取物的制备方法耗时短、成本低、能够实现工厂化大规模生产，安全性高。所制备的卷心菜提取物具有很好的抗氧化抗衰老效果，应用于抗衰老化妆品中，能够防止皮肤粗糙老化，减少皮肤皱纹出现。

Description

一种卷心菜提取物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于天然植物提取技术领域，特别涉及一种卷心菜提取物及其制备方法与应用。
背景技术
生活水平的提高与科技的进步，促使人们追求更完美的形象，人口老龄化加剧也使抗衰老成为更多人关心的话题。目前针对抗衰老的研究主要基于的理论基础是自由基理论，因此市场上大部分抗衰老产品都是基于该理论开发一些活性物质来清除体内积聚的有害自由基，或通过促进胶原蛋白生成等方法实现抗衰老功效。由于皮肤的衰老是一个复杂的自然过程，受到内在因素(遗传、代谢、激素)和外在因素(紫外线、污染、香烟烟雾、毒素)共同作用影响，因此，现有技术还有待于改进和发展。
人体内生成的一种叫烟酰胺单核苷酸(NMN)的物质，具有很好的抗衰老作用，随着年龄增长，该物质在体内会逐渐减少。烟酰胺单核苷酸(NMN)是生物细胞内存在的一种生化物质，是细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+,也称辅酶I)合体的重要前体。NAD+是三羧酸循环的氧化还原辅酶，NMN作为NAD+补救途径中的中间体，具有抗氧化、减少氧化应激的作用，可以增强能量代谢，减缓生物体的生理衰退，延长寿命。Mills等研究发现，NMN能够显著改善小鼠与年龄相关的生理衰退，如抑制年龄相关的体重增加，增强能量代谢，改善胰岛素敏感性和血浆中脂质分布，改善眼部功能；烟酰胺单核苷酸(NMN)通过组织特异性方式预防年龄相关的基因表达变化，并且增强骨骼肌中的线粒体的氧化代谢，至少部分地介导其抗衰老作用。鉴于烟酰胺单核苷酸(NMN)是人体内源性物质，安全性较高，且热稳定性较好，因此其作为活性物质在化妆品领域开发应用中具有广阔前景。
值得注意的是，烟酰胺单核苷酸(NMN)广泛存在于天然食物中，蔬菜、真菌、肉类和虾中。卷心菜又名甘蓝，内含丰富的生物活性物质，其中胡萝卜素、硫胺素多糖和核黄素等作为重要的抗氧化剂和抗炎相关慢性疾病的预防，包含癌症，防衰老、抗氧化的效果好，且蛋白和氨基酸含量也较高，烟酰胺单核苷酸(NMN)也有着较高的含量。具有非常高的食用和药用保健价值。但目前几乎没有利用卷心菜作为原料来提取烟酰胺单核苷酸(NMN)的相关研究。
现有技术中，烟酰胺单核苷酸(NMN)主要通过微生物发酵、化学合成或体外酶催化制备。中国专利CN107613990A提供了用于制备具有式(I)的烟酰胺单核苷酸的方法：所述方法包括通过缩酮化保护烟酰胺核糖，然后磷酸化，并随后脱保护以提供烟酰胺单核苷酸。但是该合成方法较为困难，耗时长、成本高、收率低，难以实现工厂化大规模生产，同时可能存在有机溶剂残留等问题。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种卷心菜提取物及其制备方法与应用。本发明提供的卷心菜提取物的制备方法，耗时短、成本低、能够实现工厂化大规模生产，同时不存在有机溶剂残留，安全性高。并且得到的卷心菜提取物中同时含有烟酰胺单核苷酸和黄酮、多糖、多肽等多种活性成分，各成分协同作用，具有很好的抗氧化抗衰老效果，应用于抗衰老化妆品中，能够防止皮肤粗糙老化，减少皮肤皱纹出现，保持皮肤光鲜有弹性。
本发明的技术方案是：
一种卷心菜提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)取卷心菜，洗涤，切块，干燥，粉碎，过筛，得到卷心菜粉；
(2)取步骤(1)获得的卷心菜粉，加入去离子水中，超声辅助提取，冷却，离心，先后进行减压过滤和滤膜超滤，收集滤液得样品溶液；
(3)将步骤(2)所得样品溶液冷冻干燥，得到卷心菜提取物。
进一步地，所述步骤(1)中，过筛时所用筛网目数为30～180目，得到的卷心菜粉粒径大小为1～800μm。
进一步地，所述步骤(2)中，所述卷心菜粉的质量与水的体积之比为1～30g:100ml。
进一步地，所述步骤(2)中，超声辅助提取条件为：提取温度45～80℃，提取时间30～120分钟，超声功率100～400W。
进一步地，所述步骤(2)中，用于减压过滤的滤纸孔径为10～25μm，用于超滤的超滤膜截留分子量为1KD～5KD。
进一步地，所述步骤(3)中冷冻干燥步骤在真空冷冻干燥机中进行；具体步骤为将所述样品溶液放入真空冷冻干燥机中，在温度-15℃～-20℃下冷冻1～2h；然后在温度为-40℃～-50℃，条件下冷冻3～5h，最后以1℃/min的速率升温至0℃时，保持1～2h。
进一步地，所述步骤(3)中冷冻干燥在真空度为20～70pa的条件下进行。
本发明还提供了上述方法制备的卷心菜提取物。
本发明还提供了上述卷心菜提取物在抗衰老美容护肤品组合物中的应用，按重量百分比计，用量为0.05～60％。
进一步地，所述的含卷心菜提取物的抗衰老美容护肤品组合物，为水剂、精华、原液、乳液、面霜、面膜、片剂、口红。
本发明提供的卷心菜提取物的制备方法，与许多提取工艺不同的是，在保障了高提取率的前提下，使用的提取溶媒为水，提取杂质少，降低了分离纯化时的难度，可以大大减少工艺生产中的提取成本。
与现有技术相比，本发明提供的卷心菜提取物的制备方法具有以下优势：
(1)本发明提供的卷心菜提取物的制备方法，利用超声辅助水提取法，将烟酰胺单核苷酸从卷心菜中提取出来，耗时短、成本低、实现了工厂化大规模生产，同时不存在有机溶剂残留，使用溶剂为水，安全性高，实现了首次通过植物提取法获得烟酰胺单核苷酸。
(2)本发明制备的卷心菜提取物，同时含有烟酰胺单核苷酸、黄酮、多糖、多肽等多种活性成分，他们之间协同作用，具有很好的抗氧化抗衰老效果。
(3)本发明首次将卷心菜提取物应用于抗衰老化妆品中，能够防止皮肤粗糙老化，减少皮肤皱纹出现，保持皮肤光鲜有弹性。
附图说明
图1为本发明中烟酰胺单核苷酸的标准工作曲线。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的保护范围之内。
实施例1一种卷心菜提取物的制备方法
所述卷心菜提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)取卷心菜，用蒸馏水洗涤，切成0.5cm×0.5cm的小块，45℃烘箱干燥至恒重，粉碎，过30目筛网，得到粒径为200μm的卷心菜粉；
(2)称取步骤(1)获得的卷心菜粉10g，加入到100ml去离子水中，在温度为45℃、超声功率为100W的条件下超声辅助提取30分钟，室温放置使其自然冷却，然后在转速为4500rmp时离心20分钟，然后用孔径为10μm的滤纸过滤，收集滤液，用截留分子量为1KD的滤膜进行超滤，收集滤液得样品溶液。
(3)将样品溶液用真空冷冻干燥机冻干，在温度-20℃下冷冻1h；然后在温度为-50℃，条件下冷冻3h，最后以1℃/min的速率升温至0℃时，保持1h，得到卷心菜提取物。
所述步骤(3)中冷冻干燥在真空度为20Pa的条件下进行。
实施例2一种卷心菜提取物的制备方法
所述卷心菜提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)取卷心菜，用蒸馏水洗涤，切成1cm×1cm的小块，45℃烘箱干燥至恒重，粉碎，过120目筛网，得到粒径为400μm的卷心菜粉；
(2)称取步骤(1)获得的卷心菜粉25g，加入到100ml去离子水中，在温度为70℃、超声功率为380W的条件下超声辅助提取90分钟，室温放置使其自然冷却，然后在转速为4500rmp时离心20分钟，然后用孔径为15μm的滤纸过滤，收集滤液，用截留分子量为2.5KD的滤膜进行超滤，收集滤液得样品溶液。
(3)将样品溶液用真空冷冻干燥机冻干，在温度-18℃下冷冻1.5h；然后在温度为-45℃，条件下冷冻4h，最后以1℃/min的速率升温至0℃时，保持1.5h，得到卷心菜提取物。
所述步骤(3)中冷冻干燥在真空度为40Pa的条件下进行
实施例3一种卷心菜提取物的制备方法
所述卷心菜提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)取卷心菜，用蒸馏水洗涤，切成0.5cm×0.5cm的小块，45℃烘箱干燥至恒重，粉碎，过180目筛网，得到粒径为800μm的卷心菜粉；
(2)称取步骤(1)获得的卷心菜粉30g，加100ml水，在温度为80℃、超声功率为400W的条件下超声辅助提取120分钟，室温放置使其自然冷却，然后在转速为4500rmp时离心20分钟，然后用孔径为25μm的滤纸过滤，收集滤液，用截留分子量为5KD的滤膜进行超滤，收集滤液得样品溶液。
(3)将样品溶液用真空冷冻干燥机冻干，在温度-15℃下冷冻2h；然后在温度为-40℃，条件下冷冻5h，最后以1℃/min的速率升温至0℃时，保持2h，得到卷心菜提取物。
所述步骤(3)中冷冻干燥在真空度为70Pa的条件下进行。
对比例1一种卷心菜提取物的制备方法
所述卷心菜提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)取卷心菜，用蒸馏水洗涤，切成1cm×1cm的小块，45℃烘箱干燥至恒重，粉碎，过120目筛网，得到粒径为400μm的卷心菜粉；
(2)称取步骤(1)获得的卷心菜粉25g，加入到100ml去离子水中，在温度为70℃、超声功率为380W的条件下超声辅助提取90分钟，室温放置使其自然冷却，然后在转速为4500rmp时离心20分钟，然后用孔径为15μm的滤纸过滤，收集滤液，用截留分子量为2.5KD的滤膜进行超滤，收集滤液得样品溶液。
(3)将样品溶液用真空冷冻干燥机冻干，在温度-15℃下冷冻2h；然后在温度为-40℃，条件下冷冻5h，得到卷心菜提取物。
所述步骤(3)中冷冻干燥在真空度为70Pa的条件下进行。
与实施例2的区别在于，所述真空冷冻干燥的步骤中，未进行最后一步以1℃/min的速率升温至0℃时，保持2h的操作。
对比例2一种卷心菜提取物的制备方法
所述卷心菜提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)取卷心菜，用蒸馏水洗涤，切成1cm×1cm的小块，45℃烘箱干燥至恒重，粉碎，过120目筛网，得到粒径为400μm的卷心菜粉；
(2)称取步骤(1)获得的卷心菜粉25g，加入到100ml浓度为60～70的乙醇溶液中，在温度为70℃、超声功率为380W的条件下超声辅助提取90分钟，室温放置使其自然冷却，然后在转速为4500rmp时离心20分钟，然后用孔径为15μm的滤纸过滤，收集滤液，用截留分子量为2.5KD的滤膜进行超滤，收集滤液得样品溶液。
(3)将样品溶液用真空冷冻干燥机冻干，在温度-18℃下冷冻1.5h；然后在温度为-45℃，条件下冷冻4h，最后以1℃/min的速率升温至0℃时，保持1.5h，得到卷心菜提取物。
所述步骤(3)中冷冻干燥在真空度为40Pa的条件下进行
与实施例2的区别在于，所述步骤(2)中将卷心菜粉加入到100ml浓度为60～70％的乙醇溶液中进行提取。
对比例3一种卷心菜提取物的制备方法
所述卷心菜提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)取卷心菜，用蒸馏水洗涤，切成1cm×1cm的小块，45℃烘箱干燥至恒重，粉碎，过120目筛网，得到粒径为400μm的卷心菜粉；
(2)称取步骤(1)获得的卷心菜粉25g，加入到100ml去离子水中，在温度为70℃、超声功率为500W的条件下超声辅助提取90分钟，室温放置使其自然冷却，然后在转速为4500rmp时离心20分钟，然后用孔径为15μm的滤纸过滤，收集滤液，用截留分子量为2.5KD的滤膜进行超滤，收集滤液得样品溶液。
(3)将样品溶液用真空冷冻干燥机冻干，在温度-18℃下冷冻1.5h；然后在温度为-45℃，条件下冷冻4h，最后以1℃/min的速率升温至0℃时，保持1.5h，得到卷心菜提取物。
所述步骤(3)中冷冻干燥在真空度为40Pa的条件下进行
与实施例2的区别在于，所述步骤(2)中超声提取时的超声功率为500W。
试验例一、高效液相色谱测量烟酰胺单核苷酸的含量
1、试验材料：采用实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3制备的卷心菜提取物进行试验。
2、试验方法：
(1)称取实施例1-3，对比例1-3制备的卷心菜提取物0.2g，分别加入10ml纯水溶解，在超声波清洗器中超声20min，然后用纯水定容至30mL，混匀。取部分溶液放入离心管中，4500r/min离心30min，取上清液，经0.45μm滤膜过滤，备用。
(2)实验所采用的色谱条件如下：
色谱柱：Agilent XDB C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；
流动相：乙腈-pH为6的磷酸盐缓冲液，梯度洗脱如下表：
时间(分钟) 乙腈 pH为6的磷酸盐缓冲液
0 1 99
4 1 99
5 5 95
10 15 85
12 20 80
12.1 1 99
16 1 99
流速：1.0mL/min；进样量：20uL；柱温：25℃；测定波长：260nm。
(3)烟酰胺单核苷酸标准曲线的配制
用纯水配制1mg/mL的烟酰胺单核苷酸储备液，用纯水准确稀释至5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL的待测液，按照(2)中的色谱条件注入液相色谱仪，以烟酰胺单核苷酸浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，制备得到烟酰胺单核苷酸的标准工作曲线，y＝16.976x-5.5999，R2＝0.9998，如图1所示。
3、试验结果
通过高效液相色谱检测，可计算出实施例1-3，对比例1-3中烟酰胺单核苷酸的含量，试验结果如表1所示。
表1 试验样品中烟酰胺单核苷酸的含量
样品 提取物得率 烟酰胺单核苷酸的含量(μg/mg)
实施例1 0.1362％ 5.926
实施例2 0.1413％ 6.097
实施例3 0.1374％ 6.018
对比例1 0.1021％ 4.726
对比例2 0.0986％ 5.064
对比例3 0.0941％ 4.298
由表1可知：与对照组相比，实施例1组，实施例2组和实施例3组中测得烟酰胺单核苷酸的最高，其中实施例2组效果最好，含量达6.097μg/mg，为本发明的最佳实施例。而对比例1-3中提取的烟酰胺单核苷酸的含量要低于实施例1-3提取的烟酰胺单核苷酸的含量，可以表明，本发明提供的卷心菜的提取物的制备方法，各步骤相互配合，提取得到的烟酰胺单核苷酸含量高。
试验例二、DPPH清除实验测试抗氧化
DPPH又称1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，是一种很稳定的氮中心的自由基，它的稳定性主要来自共振稳定作用的3个苯环的空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用。它的无水乙醇溶液呈紫色，在517nm波长处有最大吸收，吸光度与浓度呈线性关系。向其中加入自由基清除剂时，可以结合或替代DPPH，使自由基数量减少，吸光度变小，溶液颜色变浅，借此可评价清除自由基的能力。
1、试验材料：采用实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3制备的卷心菜提取物进行试验。
2、试验方法：配制0.2mmol/L的DPPH甲醇(或无水乙醇)溶液；分别配制200mg/mL浓度的实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3制备的卷心菜提取物作为待测样品溶液；以VC作为阳性对照样品。
分别吸取2mL样品溶液和2mL DPPH溶液于具塞试管中，混匀，避光反应30min，测定517nm波长下的吸光值A1；分别吸取2mL样品溶液和2mL甲醇于具塞试管中，混匀，避光反应30min，测定517nm波长下的吸光值A2；分别吸取2mLDPPH·溶液和2mL甲醇于具塞试管中，混匀，避光反应30min，测定517nm波长下的吸光值A0；每个样品做3个平行样。通过如下公式检测卷心菜提取物的DPPH的清除率：
Figure BDA0002185272590000081
3、试验结果
试验结果如表2所示。
表2 试验样品的DPPH清除率
Figure BDA0002185272590000091
由表2可知：与对照组相比，实施例1，实施例2和实施例3制备的卷心菜提取物的DPPH清除率较高，其中实施例2组效果最好，为本发明的最佳实施例。而对比例1-3中，当改变了本发明卷心菜提取物的制备条件时，本发明提供的卷心菜的制备工艺制得的卷心菜提取物DPPH清除率明显低于实施例1-3组，说明了本发明制备的卷心菜提取物自由基清除能力较高。
试验例三、晚期糖基化终产物清除实验测试抗老化
非酶糖基化是一系列复杂的非酶促反应，蛋白质和葡萄糖在体内发生非酶促反应形成Schiff碱和Amadori产物等早期糖基化产物，进而经过氧化、重排、交联等过程，形成不可逆的非酶糖基化终产物(Advanced Glycosylation Endproducts,AGEs)。该反应在生物体内广泛而缓慢地进行着，它可导致蛋白质功能降低和老化，进而使机体组织发生衰老和病变。能够有效清除AGEs的物质，具有抗衰老作用。
1、试验材料：采用实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3制备的卷心菜提取物进行试验。
2、试验方法：
分别配制以下试剂：①0.1mol/L NaOH溶液；②0.05mol/L的PBS磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)；③10mg/ml牛血清白蛋白溶液；④45mg/ml葡萄糖溶液；⑤0.25mmol/L盐酸氨基胍溶液；⑥200mg/mL实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3制备的卷心菜提取物待测样品溶液。
将0.05mol/L的PBS磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)、10mg/ml牛血清白蛋白溶液和45mg/ml葡萄糖溶液放置于恒温恒湿培养箱中，然后分别将卷心菜提取物待测样品溶液与0.25mmol/L盐酸氨基胍溶液添加进去，在60℃条件下孵育40h(相当于30℃条件下孵育60天)。40h后取出各样品，用酶标仪对其进行检测，荧光激发/发射波长为370/440nm，记录荧光吸收值。每个样品做3个平行样。通过如下公式检测卷心菜提取物的AGEs抑制率：
Figure BDA0002185272590000101
A样品：添加有受试物和葡萄糖溶液的荧光强度；
A样品空白：添加有受试物，不添加葡萄糖溶液的荧光强度；
A阴性对照：不含受试物，有葡萄糖溶液的荧光强度；
A缺糖阴性对照：不含受试物，也不含葡萄糖溶液的荧光强度。
3、试验结果
试验结果如表3所示。
表3 试验样品的AGEs抑制率
Figure BDA0002185272590000102
由表3可知：与对照组相比，实施例1，实施例2和实施例3制备的卷心菜提取物的AGEs抑制率较高，其中实施例2组效果最好，为本发明的最佳实施例。而对比例1-3中，当改变了本发明卷心菜提取物的制备条件时，本发明提供的卷心菜的制备工艺制得的卷心菜提取物AGEs抑制率明显低于实施例1-3组，说明了本发明制备的卷心菜提取物能有效清除AGEs的物质，具有抗衰老作用。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种卷心菜提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取卷心菜，洗涤，切块，干燥，粉碎，过筛，得到卷心菜粉；
(2)取步骤(1)获得的卷心菜粉，加入去离子水中，超声辅助提取，冷却，离心，先后进行减压过滤和滤膜超滤，收集滤液得样品溶液；
(3)将步骤(2)所得样品溶液冷冻干燥，得到卷心菜提取物。
2.如权利要求1所述的卷心菜提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，过筛时所用筛网目数为30～180目，得到的卷心菜粉粒径大小为1～800μm。
3.如权利要求1所述的卷心菜提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述卷心菜粉的质量与水的体积之比为1～30g:100ml。
4.如权利要求1所述的卷心菜提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，超声辅助提取条件为：提取温度45～80℃，提取时间30～120分钟，超声功率100～400W。
5.如权利要求1所述的卷心菜提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，用于减压过滤的滤纸孔径为10～25μm，用于超滤的超滤膜截留分子量为1KD～5KD。
6.如权利要求1所述的卷心菜提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中冷冻干燥步骤在真空冷冻干燥机中进行；具体步骤为将所述样品溶液放入真空冷冻干燥机中，在温度-15℃～-20℃下冷冻1～2h；然后在温度为-40℃～-50℃，条件下冷冻3～5h，最后以1℃/min的速率升温至0℃时，保持1～2h。
7.如权利要求6所述的卷心菜提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中冷冻干燥在真空度为20～70pa的条件下进行。
8.如权利要求1～7任一项所述的制备方法制备的卷心菜提取物。
9.如权利要求8所述的卷心菜提取物在抗衰老美容护肤品组合物中的应用，按重量百分比计，用量为0.05～60％。
10.如权利要求9所述的含卷心菜提取物的抗衰老美容护肤品组合物，其特征在于，所述护肤品为水剂、精华、原液、乳液、面霜、面膜、片剂、口红。
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