CN114917270B - 绿豆皮乙酸乙酯萃取物、活性成分组合及其在延缓皮肤衰老中的应用 - Google Patents

绿豆皮乙酸乙酯萃取物、活性成分组合及其在延缓皮肤衰老中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114917270B
CN114917270B CN202210628457.1A CN202210628457A CN114917270B CN 114917270 B CN114917270 B CN 114917270B CN 202210628457 A CN202210628457 A CN 202210628457A CN 114917270 B CN114917270 B CN 114917270B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ethyl acetate
cells
mung bean
acetate extract
active ingredient
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210628457.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114917270A (zh
Inventor
李大鹏
郝日礼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Agricultural University
Original Assignee
Shandong Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Agricultural University filed Critical Shandong Agricultural University
Priority to CN202210628457.1A priority Critical patent/CN114917270B/zh
Publication of CN114917270A publication Critical patent/CN114917270A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114917270B publication Critical patent/CN114917270B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/48—Fabaceae or Leguminosae (Pea or Legume family); Caesalpiniaceae; Mimosaceae; Papilionaceae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/16—Emollients or protectives, e.g. against radiation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/18—Antioxidants, e.g. antiradicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
    • A61K2236/333—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using mixed solvents, e.g. 70% EtOH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/39—Complex extraction schemes, e.g. fractionation or repeated extraction steps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/50—Methods involving additional extraction steps
    • A61K2236/51—Concentration or drying of the extract, e.g. Lyophilisation, freeze-drying or spray-drying
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/50—Methods involving additional extraction steps
    • A61K2236/53—Liquid-solid separation, e.g. centrifugation, sedimentation or crystallization
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/50—Methods involving additional extraction steps
    • A61K2236/55—Liquid-liquid separation; Phase separation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

本发明公开了一种绿豆皮乙酸乙酯萃取物、活性成分组合及其在延缓皮肤衰老中的应用，属于生物医药技术领域。本发明研究发现绿豆皮乙酸乙酯萃取物对H2O2损伤后的皮肤细胞具有显著的保护效应，使HaCaT细胞和HSF细胞免受H2O2损伤，具有延缓皮肤衰老的活性。绿豆皮乙酸乙酯萃取物中的活性成分牡荆素和异牡荆素的组合具有抑制细胞衰老β‑半乳糖苷酶活性的作用，在降低衰老细胞数量、延缓皮肤细胞衰老方面具有协同增效作用。

Description

绿豆皮乙酸乙酯萃取物、活性成分组合及其在延缓皮肤衰老中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及绿豆皮乙酸乙酯萃取物、活性成分组合及其在延缓皮肤衰老中的应用。
背景技术
皮肤衰老是一个涉及遗传、环境等多因素的复杂生物学过程，其具体机制尚未完全阐明。随着人类平均寿命的增长以及老龄化社会的到来，公众的求美意识逐渐增强，探寻皮肤衰老的真相以及如何延缓其衰老成为当前美容医学领域研究的热点之一。
绿豆(Vigna radiata(Linn.)Wilczek)是一种豆科植物，目前在全球大部分地区均有种植。绿豆皮是泡发绿豆后揉搓下来的种皮，占绿豆质量的8％左右。干燥的绿豆皮质地脆硬，纹理致密，形状不规则，外表面呈暗棕色，内表面光滑呈浅棕色，常带有黄白色珠柄，气味较弱。《本草纲目》中记载绿豆皮“味甘、性寒、热解毒”；《随息居饮食谱》提到绿豆皮能够“清风热、去目翳、化斑疹、消肿胀”。作为绿豆芽加工的副产物，绿豆皮中含有很多生物活性成分，如多酚类化合物、生物碱、皂苷、蒽醌类化合物、鞣质等。但绿豆皮在绿豆深加工过程中常被废弃，造成很大的资源浪费和环境污染。
因此，从绿豆皮中开发提取用于延缓皮肤衰老的活性成分具有十分重要的意义。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种绿豆皮乙酸乙酯萃取物、活性成分组合及其在延缓皮肤衰老中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种绿豆皮乙酸乙酯萃取物，由如下方法制备而成：
将绿豆皮粉碎后加入乙醇溶液进行超声提取，离心，收集上清液，抽滤，得到滤液；滤液浓缩，得到乙醇粗提物浓缩液；
将乙醇粗提物浓缩液依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，收集乙酸乙酯相，浓缩、干燥，得到绿豆皮乙酸乙酯萃取物。
优选的，所述乙醇溶液的体积浓度为50-70％；绿豆皮与乙醇溶液加入量的比为1g:40mL。
所述绿豆皮乙酸乙酯萃取物中的活性成分包括：原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、芦丁、4-香豆酸、阿魏酸、异牡荆素、牡荆素和芥子酸。
本发明的第二方面，提供上述绿豆皮乙酸乙酯萃取物在制备延缓皮肤衰老的产品中的应用。
本发明的第三方面，提供活性成分组合在制备抑制β-半乳糖苷酶活性的制剂中的应用；
所述活性成分组合由异牡荆素和牡荆素组成。
上述应用中，优选的，所述活性成分组合由20μM的异牡荆素和20μM的牡荆素组成。
本发明的第四方面，提供活性成分组合在制备延缓皮肤衰老的产品中的应用；
所述活性成分组合由异牡荆素和牡荆素组成。
优选的，所述活性成分组合由20μM的异牡荆素和20μM的牡荆素组成。
本发明的有益效果：
(1)本发明研究发现绿豆皮乙酸乙酯萃取物对H2O2损伤后的皮肤细胞具有显著的保护效应，使HaCaT细胞和HSF细胞免受H2O2损伤，具有延缓皮肤衰老的活性。
(2)绿豆皮乙酸乙酯萃取物中的活性成分牡荆素和异牡荆素的组合具有抑制细胞衰老β-半乳糖苷酶活性的作用，在降低衰老细胞数量、延缓皮肤细胞衰老方面具有协同增效作用。
附图说明
图1：绿豆皮的提取分离流程图。
图2：没食子酸标准曲线。
图3：绿豆皮四种萃取相中总酚含量(没食子酸当量)。
图4：混合标准品总离子流图；
以乙腈为流动相的8种多酚，采用ESI-(A)和ESI+(B)模式进行总离子色谱分析。每种多酚的浓度为200ug/L。峰鉴别结果：1.原儿茶酸；2.绿原酸；3.咖啡酸；4.芦丁；5.4-香豆酸；6.芥子酸；7.阿魏酸；8.异牡荆素；9.牡荆素。
图5：四种绿豆皮萃取相总离子流图；A1、B1：乙酸乙酯萃取相；A2、B2：石油醚萃取相；A3、B3：正丁醇萃取相；A4、B4：水相；
以乙腈为流动相，采用ESI-(A)和ESI+(B)模式对绿豆皮水相、石油醚相、乙酸乙酯相和正丁醇相进行总离子色谱分析。每个萃取相的浓度均为200ug/L。峰鉴别结果：1.原儿茶酸；2.绿原酸；3.咖啡酸；4.芦丁；5.4-香豆酸；6.阿魏酸；7.异牡荆素；8.牡荆素。
图6：绿豆皮四种萃取相对皮肤细胞的毒性效应；A：乙酸乙酯萃取相；B：石油醚萃取相；C：正丁醇萃取相；D：水相。
图7：H2O2对HaCaT细胞(A)和HSF细胞(B)的毒性效应。
图8：绿豆皮四种萃取相对H2O2诱导的HaCaT和HSF氧化损伤的保护效应；A：乙酸乙酯萃取相；B：石油醚萃取相；C：正丁醇萃取相；D：水相。每列中字母不同者表示差异达显著水平(P＜0.05)。
图9：绿豆皮乙酸乙酯萃取相中八种多酚对H2O2损伤皮肤细胞存活率的影响。每列中字母不同者表示差异达显著水平(P＜0.05)。
图10：细胞衰老β-半乳糖苷酶活性检测结果；其中，A:荧光倒置显微镜下观察；B：Image J软件进行数据分析。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
实施例1：绿豆皮不同溶剂相萃取物的制备
(1)绿豆皮预处理：绿豆皮经粉碎机粉碎后过40目筛，得到绿豆皮粉末，将其密封，冷藏至4℃冰箱备用。
(2)提取：精确称量绿豆皮粉末50g，加入2L体积浓度为60％的乙醇溶液，超声提取，超声提取时间25min，超声温度60℃，超声功率为420W，超声次数3次。超声结束后，将混合液倒入离心管中，5000r/min离心10min。离心后缓慢倒出上清液，合并3次离心上清液并弃掉沉淀。绿豆皮离心上清液经分液漏斗减压抽滤后，得到较为澄清的滤液。采用减压旋转蒸发仪浓缩至50mL，除去乙醇，得到乙醇粗提物浓缩液。
(3)萃取分离：利用不同物质的极性差异，采用不同极性的有机溶剂对乙醇粗提物浓缩液进行萃取。
将上述步骤(2)得到的乙醇粗提物浓缩液依次经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，石油醚、乙酸乙酯、正丁醇与乙醇粗提物浓缩液的体积比均为1:1；静置分层后倒出，每种有机溶剂萃取3次，合并萃取液，分别得到石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相。将上述四种萃取相分别用旋转蒸发仪浓缩至10mL后装入不透气开口玻璃瓶内氮吹至膏状，置于4℃冰箱保存。
实施例2：绿豆皮不同溶剂相萃取物中总酚含量测定和活性成分鉴定
1、总酚含量测定：
(1)总酚标准曲线绘制
分别取质量浓度为0.105mg/mL的没食子酸溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于6支10mL具塞比色管中，依次加入20％福林酚试剂4.0mL，7.5％碳酸钠溶液2.0mL，用蒸馏定容至10mL后摇匀，避光静置90min后在765nm处测定其吸光值，以没食子酸当量表示总酚含量。以没食子酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作图(图2)。线性拟合后得到标准曲线方程：y＝0.853x-0.0005(r2＝0.9994)，用于后续绿豆皮各萃取相中总酚含量的测定。
(2)总酚得率计算
总酚得率：P％＝C×V×N/(m×103)×100％
C：标曲计算得出的待测液中多酚质量浓度μg/mL；
V：提取液体积mL；
N：稀释倍数；
m：称取绿豆皮粉末质量g。
绿豆皮经过乙醇提取后旋蒸得到多酚水溶液，按极性大小依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行分步萃取，分离得到四种萃取相，分别为石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相。用没食子酸标准曲线测得四种萃取相中总酚含量分别约为346.5μg/g、213.8μg/g、424.3μg/g和185.4μg/g。如图3所示，不同萃取相的绿豆皮多酚含量：正丁醇>石油醚>乙酸乙酯相>水相。正丁醇相和石油醚相中最多，约为乙酸乙酯相和水相总酚含量的2倍，说明绿豆皮中的总多酚的极性普遍大或者普遍小，更容易被极性大和极性小的溶剂萃取出来。
2、活性成分鉴定：
(1)供试样品液的制备：称取实施例1制备的绿豆皮四种萃取相浸膏各1mg，用一定量的色谱甲醇溶解，过0.22μm的微孔有机系滤膜，最终稀释成1mg/mL。
(2)HPLC条件：色谱柱：ACQUITY
Figure BDA0003678853810000041
BEH C18(100mm×2.1mm，1.7μm)色谱柱；流速为0.3mL/min；柱温为30℃；流动相：A为0.1％甲酸水溶液，B为乙腈；采用梯度洗脱，梯度洗脱程序如表1所示：
表1：HPLC洗脱条件
Figure BDA0003678853810000051
(3)质谱条件：采用高灵敏度的MRM方法对9种目标物进行分析，通过直接进样单个标准溶液、ESI+和ESI-全扫描方式选择合适的前体离子和产物离子，对MRM参数进行快速优化。
AB SCIEX QTRAP 5500系统。离子喷雾电压：4.5Kv；雾化压力：55psi；气帘气55psi；辅助加热器：13psi；离子源温度：300℃。质谱离子条件如表2所示：
表2：活性成分的质谱参数
Figure BDA0003678853810000052
混合标准品的总离子流图如图4所示，四种绿豆皮萃取相总离子流图如图5所示。根据总离子流图保留时间、MS/MS等数据，结合前人研究，乙酸乙酯萃取相共鉴定了8种绿豆皮多酚，分别为原儿茶酸、异牡荆素、牡荆素、咖啡酸、4-香豆酸、阿魏酸、芦丁、绿原酸。
以4-香豆酸、芦丁、绿原酸、异牡荆素、牡荆素、阿魏酸、咖啡酸、原儿茶酸和芥子酸标准品混合液作对照，根据峰面积和浓度建立标准曲线，对绿豆皮四种萃取相中的多酚进行定量分析。由表3所示，与其他萃取相相比，正丁醇相中绿原酸和芦丁含量最多；乙酸乙酯相中原儿茶酸、异牡荆素、牡荆素、咖啡酸、4-香豆酸和阿魏酸的含量最多，这些活性成分可能是影响绿豆皮乙酸乙酯萃取相抗氧化和延缓衰老活性的原因。
表3：绿豆各相萃取物活性成分含量
Figure BDA0003678853810000061
实施例3：绿豆皮四种萃取相抵御皮肤细胞损伤的能力分析
1、绿豆皮四种萃取相对皮肤细胞的毒性效应
为了研究绿豆皮的石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相对皮肤细胞(HaCaT细胞和HSF细胞)的活性作用，我们首先研究了绿豆皮的四种萃取相对皮肤细胞的毒性效应。
(1)细胞培养及传代
皮肤细胞长至80％左右时，倒掉培养瓶中的DMEM完全培养基，2mL PBS冲洗后倒掉，将2mL 0.25％的胰蛋白酶-EDTA消化液加入T25细胞培养瓶，并置于CO2培养箱消化10min(HaCaT细胞)或3min(HSF细胞)左右，待皮肤细胞消化完全后，加入3mL完全培养基并吹打均匀，经1000r/min离心5min，离心后弃掉培养基，加入2mL完全培养基将细胞团吹散并转移至T25细胞培养瓶中，置于37℃、5％二氧化碳的培养箱中培养。
(2)MTT实验
MTT被活细胞还原为不溶于水的紫色甲臜产物，经DMSO(二甲基亚砜)溶解后，可通过吸光度值的高低反映所测细胞中的活细胞数量多少。
T25培养瓶中的皮肤细胞长至80％左右时，将细胞悬浮液的细胞密度调整为5×105cells/mL(HSF细胞)，以每孔200μL细胞悬浮液加到96孔细胞培养板中。将细胞培养板置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h后，每孔细胞长至60％-70％。倒掉培养基，按实验设计在每孔加入200μL含有相应药物的，培养箱中培养24h，而含H2O2的基本培养基加入细胞培养板后培养2h。培养结束后，倒掉板中培养基，将0.5mg/mL MTT溶液以每孔100μL加入细胞培养板内，培养箱孵育4h后，倒掉MTT溶液，无菌PBS冲洗一遍。细胞培养板每孔加入100μL DMSO，避光震荡10min后，用酶标仪在570nm处测定吸光度值。细胞存活率计算公式如下：
Figure BDA0003678853810000071
公式中：A0为细胞背景孔的吸光度；A1为药物处理孔的吸光度；A2为空白对照孔的吸光度。
MTT法测定HaCaT细胞和HSF细胞的存活率。绿豆皮四种萃取相都经DMSO溶解超声后0.22μm有机系滤膜过滤除菌，用DMEM培养基稀释为0.2、0.5、1、2、5、10、20、50μg/mL，分别处理HaCaT细胞和HSF细胞24h。绿豆皮四种不同浓度的萃取相对两细胞的毒性效应如图6所示。实验结果显示，10μg/mL以内，两种皮肤细胞存活率均在80％以上，可以认为绿豆皮四种萃取相的浓度在10μg/mL以内对HaCaT细胞和HSF细胞均无毒性效应。因此，后续的细胞实验选择各萃取相在0-10μg/mL的浓度范围进行处理和分析。
用不同浓度的H2O2处理HaCaT细胞和HSF细胞2h，MTT法测定两种皮肤细胞存活率，以H2O2 IC50值作为细胞氧化损伤模型的处理浓度。
2、HaCaT细胞和HSF细胞氧化损伤模型的建立：
如图7所示，与对照组相比，随着H2O2浓度的升高，HaCaT细胞和HSF细胞的存活率先略有上升后逐渐降低，说明低浓度H2O2不会引起细胞死亡，还能有效促进细胞增殖(P<0.05)，高浓度H2O2诱导皮肤细胞死亡。GraphPad Prism 5.0软件拟合H2O2浓度与细胞存活率的关系，计算结果表明在HaCaT细胞中H2O2 IC50值为816.1μM，在HSF细胞中H2O2 IC50值为733.8μM。为了缩短损伤时间，我们选择2h作为处理时间。因此，后期实验采用800μM H2O2处理2h建立HaCaT细胞氧化损伤模型；采用700μΜH2O2处理2h建立HSF细胞氧化损伤模型。
3、绿豆皮四种萃取相对H2O2损伤的HaCaT细胞和HSF细胞存活率的影响
绿豆皮四种不同浓度(0.5～10μg/mL)的萃取相对HaCaT细胞和HSF细胞预处理24h后，加相应浓度的H2O2处理细胞2h，用MTT法探究绿豆皮四种萃取相对氧化损伤的保护效应，筛选出活性较好的萃取相并确定浓度范围，用于后续抗氧化和延缓衰老实验。
由图8可知，与其他萃取相相比，乙酸乙酯相在0.5～2μg/mL的范围内，对H2O2损伤后的皮肤细胞具有显著的保护效应(P<0.05)，使HaCaT细胞和HSF细胞免受H2O2损伤，由此可以推断绿豆乙酸乙酯萃取相可能有抗氧化能力。后续选择乙酸乙酯相(0.5～2μg/mL)继续研究其抗氧化以及延缓衰老活性。
4、绿豆皮乙酸乙酯萃取相中活性成分保护皮肤细胞免受氧化损伤作用
绿豆皮乙酸乙酯萃取相中的8种活性物质经MTT实验确定无毒剂量浓度，预处理HaCaT细胞和HSF细胞后，经氧化损伤模型损伤后，得到最佳处理浓度和保护效果，两细胞增殖情况如图9所示。芦丁(50μM)、异牡荆素(20μM)及牡荆素(20μM)处理都能显著促进H2O2损伤的HaCaT细胞和HSF细胞的增殖(P<0.05)，说明芦丁、牡荆素和异牡荆素均能保护皮肤细胞免受H2O2损伤，而其他活性成分的保护效果不明显，即使是含量最多的原儿茶酸量保护效果也不显著。芦丁在绿豆皮中含量少且分布普遍，而牡荆素和异牡荆素是绿豆皮中特殊的活性成分，因此选择牡荆素和异牡荆素探究抗氧化和延缓衰老活性。
实施例4：牡荆素和异牡荆素及其组合对H2O2损伤的HSF细胞的延缓衰老活性研究
绝大多数正常细胞具有有限的分裂能力，在不能分裂后就进入衰老状态，此时细胞仍然是存活的，但细胞的基因和蛋白的表达谱发生了很大改变。衰老的细胞不能在一些常规的刺激下再诱导细胞分裂，并且衰老细胞的细胞周期分布也比较特殊，不同于一些损伤诱导的细胞休眠，也不同于细胞生长接触抑制的情况，是生物体老化的一种潜在原因。衰老细胞通常体积变大，并表达在pH6.0时有高酶活性的β-半乳糖苷酶，因此我们用β-半乳糖苷酶活性来表征皮肤细胞衰老。
由于在HacaT细胞中β-半乳糖苷酶不表达，因此后续只用200μM H2O2处理HSF细胞来建立皮肤细胞衰老模型，研究活性物质的延缓衰老能力。
试验设有5个处理，分别为：
CK：HSF细胞，不做处理。
H2O2(200μM)：200μM H2O2处理HSF细胞2h。
Isovitexin(20μM)：20μM的异牡荆素预处理24h后，再添加200μM H2O2处理HSF细胞2h。
vitexin(20μM)：20μM的牡荆素预处理24h后，再添加200μM H2O2处理HSF细胞2h。
Vitexin+Isovitexin(20+20μM)：20μM的牡荆素和20μM的异牡荆素预处理24h后，再添加200μM H2O2处理HSF细胞2h。
对上述5个处理的细胞中的β-半乳糖苷酶进行测定，方法如下：
β-半乳糖苷酶染色试剂盒是一种基于衰老时SA-β-Gal(senescence-associatedβ-galactosidase)活性水平上调而对衰老细胞或组织进行染色检测的试剂盒，以X-Gal为底物，在衰老特异性的β-半乳糖苷酶催化下会生成深蓝色产物。根据试剂盒的配比(染色液A:染色液B:染色液C:X-Gal溶液＝10:10:930:50)和所需体积配好染色工作液。取出6孔板并弃去板内细胞培养液，用PBS洗涤1～2次至培养液无残留。洗涤后每孔加入1mLβ-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15min。吸除细胞固定液，PBS洗涤细胞3次，每次3秒，至无固定液残留。6孔板每孔加入1mLβ-半乳糖苷酶染色工作液。用封口膜或保鲜膜封住6孔板防止蒸发，37℃孵育过夜(注：不能在二氧化碳培养箱中进行)，荧光倒置显微镜下观察，拍照后如不能及时观察计数，可以去除染色工作液，加入2mL PBS，4℃保存数天。Image J软件进行数据分析。
细胞衰老β-半乳糖苷酶活性情况如图10所示。由图10B可以看出200μM H2O2损伤组细胞衰老β-半乳糖苷酶活性显著上调(相较于CK的比值为2.249)，说明衰老细胞数量增多。与H2O2损伤组相比，牡荆素和异牡荆素处理显著降低了衰老β-半乳糖苷酶的活性(P<0.05)，其中，牡荆素相较于CK的比值为1.735，异牡荆素相较于CK的比值为1.783；二者联用显著降低β-半乳糖苷酶水平(二者联用相较于CK的比值为1.166)。说明牡荆素和异牡荆素均下调了衰老β-半乳糖苷酶活性，且二者联用效果较单独处理显著，显著降低了衰老细胞的数量，在延缓HSF细胞衰老方面具有协同增效作用，取得了1+1>2的作用效果。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (2)

1.活性成分组合在制备抑制β-半乳糖苷酶活性的制剂中的应用；
所述活性成分组合由20μM的异牡荆素和20μM的牡荆素组成。
2.活性成分组合在制备延缓皮肤衰老的产品中的应用；所述皮肤衰老是由H2O2损伤引起的；
所述活性成分组合由20μM的异牡荆素和20μM的牡荆素组成。
CN202210628457.1A 2022-06-06 2022-06-06 绿豆皮乙酸乙酯萃取物、活性成分组合及其在延缓皮肤衰老中的应用 Active CN114917270B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210628457.1A CN114917270B (zh) 2022-06-06 2022-06-06 绿豆皮乙酸乙酯萃取物、活性成分组合及其在延缓皮肤衰老中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210628457.1A CN114917270B (zh) 2022-06-06 2022-06-06 绿豆皮乙酸乙酯萃取物、活性成分组合及其在延缓皮肤衰老中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114917270A CN114917270A (zh) 2022-08-19
CN114917270B true CN114917270B (zh) 2023-04-07

Family

ID=82812237

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210628457.1A Active CN114917270B (zh) 2022-06-06 2022-06-06 绿豆皮乙酸乙酯萃取物、活性成分组合及其在延缓皮肤衰老中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114917270B (zh)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090045964A (ko) * 2007-10-30 2009-05-11 전라남도 깐녹두 부산물을 이용한 녹두 유래 비텍신의 저비용순수분리 방법
CN107625672A (zh) * 2016-07-14 2018-01-26 中国农业科学院作物科学研究所 一种从绿豆皮中同时提取多种有效成分的方法及应用
CN108030711A (zh) * 2017-12-18 2018-05-15 东莞俏美肌生物科技有限公司 美白护肤品

Also Published As

Publication number Publication date
CN114917270A (zh) 2022-08-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wojdyło et al. Effect of different pre-treatment maceration techniques on the content of phenolic compounds and color of Dornfelder wines elaborated in cold climate
Roesler et al. Antioxidant activity of Annona crassiflora: Characterization of major components by electrospray ionization mass spectrometry
Asiedu-Gyekye et al. Comparative study of two kalanchoe species: total flavonoid, phenolic contents and antioxidant properties
Zielinska et al. Determination of the antioxidant activity of rutin and its contribution to the antioxidant capacity of diversified buckwheat origin material by updated analytical strategies
CN109846743A (zh) 一种保湿修复组合物及其制备方法和应用
KR102232572B1 (ko) 병풀 추출물을 이용한 화장료 조성물 제조 방법
CN114917270B (zh) 绿豆皮乙酸乙酯萃取物、活性成分组合及其在延缓皮肤衰老中的应用
KR102334376B1 (ko) 붉나무 추출물을 포함하는 염증성 피부트러블 완화용 화장품 조성물
KR20180020573A (ko) 팬다 고무나무 및 스킨답서스 추출물을 유효성분으로 함유하는 중금속 또는 미세먼지 제거용 화장료 조성물
KR101909594B1 (ko) 관음죽 및 인도 고무나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 중금속 또는 미세먼지 제거용 화장료 조성물
CN113559024A (zh) 莲花花瓣提取物发酵产品的制备方法及其用途
CN115252496A (zh) 一种余甘子提取物的制备方法及其在防治紫外线损伤中的应用
Yang et al. Separation and identification of an abundant trigalloylglucose from special tea genetic resources
CN106176564B (zh) 利用人参内生真菌制备人参白茯苓发酵液的方法
CN114469820A (zh) 油橄榄叶提取物及其在制备皮肤美白用化妆品中的应用
Hu et al. Characterization of precipitation from citrus vinegar during ageing: chemical constituents, formation mechanism and anti-proliferative effect
Adhikari et al. Effect of drying temperature and natural fermentation on the phytochemical composition of stinging nettle buds (Urtica parviflora)
CN117503661B (zh) 刺梨提取物的制备方法及其冻干粉在化妆品中的应用
Fall et al. Phytochemical screening, phenol content and antioxidant studies of ethanol leaf extract of Celtis toka (Forssk.) Hepper & JRI Wood
US20030202984A1 (en) Active oxygen scavenger and cancer chemopreventer from Grifola
CN108041599B (zh) 凤眼果果皮提取物及其制备方法和应用
CN114891852B (zh) 获得高含量仙客来皂甙发酵液的方法、发酵液及其应用
CN117547498B (zh) 一种酒糟美肤水及其制备方法与应用
Shukla et al. Preclinical evaluation of rhizomes for wound healing activity with Alpinia galanga reducing oxidative status
Tulsawani et al. Effect of storage temperature on bio-efficacy of aqueous extract of Ganoderma lucidum

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant