CN108041599B - 凤眼果果皮提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了凤眼果果皮提取物及其制备方法和应用。该方法包括以下步骤：（1）将凤眼果果皮晒干，然后粉碎过筛得到粗粉，再将所得粗粉用乙醇溶液提取，过滤除去滤渣，滤液减压浓缩至浸膏；（2）将所得浸膏取一部分留用作为乙醇总相，另一部分用正己烷萃取，得到正己烷相和乙醇相1，再用乙酸乙酯对乙醇相1进行萃取得到乙酸乙酯相和乙醇相2、然后用正丁醇对乙醇相2进行萃取得到正丁醇相和乙醇相3；（3）分别将所得乙醇总相、正己烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相减压浓缩至浸膏，得凤眼果果皮提取物。本发明的提取物来源于凤眼果废弃的果皮，有利于废弃物的回收再利用，同时该产品具有较好的抗氧化和降血糖活性，可用于食品添加剂和功能性食品。

Description

凤眼果果皮提取物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于食品技术领域，具体涉及凤眼果果皮提取物及其制备方法和应用。
背景技术
糖尿病是二十一世纪困扰人们的一种慢性疾病。而α-葡萄糖苷酶是生物体糖代谢的一种重要的酶，它可以使体内血糖含量上升，使人体产生高血糖的症状，进而使人体功能产生代谢紊乱。而抑制剂可以抑制α-葡萄糖苷酶的活力，使血糖含量降低。
凤眼果是梧桐科乔木，凤眼果原产中国南部，在广东、广西和台湾等省区有少量栽种，栽培历史达到800余年，此外在印度、越南、印度尼西亚等地亦有分布。凤眼果具有较好的食用价值、医药价值、观赏价值。尽管凤眼果具有较强的适应能力和很好的商业价值，但目前凤眼果仍未进行大规模种植。经研究发现凤眼果果皮中含有丰富的天然多酚类物质，如槲皮素等。凤眼果果皮提取物在抗氧化、抗肿瘤、降血糖、抑菌等方面有潜在的生物活性。凤眼果的果实需蒸煮后食用，但果皮被丢弃，而凤眼果果皮占了整果相当大的比重，对其生物活性的探究有重要的意义。
发明内容
为了解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供凤眼果果皮提取物的制备方法。
本发明的另一个目的在于提供一种通过上述方法制备得到的凤眼果果皮提取物。
本发明的再一目的在于提供上述凤眼果果皮提取物在制备预防和治疗糖尿病的功能食品和药物中的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现。
凤眼果果皮提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)取凤眼果的果皮，将凤眼果果皮晒干，然后高速粉碎过筛得到粗粉，再将所得粗粉用乙醇溶液提取，过滤除去滤渣，滤液减压浓缩至浸膏；
(2)将步骤(1)所得浸膏取一部分留用作为乙醇总相，另一部分用正己烷进行萃取，得到正己烷相和乙醇相1，再用乙酸乙酯对乙醇相1进行萃取得到乙酸乙酯相和乙醇相2、然后用正丁醇对乙醇相2进行萃取得到正丁醇相和乙醇相3；
(3)分别将步骤(2)所得乙醇总相、正己烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相减压浓缩至浸膏，得凤眼果果皮提取物。
优选的，步骤(1)所述粗粉与乙醇溶液的质量体积比为1：(5～15)g/ml。
优选的，步骤(1)所述乙醇溶液是指体积分数为95％的乙醇水溶液。
优选的，步骤(1)所述的提取是指在静态或动态下，进行浸渍提取。
优选的，所述浸渍提取的时间为1-3天，温度为20-30℃。
优选的，步骤(2)所述用正己烷进行萃取是指用相当于待萃取溶液1～2倍体积的正己烷萃取。
优选的，步骤(2)所述用乙酸乙酯对乙醇相1进行萃取是指用相当于待萃取溶液1～2倍体积的乙酸乙酯萃取。
优选的，步骤(2)所述用正丁醇对乙醇相进行萃取是指用相当于待萃取溶液1～2倍体积的正丁醇萃取。
由以上所述的制备方法制得的凤眼果果皮提取物，所述凤眼果果皮提取物具有较好的抗氧化活性和一定的降血糖活性。所述凤眼果提取物有丰富的多酚、黄酮、甾醇、萜类物质，目前鉴定或暂时鉴定出Myricetin(杨梅酮)、quercetin(槲皮素)、β-Sitosterol(β-谷甾醇)、oryzalexin E(稻叶素E)等16种成分。
以上所述的凤眼果果皮提取物在制备预防和治疗糖尿病的功能食品和药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明的提取物来源于凤眼果废弃的果皮，有利于废弃物的回收再利用，同时该提取物具有较好的抗氧化和降血糖活性，可用于食品添加剂和功能性食品。
2、本发明的提取物含有丰富的多酚、黄酮、甾醇、萜类物质，且目前已经鉴定出Myricetin(杨梅酮)、quercetin(槲皮素)、棕榈酸、乙酯十五烷酸等物质，可作为上述天然物质的天然来源。
附图说明
图1为实施例1-3的凤眼果果皮提取物的提取路线示意图。
图2为实施例3所得产物的还原力测试曲线图。
图3为实施例3所得产物的细胞增殖与毒性变化曲线图。
图4为实施例3所得产物凤眼果果皮提取物的MS总粒子流图。
图5为实施例3所得产物凤眼果果皮提取物的MS/MS总离子流图。
图6为实施例3所得产物凤眼果果皮提取物的总气相色谱峰图。
具体实施方式
下面结合实例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本实施例的一种凤眼果果皮提取物的制备方法，提取路线图如图1所示，具体提取步骤如下：
(1)选购新鲜的凤眼果果皮，将凤眼果果皮粉碎，40℃干燥。过40目筛得到粗粉，于常温保存。取300g上述凤眼果皮粗粉，用1500ml体积比为95％的乙醇水溶液浸泡3天，过滤除去滤渣，滤渣再用95％的乙醇水溶液浸泡3天，重复上述浸泡过滤3次，合并滤液，减压浓缩至浸膏。
(2)将步骤(1)获得的浸膏的一部分留作乙醇总相，另一部分用1000ml正己烷进行萃取，得到正己烷相和乙醇相1，然后用1000ml乙酸乙酯对乙醇相1进行萃取得到乙酸乙酯相和乙醇相2，再用1000ml正丁醇对乙醇相2进行萃取得到正丁醇相和乙醇相3。分别将上述所得乙醇总相、正己烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相减压浓缩至浸膏分别为乙醇总相1、正己烷相1、乙酸乙酯相1、正丁醇相1，得凤眼果果皮提取物。
实施例2
(1)选购新鲜的凤眼果果皮，将凤眼果果皮粉碎，40℃干燥。过40目筛得到粗粉，于常温保存。取300g上述凤眼果皮粗粉，用3000ml体积比为95％的乙醇水溶液浸泡3天，过滤除去滤渣，滤渣再用95％的乙醇水溶液浸泡3天，重复上述浸泡过滤3次，合并滤液，减压浓缩至浸膏。
(2)将步骤(1)获得的浸膏的一部分留作乙醇总相，另一部分用1000ml正己烷进行萃取，得到正己烷相和乙醇相1，然后用1000ml乙酸乙酯对乙醇相1进行萃取得到乙酸乙酯相和乙醇相2，再用1000ml正丁醇对乙醇相2进行萃取得到正丁醇相和乙醇相3。分别将上述所得乙醇总相、正己烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相减压浓缩至浸膏分别为乙醇总相2、正己烷相2、乙酸乙酯相2、正丁醇相2，得凤眼果果皮提取物。
实施例3
(1)选购新鲜的凤眼果果皮，将凤眼果果皮粉碎，40℃干燥。过40目筛得到粗粉，于常温保存。取300g上述凤眼果皮粗粉，用4500ml体积比为95％的乙醇水溶液浸泡3天，过滤除去滤渣，滤渣再用95％的乙醇水溶液浸泡3天，重复上述浸泡过滤3次，合并滤液，减压浓缩至浸膏。
(2)将步骤(1)获得的浸膏的一部分留作乙醇总相，另一部分用1000ml正己烷进行萃取，得到正己烷相和乙醇相1，然后用1000ml乙酸乙酯对乙醇相1进行萃取得到乙酸乙酯相和乙醇相2，再用1000ml正丁醇对乙醇相2进行萃取得到正丁醇相和乙醇相3。分别将上述所得乙醇总相、正己烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相减压浓缩至浸膏乙醇总相3、正己烷相3、乙酸乙酯相3、正丁醇相3，得凤眼果果皮提取物。
以上各实施例所得凤眼果果皮提取物的理化性质的测定如下。
1.多酚含量测定：
采用改进的Folin-Ciocalteu(FC)比色法测定多酚含量。标准曲线测定：精密称取没食子酸10mg，用去离子水定容至100ml，得到没食子酸标准品溶液。准确吸取标准溶液0，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60和0.70ml于10ml比色管中，依次加人1.0ml FC试剂(0.2mol/L)和2ml 15wt％Na2CO3溶液，用去离子水定容至10ml，充分混合后，常温放置1h，于760nm波长下测定吸光值，至少重复三组平行实验。以吸光度为纵坐标，没食子酸浓度为横坐标绘制标准曲线。
所得没食子酸标准曲线:y＝0.0037x+0.0264，R2＝0.9992(式中y为吸光度值，x为没食子酸浓度，0<x<700μg/ml)
准确量取凤眼果果皮各相萃取液10.0ml，置于高速离心机离心分层(15 000r/min，15min)，吸取样品4.0ml，置于10ml容量瓶，用去离子水稀释至刻度，从中取1.0ml按照“标准曲线测定”的方法，测定凤眼果果皮提取物各相萃取液的多酚含量。
结果计算：
(1)根据标准曲线四相样品中多酚的没食子酸当量C1(μg/ml)；
(2)则每相中多酚的没食子酸总当量为：M1＝C1×V
(3)每100g各相萃取物中包含各相没食子酸当量:X1＝(M1/M2)×100式中，M2为各相萃取物的质量(μg)；V为每相的体积(ml)。
2.黄酮含量测定
黄酮含量的测量通过“总黄酮标准曲线测定”的方法测定黄酮的含量。标准曲线的绘制：准确称取29.0mg的儿茶素，配制THF:乙醇(体积比1:1)溶液，用其溶解儿茶素，定容至10mL，配成10.0mmol/L的儿茶素标准溶液摇匀备用。配制0.3，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，8.0，10mol/L的不同浓度的标准儿茶素溶液。依次往各浓度儿茶素标液中加人0.5mL50.0mmol/LNaBH4溶液和0.5mL 74.6mmol/L的AlCl·6H2O溶液，摇匀震荡30min；加入50.0mmol/LNaBH4溶液0.5mL，摇匀震荡30min；加人2.0mL冰乙酸，摇匀避光震荡15min；加入20mmol/L的四氯代苯对醌THF(四氢呋喃)溶液1mL，摇匀；在95℃的温度下油浴1h，之后将试管拿出自然冷却，用甲醇定容至4mL；加入16wt％香草醛溶液1mL和12mol/LHCl溶液2mL，避光放置15min；离心，在490nm处测定溶液的吸光度，以吸光度A为纵坐标，总黄酮的含量为横坐标，绘制标准曲线。得到儿茶素标准曲线:Y＝0.153X+0.006(R2＝0.9993)(X为儿茶素浓度，Y为吸光度值)
各萃取相总黄酮含量测定：从每个样品中取出100μL，通过以下公式计算的方法测定黄酮的含量。将实验所得吸光度代入标准曲线确定样品总黄酮的量。每个样品测3个平行样。结果计算：
(1)根据标准曲线四相样品中黄酮的儿茶素当量C2(mmol/ml)；
(2)则每相中的儿茶素总当量为：M3＝C2×V
(3)每100g各相萃取物中的儿茶素当量：X2＝(M3/M2)×100
式中，M2为各相萃取物重量；V为各相体积(ml)。
经检测凤眼果果皮各相提取物中多酚和黄酮的含量如表1所示：
表1
Figure BDA0001510902470000051
由表1可知，从实施例1、实施例2、实施例3所得风眼果果皮各相提取物均含有一定的多酚黄酮含量，其中实施例1、实施例2、实施例3的乙酸乙酯相的多酚含量明显高于其他几个相的多酚含量。由于三个实施例的多酚黄酮含量相近，故后续的实验测定取实施例3所获得的凤眼果果皮提取物进行。
3.抗氧化活性测定：
(1)氧自由基吸收能力(ORAC)测定
实验所用的抗氧化标准物质Trolox(维生素E水溶性类似物)、FL(荧光素钠盐)以及ABAP(2,2'-偶氮二异丁基脒二盐酸盐，自由基诱发剂)均用75mM磷酸二氢钾-磷酸氢二钾(pH＝7.4)缓冲溶液配制。标准品Trolox需配制成系列浓度(6.25，12.5，25，50μM)。待测样品用磷酸盐缓冲溶液稀释待用。操作步骤：在96孔黑色底部透明微孔板相应的微孔中分别加入20μL抗氧化物质(Trolox或待测样品)，37℃下暗处孵化10min；然后加入200μL荧光工作液(0.96μM)，在37℃孵育20min；随后迅速在各个微孔中加入20μLABAP(119μM)溶液，在37℃恒温下以激发波长485nm，发射波长538nm进行连续测定，每5min测定一次各孔荧光强度，测定时长2.5h。其中单孔每次测定荧光强度分别记为f0，f1，f2···fn，磷酸盐缓冲液代替抗氧化物质为实验空白，以Trolox为标准品绘制标准曲线，所有样品都采用三次平行试验。
根据不同时间点的绝对荧光强度数据与ABAP空白荧光强度相比，折算成相对荧光强度，以相对荧光强度采用近似积分法计算荧光熄灭曲线下面积(AUC)，AUC的计算公式如下：
Figure BDA0001510902470000061
其中f0表示初始荧光值(T＝0)；fn表示最终荧光值。
抗氧化剂作用下的AUC与无抗氧化剂存在时(空白)自由基的AUC的差值为荧光熄灭曲线的延迟部分面积(Net AUC)—抗氧化剂的保护面积。
Net AUC的计算公式为：Net AUC＝AUCsample－AUCblank (2-3)
根据Trolox浓度和荧光熄灭曲线延迟部分面积(AUC)之间的回归方程来计算ORAC值，并表示为μM Trolox/μM样品或μM Trolox/μg样品。
经检测各相提取物中的Trolox当量值如表2所示：
表2
Figure BDA0001510902470000062
Figure BDA0001510902470000071
由表2可知，凤眼果果皮各相提取物的ORAC值，其中乙酸乙酯相的ORAC值最高，为228.22±28.50μmol/mg DW，表明其氧自由基吸收能力最强。四相提取物的氧自由基吸收能力强弱顺序为：乙酸乙酯相3>乙醇相3>正己烷相3>正丁醇3。
(2)过氧自由基清除能力(PSC)测定
用75mM的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)将新配制的没食子酸与抗坏血酸溶液稀释五个浓度梯度，用作标准。在96孔荧光板相应微孔中分别依次加入100μL抗氧化物质(标准品或待测样品)和100μL DCFH-DA(13.26mM)(预先用1mM KOH水解以除去其中的双醋酸盐DA，并用75mM的磷酸盐缓冲液定容)，以及50μLABAP(40mM)。在37℃恒温下以激发波长485nm，发射波长538nm进行连续测定，测定时长40min。磷酸盐缓冲液代替抗氧化物质为实验空白，以平均荧光面积(对于提取液和标准品的反应时间动力学曲线AUC)为计算抗氧化能力的基础。抗氧化能力的计算公式如下：
PSC Value＝1－(SA/CA) (2-4)
式中SA是样品和标准品的荧光积累量，CA是空白对照的荧光积累量。化合物和提取物抑制了DCFH的氧化作用，导致产生较小的SA，较高的PSC值。
经检测各相提取物中的EC50和PSC值如表3所示：
表3
Figure BDA0001510902470000072
由表3可知凤眼果果皮各相提取物的PSC值，其中乙酸乙酯相3的PSC值最高，为83.8mmol Vc当量/mg，表明其过氧自由基清除能力最强。四相提取物的氧自由基吸收能力强弱顺序为：乙酸乙酯相3>乙醇相3>正己烷相3>正丁醇3。
(3)DPPH自由基清除活性的测定
配置DPPH溶液：用无水乙醇溶液配成浓度为2mmol/L的DPPH的储存液。放入4℃冰箱中用棕色瓶避光保存。测定前用无水乙醇稀释DPPH储存液成0.2mmol/L的DPPH工作液。将1mL的样品溶液加到1mL的0.2mmol/L DPPH工作液中，在避光下混合均匀，将混合液于暗室室温放置30分钟。在λ＝517nm下测定在反应后溶液的吸光值。用无水乙醇进行调零，以Vc溶液作为阳性对照，重复上述操作。计算DPPH抑制率：DPPH自由基抑制率％＝(1-(A样-A对)/A0)×100％(A0为不加样品的控制组的吸光值；A样为样品加了DPPH溶液的吸光值；A对为样品不加DPPH溶液的吸光值。)
经检测各相提取物中的DPPH自由基清除能力的EC50值如表4所示：
表4
Figure BDA0001510902470000081
由表4可知凤眼果果皮各相提取物的DPPH自由基清除率的EC50值，其中乙酸乙酯相3的EC50值为2.09±0.18mg/mL，表明该相物质的浓度约为2.09mg/mL时，DPPH自由基清除率就可以达到50％左右，其EC50值明显低于其他三相，表明其对DPPH自由基清除率活性最好。而正丁醇的EC50值最大，表明该相物质的浓度约为6.26mg/mL时，DPPH自由基清除率才达到50％左右，表明其对DPPH自由基清除活性较弱。四相提取物的DPPH自由基清除活性顺序为：乙酸乙酯相3>乙醇相3>正己烷相3>正丁醇相3。
(4)ABTS+自由基清除活性的测定
用无水乙醇溶液配制50mL 7mmol/L的ABTS+·溶液和50mL 4.9mmol/L过硫酸钾溶液，两种液体等体积混合。摇匀后，混合液于暗处室温放置16h。配成ABTS储存液。在进行实验前用无水乙醇溶液稀释ABTS储存液，使其用紫外分光光度计于λ＝734nm处的测量到的吸光值为0.700±0.02。将20μL的样品溶液与2mL的ABTS工作液在避光下混合均匀，将混合液于暗室室温放置15分钟。在λ＝734nm下测定溶液的吸光值。以Vc作为阳性对照，代替样品溶液重复上述操作。计算ABTS+自由基清除率：ABTS+·抑制率％＝(1-(A样-A对)/A0)×100％(A0为不加样品的控制组的吸光值；A样为样品加了ABTS+·溶液在734nm处的吸光值；A对为样品不加ABTS溶液在734nm处的吸光值。)
经检测各相提取物中的ABTS+自由基清除能力的EC50值如表5所示：
表5
Figure BDA0001510902470000091
由表5可知凤眼果果皮各相提取物的ABTS+自由基清除率的EC50值，其中乙醇总相3的EC50值为8.51±0.05mg/mL，表明该相物质的浓度约为8.5mg/mL时，ABTS+自由基清除率达到50％左右，其EC50值明显低于其他三相，表明其ABTS+抑制率活性最好。乙酸乙酯相3的EC50值为29.28±1.37mg/mL，表明该相物质的浓度约为29mg/mL时，ABTS+自由基清除率达到50％左右。正己烷相3的EC50值为47.49±0.25mg/mL。正丁醇相3由于其ABTS+自由基活性太差，因此计算其EC50值误差较大。四相提取物的ABTS+自由基清除活性顺序为：乙醇相3>乙酸乙酯相3>正己烷相3>正丁醇3。
(5)还原力的测定
用超纯水分别配置0.2mol/L pH＝6.6的磷酸盐缓冲溶液、1％(m/v)的铁氰化钾溶液、10％(w/v)的三氯乙酸溶液以及0.1％(w/v)的氯化铁溶液。用磷酸盐缓冲溶液(PBS)配置凤眼果果皮的各相萃取物成各个浓度的样品溶液。2mL样品溶液加到2mL PBS溶液和2mLK3[Fe(CN)6]的混合液中。混合后溶液在50℃水浴锅水浴20分钟，然后在反应混合物中加入2mL的三氯乙酸溶液，混合后以3000rpm离心10分钟，取上清液2mL与2mL蒸馏水以及0.4mLFeCl3溶液在反应试管中反应，10分钟后用紫外分光光度计测定其在λ＝700nm处的吸光值。以Vc溶液代替样品溶液重复上述操作进行对照。结果如图2所示，由图2可知，凤眼果果皮各相的还原力大小顺序为：乙酸乙酯相3>乙醇相3>正丁醇3>正己烷相3。从图中可看出凤眼果果皮各相物质的还原力都随着样品浓度的增大而增大。其中乙酸乙酯相的还原力明显高于凤眼果果皮其他三相物质。
4.体外降血糖(α-葡萄糖苷酶的抑制活性)实验
配置缓冲溶液：100mmol/L，pH＝6.9的磷酸盐缓冲液(PBS溶液)；用PBS溶液配制成1U/mL的酶溶液。用PBS溶液配置成各个浓度的样品溶液。用PBS溶液配制成3mmol/L的pNPG[葡萄糖苷酶的底物]底物溶液。将50μL样品加入到96孔板中，然后加入100μL的α-葡萄糖苷酶溶液，混合均匀，在25℃孵育(反应)10min，然后加入50μL底物溶液(pNPG)，在25℃下孵育(反应)5min。用酶标仪测定其在405nm处的吸光值As。同时设定空白组(缓冲液+酶+底物)，空白对照组(缓冲液+缓冲液+底物)，背景对照组(样品+缓冲液+底物)。
α-葡萄糖苷酶的抑制率＝[1-(As-Ab)/(At-Ac)]×100％。
式中As、At、Ac、Ab分别为405nm处样品测定组、空白组，空白对照组，背景对照组的吸光值。其结果如表6所示
表6
Figure BDA0001510902470000101
由表6可知，是凤眼果果皮各相提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性大小顺序为：正己烷相3>乙酸乙酯相3>正丁醇相3>乙醇相3。正己烷相3的对α-葡萄糖苷酶的抑制能力明显高于凤眼果果皮的其他三个相，当正己烷相3的浓度为50mg/mL时，其对α-葡萄糖苷酶的抑制率为58.27±1.10％，当乙酸乙酯相3的浓度为50mg/mL时，其对α-葡萄糖苷酶的抑制率为17.11±1.69％，当正丁醇相3的浓度为50mg/mL时，其对α-葡萄糖苷酶的抑制率为16.44±1.41％，乙醇相3的α-葡萄糖苷酶的抑制率最低，当乙醇相3的浓度为50mg/mL时，其对α-葡萄糖苷酶的抑制率仅有5.12±1.27％。
5.HepG2癌细胞抗增殖测定
细胞培养：人肝癌细胞HepG2，培养在完全培养基中(complete medium,CM)；代数为12-30代。药物的配制：将化合物溶解在甲醇中，于-20℃冰箱保存，实验前用培养基稀释到所需要的化合物浓度(甲醇终浓度低于3％v/v)。
方法：除去培养基，用冷的PBS洗涤。然后，用胰蛋白酶将贴壁的细胞消化下来。消化时间为2min，加入4mL的wash培养基终止消化。用移液管将培养液转移到离心管中，在4℃的温度下，760rmp离心4min。计数。
细胞毒性实验：将细胞以2.5×104个/孔的细胞密度接种于96孔板中(96孔板的外圈加入PBS作为保护液)，每孔均100μL。在5vol％CO2培养箱中保持37℃下培养4小时后，每孔均加入100μL的样品，每个浓度重复3个孔。不加药物，只加3wt％的甲醇的组为对照组。放入培养箱中培养48小时后，取出96孔板，加入100μL的PBS洗涤后，在含有细胞的孔中每孔加入50μL的亚甲基蓝溶液在培养箱中培养1h，然后用清水漂洗去除细胞上的亚甲基蓝浮色，吸水纸拍打吸干板上的水分，拍干水后在含有细胞的孔中每孔加入100μL的洗脱溶液(空白组同样加入100μL的洗脱溶液)。在振荡器上震荡20min后利用酶标仪在595nm下进行读数。
药物的细胞毒性：细胞死亡率(％)＝1－[A595(加药组)-A595(空白组)]/[A595(对照组)-A595空白组)]×100％。
细胞抗增殖实验：将细胞以4×104个/孔的细胞密度接种于96孔板中(96孔板的外圈加入一圈的PBS作为保护液)，每孔均100μL。培养细胞4小时后，加入含有样品的培养基，每孔均100μL，每个浓度重复3个孔。同时在96孔板中设置不加药细胞孔作为对照组。放入培养箱中培养48小时后，取出96孔板，用亚甲基蓝法测定药物的作用。取出培养板吸出培养基，加入100μL的PBS洗涤后吸出PBS，然后在含有细胞的孔中每孔加入50μL的亚甲基蓝溶液，在培养箱中培养1h，然后用清水漂洗去除细胞上的亚甲基蓝浮色，吸水纸拍打吸干板上的水分，拍干水后在含有细胞的孔中每孔加入100μL的洗脱溶液(空白组也同时加入100μL的洗脱溶液)。在振荡器上震荡20min后利用酶标仪在595nm下进行读数。计算药物毒性。药物毒性以细胞死亡率为指标：
细胞增殖抑制率(％)＝[A595(加药组)－A595(空白组)]/[A595(对照组)－A595(空白组)]×100％。
统计学处理：实验结果以三次实验的平均数±标准表示。采用Calcusyn统计学软件进行分析。
结果如图3所示，由图3可知，图中从上到下曲线分别代表对照组细胞增殖曲线，加样组细胞增殖曲线，对照组毒性曲线和加样组毒性曲线。乙酸乙酯相样品的抗增殖曲线明显低于空白对照组的抑制曲线，说明乙酸乙酯相的提取物具有抑制HepG2细胞增殖的能力。当乙酸乙酯相提取物浓度达到35μg/ml时即可显著抑制HepG2细胞增殖，并呈现一定的剂效关系，当乙酸乙酯相提取物浓度达到50μg/ml时，HepG2细胞增殖率为接近0，但当浓度达到45μg/ml时，则会产生细胞毒性。
6.UHPLC-HR-TOFMS法鉴定凤眼果果皮乙酸乙酯相提取物的主要的活性成分
色谱条件：Milli-Q水溶液(A相)和甲醇(B相)为流动相。梯度洗脱程序为：0-1min,30％B；1-12min,30％-70％B；12-13min,70-100％B；13-15min,100％B。柱温保持在30℃，流速为0.2mL/min。
质谱条件：离子化模式：电喷雾离子源(ESI)；扫描范围：50m/z-1500m/z；离子极性：正离子模式；毛细管电压：3500V；端板电压：-500V；充电电压：2000V；喷雾器压强：0.6Bar；干燥加热器温度：180℃；干燥气体流速：4.0L/min；ACPL加热器温度：0℃
实例3获得的凤眼果果皮的乙酸乙酯相3萃取物质样品用甲醇来溶解，配置1.5ml(500μg/ml)样品溶液，用0.22μm有机相针式滤器过滤。
图4为所得产物凤眼果果皮提取物的MS总粒子流图。
图5为所得产物凤眼果果皮提取物的MS/MS总离子流图。
通过UHPLC-HR-TOFMS分析方法鉴别化合物的分析结果见表7。
表7
Figure BDA0001510902470000121
Figure BDA0001510902470000131
a数据包括MS和MS/MS分析。
由表7可知，利用UHPLC-HR-TOFMS联用技术从凤眼果果皮的乙酸乙酯相3萃取物质中通过相关搜索网站和查阅文献等方法暂时鉴别出包括有杨梅素、槲皮素、β-谷甾醇、稻叶素E等16种成分。并对分析出的相关成分进行分析和整理。
7.用GC-MS法鉴定凤眼果果皮提取物正己烷相中的主要的活性成分
实施例3的凤眼果果皮的正己烷相3样品在HP-5MS熔融石英毛细管柱(30m×0.25mm，膜厚0.25μm)上分离样品。喷油器的温度设定在280℃-300℃气相色谱的运载气体为氦气，流速为1.22mL/min。样品进样量为1μL。
色谱条件：气相色谱在1分钟内把机内温度上升到50℃作为程序进样温度,然后以30℃/min的速率升温到80℃,,然后以10℃/min的速率升温到110℃。最后以6℃/min的速率升温到270℃，然后保持该温度20min。
质谱条件：质谱的荷质比扫描范围为60-700(EI)，电压为70ev。样品通过自动进样器通过分裂模式为1:1进行进样。通过他们与NIST 11library的质谱图进行比较进行初步鉴定。通过参考化合物和Kovats索引来进行物质鉴定和确认。图6为所得产物凤眼果果皮提取物的总气相色谱峰图。GC-MS成分分析表见表8。
表8
Figure BDA0001510902470000132
Figure BDA0001510902470000141
Figure BDA0001510902470000151
由表8可知，利用GC-MS技术从凤眼果果皮的正己烷相3萃取物质中鉴别出19种成分。并对分析出的成分进行分析整理。其中含量比较高的有棕榈酸、乙酯十五烷酸、亚油酸乙酯、反油酸乙酯、十七烷酸乙酯。

Claims (2)

1.一种凤眼果果皮提取物在制备辅助降血糖的功能食品中的应用，其特征在于，凤眼果果皮提取物的制备方法，包括以下步骤：
（1）将凤眼果果皮晒干，然后粉碎过筛得到粗粉，再将所得粗粉用乙醇溶液提取，所述粗粉与乙醇溶液的质量体积比为1：（5-15）g/ml，所述乙醇溶液是指体积分数为95%的乙醇水溶液；所述的提取是指在静态下进行浸渍提取，所述浸渍提取的时间为3天，浸渍提取的温度为 20-30℃，过滤除去滤渣，重复上述浸渍提取过滤3次，合并滤液，滤液减压浓缩至浸膏；
（2）将步骤（1）所得浸膏用正己烷萃取，得到正己烷相；所述用正己烷进行萃取是指用待萃取溶液1-2倍体积的正己烷萃取；
（3）将步骤（2）所得正己烷相减压浓缩至浸膏，得凤眼果果皮提取物。
2.一种凤眼果果皮提取物在制备预防和治疗糖尿病的药物中的应用，其特征在于，凤眼果果皮提取物的制备方法，包括以下步骤：
（1）将凤眼果果皮晒干，然后粉碎过筛得到粗粉，再将所得粗粉用乙醇溶液提取，所述粗粉与乙醇溶液的质量体积比为1：（5-15）g/ml，所述乙醇溶液是指体积分数为95%的乙醇水溶液；所述的提取是指在静态下进行浸渍提取，所述浸渍提取的时间为3天，浸渍提取的温度为 20-30℃，过滤除去滤渣，重复上述浸渍提取过滤3次，合并滤液，滤液减压浓缩至浸膏；
（2）将步骤（1）所得浸膏用正己烷萃取，得到正己烷相；所述用正己烷进行萃取是指用待萃取溶液1-2倍体积的正己烷萃取；
（3）将步骤（2）所得正己烷相减压浓缩至浸膏，得凤眼果果皮提取物。
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