CN112168873B - 一种响应面法优化平枝栒子总黄酮的提取工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种响应面法优化平枝栒子总黄酮的提取工艺,所述提取工艺包括有制备对照品溶液、制备样品溶液、测定检测波长、制作标准曲线、回归模型的建立与分析、实验结果分析与优化。采用本发明所述的提取工艺,具有提取工艺简单,提取效率较高,易于推广应用,应用响应面法优化确定最优因素,保证提取科学性、稳定性,为质量标准研究提供依据,其实用性强,并通过抗氧化活性测试,为平枝栒子的综合开发利用提供了理论基础和实验依据。
Description
技术领域
本发明属于植物提取技术领域,具体地说是涉及一种响应面法优化平枝栒子总黄酮的提取工艺。
背景技术
平枝栒子( Cotoneaster horizontalis Decne.) 属于蔷薇目( Rosales) 蔷薇科( Rosaceae) 平枝栒子属( Co- toneaster) 。 平枝栒子分布于我国陕西、甘肃、湖北、湖南、四川、贵州、云南等地区,《中华本草》记载药材名为“水莲沙”,具有清热利湿,化痰止咳,止血止痛等功效,其叶、果实和果皮含右旋儿茶精(catechin)、左旋表儿茶精(epicatechin)等成分。
平枝栒子枝叶横展,叶小而稠密,花密集枝头,晚秋时叶色红色,红果累累,是布置岩石园、庭院、绿地和墙沿、角隅的优良材料。另外,还可作地被和制作盆景,果枝也可用于插花。根可药用。以枝叶或根入药。中药名为水莲沙。全年均可采,洗净,切片,晒干。叶、果实和果皮含右旋儿茶精(catechin),矢车菊素(cyanidin),花色素(anthocyanidin)等成分。性味酸、涩,凉。清热利湿,化痰止咳,止血止痛。主治痢疾,泄泻,腹痛,咳嗽,吐血,痛经,白带。
黄酮是基于2-苯基色原酮-4-酮(2-苯基-1-苯并吡喃-4-酮)骨架的黄酮类化合物。黄酮类化合物是广泛存在于植物界的一大类天然产物,具有抗炎、抗病毒、强心、镇静、镇痛、抗氧化、抗衰老和抗肿瘤等作用,其药用有效成分已经逐渐为人们所认识。目前,响应面曲线法优化平枝栒子中总黄酮提取工艺及其体外抗氧化性研究未见文献报道,为充分开发和利用平枝栒子,急需一种响应面法优化平枝栒子总黄酮的提取工艺。
发明内容
本发明为了解决现有技术中存在的问题,从而提供一种操作简单、易于工业化生产的提取工艺,以平枝栒子为原料,运用超声提取法在单因素实验的基础上,从乙醇浓度、液料比、提取时间、提取温度等因素对平枝栒子中总黄酮含量的影响,并通过多元二次回归方程来拟合响应面值与因素之间函数关系的一种优化平枝栒子中总黄酮的提取工艺,并对其体外抗氧化活性进行研究,并为平枝栒子的综合开发利用提供理论基础和实验依据,具体地说是一种响应面法优化平枝栒子总黄酮的提取工艺。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案是:一种响应面法优化平枝栒子总黄酮的提取工艺,所述提取工艺包括有制备对照品溶液、制备样品溶液、测定检测波长、制作标准曲线、回归模型的建立与分析、实验结果分析与优化,具体包括以下步骤:
(1)制备对照品溶液:称取120℃干燥至恒重的芦丁对照品51.90mg,置于烧杯中,加入乙醇溶液,于水浴锅上50~55℃溶解,定容至100mL容量瓶中,摇匀,得到0. 5190mg/mL的芦丁对照溶液;
(2)制备样品溶液:将平枝栒子粉碎,过20~40目筛,称取粗粉1.0g,置于具有瓶塞的锥形瓶中,加入乙醇溶液超声提取,冷却至室温,过滤,加乙醇溶液补足失去的重量,即得平枝栒子总黄酮提取液;
(3)测定检测波长:精密吸取平枝栒子总黄酮提取液5.0mL置于25mL容量瓶中,加入浓度为5%的NaNO2溶液1.0mL,摇匀,放置10min,加入浓度为10%的Al(NO3)3溶液1.0mL,摇匀,放置10min,加入浓度为4%的NaOH溶液10.0mL,再用乙醇溶液稀释至刻度,静置15min,在200~800nm波长处每隔2nm测定一次吸光度;样品溶液在502nm处有最大吸收,即为测定波长;
分别吸取芦丁对照品溶液0.0mL、1.0mL、3.0mL、5.0mL、7.0mL、9.0mL、11.0mL于25mL量瓶中,依次加入浓度为5%的NaNO2溶液1.0mL,摇匀,静置10min,然后加入浓度为10%的Al(NO3)3溶液1.0mL,摇匀,静置10min,再加入浓度为4%NaOH溶液10.0mL,蒸馏水稀释至刻度,摇匀,静置15min,以依次加入上述显色剂的乙醇溶液作为空白对照,于200~800nm进行全波长光谱扫描;在502nm处有最大吸收,故选择测定波长为502nm;
(4)制作标准曲线:以吸光度A为纵坐标y,浓度c为横坐标x,绘制标准曲线,进行线性拟合,得吸光度A与浓度c的线性回归方程y=0.009x+0.0044,以及相关系数R2为0.9998;
样品溶液的测定:吸取样品溶液5.0mL,置于25 mL 容量瓶中,标准曲线法制备待测溶液,根据芦丁标准曲线求算出总黄酮浓度,根据以下公式计算总黄酮得率:
其中,Y:总黄酮得率(%);c:根据标准曲线所得总黄酮浓度(mg/mL);V0:样品总溶液体积(mL);V1:样品溶液测定体积(mL);m:平枝栒子质量(g);
(5)回归模型的建立与分析:采用Design Expert 8.0软件对实验结果进行多项式拟合回归,以提取温度A、乙醇浓度B、提取时间C和料液比D,以平枝栒子总黄酮得率为响应值Y,建立回归方程:
Y=2.05+0.23A+0.11B+0.028C+0.018D-0.095AB+0.010AC+0.13AD-0.12BC+0.18BD+0.15CD-0.15A2-0.18B2-0.26C2+0.0015D2;
(6)实验结果分析与优化:利用Design Expert 8.0软件根据多元二次回归方程进行绘图分析,得到回归方程的响应面及其等高线图。
进一步地,本发明所述的响应面法优化平枝栒子总黄酮的提取工艺,其中所述步骤(1)、(2)和(3)中所用的乙醇溶液的浓度为71%。
进一步地,本发明所述的响应面法优化平枝栒子总黄酮的提取工艺,其中在所述步骤(2)制备样品溶液过程中,所述平枝栒子总黄酮的提取工艺为:提取温度50~70℃、乙醇浓度70~80%、提取时间20~25min和料液比1:15~20g/mL。
进一步地,本发明所述的响应面法优化平枝栒子总黄酮的提取工艺,其中在所述步骤(2)制备样品溶液过程中,所述平枝栒子总黄酮的最佳提取工艺为:提取温度51.29℃、乙醇浓度70.76%、提取时间24.07min和料液比1:15.83g/mL。
进一步地,为便于操作,本发明所述的响应面法优化平枝栒子总黄酮的提取工艺,其中在所述步骤(2)制备样品溶液过程中,所述平枝栒子总黄酮的最佳提取工艺为:提取温度51℃、乙醇浓度71%、提取时间24min和料液比1:16g/mL。该条件下平枝栒子总黄酮提取率的实际值为2.168%。
采用本发明所述的一种响应面法优化平枝栒子总黄酮的提取工艺,与现有技术相比,其有益效果在于:本发明提取工艺简单,提取效率较高,易于推广应用,应用响应面法优化确定最优因素,保证提取科学性、稳定性,为质量标准研究提供依据,其实用性强,并通过抗氧化活性测试,为平枝栒子的综合开发利用提供了理论基础和实验依据。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1是本发明乙醇浓度对平枝栒子总黄酮得率影响图;
图2是本发明料液比对平枝栒子总黄酮得率影响图;
图3是本发明提取温度对平枝栒子总黄酮得率影响图;
图4是本发明提取时间对平枝栒子总黄酮得率影响图;
图5是本发明乙醇浓度和料液比交互作用下平枝栒子总黄酮得率的等高线图;
图6是本发明乙醇浓度和料液比交互作用下平枝栒子总黄酮得率的响应曲面图;
图7是本发明提取时间和料液比交互作用下平枝栒子总黄酮得率的等高线图;
图8是本发明提取时间和料液比交互作用下平枝栒子总黄酮得率的响应曲面图;
图9是本发明料液比和提取温度交互作用下平枝栒子总黄酮得率的等高线图;
图10是本发明料液比和提取温度交互作用下平枝栒子总黄酮得率的响应曲面图;
图11是本发明提取时间和乙醇浓度交互作用下平枝栒子总黄酮得率的等高线图;
图12是本发明提取时间和乙醇浓度交互作用下平枝栒子总黄酮得率的响应曲面图;
图13是本发明提取温度和乙醇浓度交互作用下平枝栒子总黄酮得率的等高线图;
图14是本发明提取温度和乙醇浓度交互作用下平枝栒子总黄酮得率的响应曲面图;
图15是本发明提取温度和提取时间交互作用下平枝栒子总黄酮得率的等高线图;
图16是本发明提取温度和提取时间交互作用下平枝栒子总黄酮得率的响应曲面图;
图17是本发明平枝栒子总黄酮对DPPH自由基清除能力的影响对比图;
图18是本发明平枝栒子总黄酮对羟基自由基清除能力的影响对比图;
图19为本发明芦丁标准曲线图。
具体实施方式
为了更充分的解释本发明的实施,以下结合具体实施例对本发明的原理和特征进行描述,所举实施例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。
一种响应面法优化平枝栒子总黄酮的提取工艺,包括以下步骤:
(1)制备对照品溶液:称取120℃干燥至恒重的芦丁对照品51.90mg,置于烧杯中,加入乙醇溶液,于水浴锅上50~55℃溶解,定容至100mL容量瓶中,摇匀,得到0.5190mg/mL的芦丁对照溶液;
(2)制备样品溶液:将平枝栒子粉碎,过20~40目筛,称取粗粉1.0g,置于具有瓶塞的锥形瓶中,加入乙醇溶液超声提取,冷却至室温,过滤,加乙醇溶液补足失去的重量,即得平枝栒子总黄酮提取液;
(3)测定检测波长:吸取平枝栒子总黄酮提取液5.0mL 置于25mL 容量瓶中,加入5%NaNO2溶液1.0mL,摇匀,放置10min,加入10%Al(NO3)3溶液1.0mL,摇匀,放置10min,加入4%NaOH溶液10.0mL,再用乙醇溶液稀释至刻度,静置15min,在200~800nm波长处每隔2 nm测定一次吸光度,样品溶液在502nm处有最大吸收,即为测定波长;
分别吸取芦丁对照品溶液 0.0mL、1.0mL、3.0mL、5.0mL、7.0mL、9.0mL、11.0mL于25mL量瓶中,依次加入5%NaNO2溶液1.0mL,摇匀,静置10min,然后加入10%Al(NO3)3溶液1.0mL,摇匀,静置10min,再加入4%NaOH溶液10.0mL,蒸馏水稀释至刻度,摇匀,静置15min,以依次加入上述显色剂的乙醇溶液作为空白对照,于200~800nm进行全波长光谱扫描,在502nm处有最大吸收,故选择测定波长为502nm;
(4)制作标准曲线:以吸光度A为纵坐标y,浓度c为横坐标x,绘制标准曲线(如图19所示),进行线性拟合,得吸光度A与浓度c的线性回归方程y=0.009x+0.0044,以及相关系数R2为0.9998;
测定样品溶液的含量:吸取样品溶液5.0mL,置于25mL容量瓶中,标准曲线法制备待测溶液,根据芦丁标准曲线求算出总黄酮浓度,根据以下公式计算总黄酮得率。
其中,Y:总黄酮得率(%);c:根据标准曲线所得总黄酮浓度(mg/mL);V0:样品总溶液体积(mL);V1:样品溶液测定体积(mL);m:平枝栒子质量(g)。
乙醇浓度对平枝栒子总黄酮得率的影响:分别取平枝栒子粉末6份,每份1.0g,精密称定,分别加入20mL浓度为40%、50%、 60%、70%、80%、90%的乙醇溶液,于60℃超声提取20min,分别精密吸取步骤2所述平枝栒子样品6份各5.0mL,置于25mL容量瓶中,分别按照步骤4的方法测定并计算平枝栒子总黄酮得率。结果表明体积为70~80%乙醇浓度提取平枝栒子总黄酮得率最高,如图1所示。
料液比对平枝栒子总黄酮得率的影响:分别取平枝栒子粉末6份,每份1.0g,精密称定,分别按照料液比(g/mL)为1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30加入70%乙醇浓度。于60℃超声提取20min,分别精密吸取步骤2所述平枝栒子样品6份各5.0mL,置于25mL容量瓶中,分别按照步骤4的方法测定并计算平枝栒子总黄酮得率。结果表明料液比为(1:15~1:20)g/mL的70%乙醇浓度提取平枝栒子总黄酮得率最高,如图2所示。
提取温度对平枝栒子总黄酮得率的影响:分别取平枝栒子粉末6份,每份1.0g,精密称定,加入20mL浓度为70%的乙醇溶液,分别于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃超声提取20min,分别精密吸取步骤2所述平枝栒子样品6份各5.0mL,置于25mL容量瓶中,分别按照步骤4的方法测定并计算平枝栒子总黄酮得率。结果表明提取温度为50~70℃提取平枝栒子总黄酮得率最高,如图3所示。
提取时间对平枝栒子总黄酮得率的影响:分别取平枝栒子粉末6份,每份1.0g,精密称定,加入20mL浓度为71%的乙醇溶液,于60℃分别超声提取5min、10min、15min、20min、25min、30min,分别精密吸取步骤2所述平枝栒子样品6份各5.0mL,置于50mL容量瓶中,分别按照步骤4的方法测定并计算平枝栒子总黄酮得率。结果表明超声时间为20~25min提取平枝栒子总黄酮得率最高,如图4所示。
响应面优化实验:
因素水平选取及响应面设计:
在单因素试验的基础上,设计响应面试验,以平枝栒子中总黄酮得率(%)作为响应值,以料液比(A)、乙醇浓度(B)、提取时间(C)、提取温度(D)作为自变量,选取 3 个水平(0,±1),采用 Design Expert 8.0.5.0建立模型对超声辅助提取平枝栒子总黄酮工艺进行优化,试验设计因素与水平见表 1,设计组合及总黄酮提取率见表 2。
表1 设计实验因素水平
表 2 试验设计与结果
(5)回归模型的建立与分析
采用 Design Expert 8.0.5.0软件对实验结果进行多项式拟合回归,得到回归方程:
Y=2.05+0.23A+0.11B+0.028C+0.018D-0.095AB+0.010AC+0.13AD-0.12BC+0.18BD+0.15CD-0.15A2-0.18B2-0.26C2+0.0015D2。方差分析结果见表3。
表3模型方差分析
注:P<0.05为显著性差异,P<0.01为极显著差异。
由表3可知,实验模型“Pr>F”值小于0.0001非常显著,即该模型用于评价本实验可信度非常高,结果显示A、B、AD、BC、BD、CD、A2、B2、C2对考察指标平枝栒子总黄酮影响极其显著,而C、AB对考察指标平枝栒子总黄酮影响显著。失拟项(P=0.2190>0.05)不显著,表明方差拟合度较好,误差较小。R2=0.9736,表明最佳条件下实测值与预测值的偏差较小。
根据回归方程绘制响应面图,属于响应值与各因素间相互作用的三维空间曲面,主要用于较直观分析两交作用的影响,分析当乙醇浓度、提取温度、提取时间、料液比四个因素中有一个因素固定时,另外三个因素及其交互作用对所提取总黄酮含量的影响。根据方程得出模型的响应面及等高线见图5-16。
由图5和图6所示的等高线和响应面图可以看出,随着乙醇浓度的增加,平枝栒子总黄酮含量增加,当达到一定浓度时,平枝栒子总黄酮含量会下降,表明乙醇浓度对平枝栒子总黄酮含量影响极显著。同理由图可以看出,料液比对平枝栒子总黄酮含量也极显著,提取温度和提取时间有显著影响。
通过Design Expert软件求解方程得到,平枝栒子药材总黄酮的最佳提取工艺为:料液比1:15.83g/mL,乙醇浓度70.76%,提取时间24.07min,提取温度51.29℃。此条件下总黄酮的预测值为2.204%,为客观考虑可行性,将料液比为1:16g/mL,乙醇浓度71%,提取时间24min,提取温度51℃。再根据改进的情况最佳工艺进行实验验证(5组),实测值平枝栒子中总黄酮含量平均值为2.168%,与理论预测值非常接近。因此,Design Expert 软件进行响应面优化平枝栒子总黄酮提取工艺条件是可靠的,具有实用价值。
(6)体外抗氧化活性测试
测定平枝栒子总黄酮对DPPH自由基清除率的影响;
将平枝栒子浓缩液加71%乙醇配制成浓度分别为5、10、20、30、40、50、60µg/mL的样品溶液。精密移取2.0mL样品溶液于试管中,加入0.1mmol/L的DPPH溶液2.0mL,充分混匀,室温下避光放置40 min,以71%乙醇为空白对照的吸光度A空,对照组加DPPH溶液而不加样品溶液的吸光度A对,于510nm波长处测定样品吸光度A样,平行测量3次。以维生素C为阳性对照,精密称取一定量的维生素C配制成相应浓度,按上述方法操作;
DPPH自由基清除率(%)=[1-(A样-A空)/A对]×100
不同浓度的平枝栒子总黄酮提取液与维生素C溶液对DPPH自由基清除能力如图17所示。从图17中可以看出,平枝栒子总黄酮对DPPH自由基的清除能力随着浓度的增加而升高,当其浓度为50µg/mL时,清除率达到64.8%,此后,清除率基本保持不变。在实验浓度范围内,阳性对照物维生素C在实验浓度范围内对DPPH自由基的清除能力始终高于平枝栒子总黄酮;
测定平枝栒子总黄酮对羟自由基清除率的影响:
采用邻二氮菲法测定羟自由基的清除率,取5.0mmoL/L邻二氮菲溶液1.5mL置于10mL的具塞试管中,加入2.0mL0.75mol/L,pH=7.4的磷酸盐缓冲液,混匀后加入1.0mL0.75mmoL/L的FeSO4溶液,充分混匀后,在加入上述1.0mL不同浓度的样品试液,再加入1.0mL1%H2O2溶液,然后加蒸馏水补足到10mL,混匀,在50℃水浴下反应1.5h,空白组既不加样品溶液和H2O2的吸光度A空,对照组加H2O2溶液而不加样品溶液的吸光度A对。以于530nm波长下测定样品的吸光值A样。以维生素C为阳性对照,精密称取一定量的维生素C配制成相应浓度,按上述方法操作;
羟自由基清除率(%)=[1-(A样-A空)/A对]×100
不同浓度的平枝栒子总黄酮提取液与维生素C溶液对羟自由基清除能力如图18所示。平枝栒子总黄酮对羟自由基具有一定的抑制能力,但不如维生素C,当平枝栒子总黄酮浓度为50µg/mL时,清除率为50.2%,此后,随着浓度的增加,清除率基本保持不变。在实验浓度范围内,阳性对照物维生素C对DPPH自由基的清除能力始终高于平枝栒子总黄酮。
平枝栒子中总黄酮抗氧化活性试验表明随着平枝栒子中总黄酮含量的增多,其抗氧化活性在一定范围内不断增加,为其在食品、药品等领域开发天然抗氧化剂提供一定的理论依据。
本发明提取工艺简单,提取效率高,便于推广应用,应用响应面法优化确定最优因素,保证提取科学性、稳定性,为食品、药品质量标准研究提供依据。
以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种响应面法优化平枝栒子总黄酮的提取工艺,其特征在于:所述提取工艺为平枝栒子粉末加入一定量的乙醇溶液进行超声提取,具体提取工艺条件为:将平枝栒子粉碎,过20~40目筛,称取粗粉1.0g,置于具有瓶塞的锥形瓶中,加入乙醇溶液超声提取,冷却至室温,过滤,加乙醇溶液补足失去的重量,即得平枝栒子总黄酮提取液;其中提取温度为50~70℃、乙醇浓度为70~80%、提取时间为20~25min和料液比为1:15~20g/mL。
2.根据权利要求1所述的响应面法优化平枝栒子总黄酮的提取工艺,其特征在于:所述乙醇溶液的浓度为71%。
3.根据权利要求1所述的响应面法优化平枝栒子总黄酮的提取工艺,其特征在于:所述平枝栒子总黄酮的最佳提取工艺为:提取温度为51.29℃、乙醇浓度为70.76%、提取时间为24.07min和料液比为1:15.83g/mL。
4.根据权利要求1所述的响应面法优化平枝栒子总黄酮的提取工艺,其特征在于:所述平枝栒子总黄酮的最佳提取工艺为:提取温度为51℃、乙醇浓度为71%、提取时间为24min和料液比为1:16g/mL。
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CN202011271713.3A CN112168873B (zh) | 2020-11-13 | 2020-11-13 | 一种响应面法优化平枝栒子总黄酮的提取工艺 |
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