CN105394770A

CN105394770A - 具有最佳抗氧化协同增效作用的桂花茶在制备抗癌保健品或食品中的应用

Info

Publication number: CN105394770A
Application number: CN201510821168.3A
Authority: CN
Inventors: 陆柏益; 雷雨坤; 王凯迪; 姚舒婷; 毛淑琴; 楼甜甜; 周菲
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2015-11-23
Filing date: 2015-11-23
Publication date: 2016-03-16
Anticipated expiration: 2035-11-23
Also published as: CN105394770B

Abstract

本发明公开了一种具有最佳抗氧化协同增效作用的桂花茶在制备抗癌保健品或食品中的应用，该桂花茶由桂花干：茶叶＝3～5:1的质量比混合而得。桂花为四季桂、丹桂、金桂、银桂；茶叶为西湖龙井、祁门红茶、安溪铁观音、普洱茶。该桂花茶的制备方法包括以下步骤：(a)、利用冻干-真空微波联合干燥技术制备桂花干；(b)、将桂花干和茶叶按相应质量比拼和后，先于48～52℃加温窨制22～28min，然后于8～12℃冷却25～50分钟，最后置于密闭的环境中做后续的吸香处理18～22天；得桂花茶。

Description

具有最佳抗氧化协同增效作用的桂花茶在制备抗癌保健品或食品中的应用

技术领域

本发明涉及茶饮料技术领域，更具体地涉及一种具有抗氧化协同增效作用最佳配比的桂花茶及其制法和用途-用于抗衰老、抗癌、降血糖。

背景技术

桂花，又名木樨、岩桂，是中国传统十大花卉之一，原产于中国西南喜马拉雅山东段。现广泛栽种于淮河流域及以南地区，其适合生长的区域北可抵黄河下游，南可至两广、海南等地。桂花品种繁多，大约有152个品种，可分为四个品系，即四季桂、丹桂、银桂、金桂。桂花除了观赏美化以外，还具有较高的营养和药用价值。对于桂花的成分研究已经具备一定的基础，其主要活性成分为黄酮类化合物、三萜类化合物、苯乙醇苷类化合物等。桂花提取物具有抗氧化及清除自由基、抗炎、降血糖、降血脂及抑菌等生理作用。茶叶作为我国重要经济作物，在中国已经有3000余年的历史，民间素有“不可一日无茶”之说，而对它的成分研究也是比较成熟。茶叶中所含的生物活性成分主要有生物碱、茶多酚、多糖等，在抗癌、抗衰老、降血脂等方面也有重要的作用。

以桂花和茶叶做原料制作的桂花茶是中国特产茶，它香气柔和、味道可口，为大众所喜爱。桂花茶是时下比较受欢迎的饮品，在我国的消费市场已具有一定的规模。它是两种单品的复合物，而它们各自所含的部分化学成分都有清除自由基的作用。然而，迄今为止人们对桂花茶混合物中两种单品相互作用的研究非常少。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种具有最佳抗氧化协同增效作用的桂花茶在制备抗癌保健品或食品中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种具有最佳抗氧化协同增效作用的桂花茶在制备抗癌保健品或食品中的应用，该桂花茶由桂花干：茶叶＝3～5:1的质量比混合而得。

作为本发明的具有最佳抗氧化协同增效作用的桂花茶在制备抗癌保健品或食品中的应用的改进：桂花为四季桂、丹桂、金桂、银桂。

作为本发明的具有最佳抗氧化协同增效作用的桂花茶在制备抗癌保健品或食品中的应用的进一步改进：茶叶为西湖龙井、祁门红茶、安溪铁观音、普洱茶。

作为本发明的具有最佳抗氧化协同增效作用的桂花茶在制备抗癌保健品或食品中的应用的进一步改进：桂花干：茶叶＝4:1的质量比。

作为本发明的具有最佳抗氧化协同增效作用的桂花茶在制备抗癌保健品或食品中的应用的进一步改进，该桂花茶的制备方法包括以下步骤：

(a)、利用冻干-真空微波联合干燥技术制备桂花干：

先进行真空冷冻干燥：将桂花在-55～-65℃(较佳为-60℃)的超低温中速冻2.5～3.5h(较佳为3h)后，于冷阱温度0℃、真空度1Pa的条件下干燥，直至桂花中的水分含量为35～45％(质量％，例如为37％)；

然后将上述真空冷冻干燥处理后的桂花进行真空微波干燥，直至所得的桂花干中的水分含量为9～11％(质量％)；

该桂花干作为加工桂花茶的原料；

(b)、加工桂花茶：将桂花干和茶叶按相应质量比(即桂花干：茶叶＝3～5:1，较佳为4:1)拼和后，先于48～52℃(较佳为50℃)加温窨制22～28min(较佳为25min)，然后于8～12℃冷却25～50分钟(从而实现快速充分冷却)，最后置于密闭的环境中做后续的吸香处理18～22天(较佳为20天)；得桂花茶。

备注说明：上述吸香处理能让茶叶更加充分吸收花香和实现更加牢固的吸附作用，从而获得作为成品的桂花茶。

作为本发明的具有最佳抗氧化协同增效作用的桂花茶在制备抗癌保健品或食品中的应用的进一步改进，所述步骤(a)中真空微波干燥为：真空度为0.095MPa，微波功率2W/g。

作为本发明的具有最佳抗氧化协同增效作用的桂花茶在制备抗癌保健品或食品中的应用的进一步改进，所述步骤(b)中吸香处理时的密闭环境的温度为25～35℃。

在本发明中，茶叶均是通过市购的方式获得，其含水量≤5％。

本发明为选择抗氧化协同最佳配比，曾采用等高线图解分析法比较桂花茶的抗氧化能力，以下为具体的实验步骤：

一、检测桂花茶叶抗氧化能力的方法如下：

(a)、清除ABTS自由基能力测定方法

分别配置7.4mMABTS以及2.6mM过硫酸钾水溶液，临用前等体积混合，37℃避光反应12h，配成ABTS贮备液，稀释45倍后使用，贮备液可保存一周，稀释液现配现用。取稀释一定倍数的样品6μL于96孔板，加入180μL稀释过的ABTS储备液，37℃避光反应60min后于734nm处测定吸光度，平行三组实验测定。

(b)、清除DPPH自由基能力测定方法

实验前精确称取2mgDPPH溶于适量甲醇中，定容至10mL现配现用。取稀释一定倍数的所得6μL样品，加入234uLDPPH，37℃避光反应60min，于515nm波长处测吸光度，平行三组实验测定。

二、运用等高线图解分析法对其抗氧化协同增效作用进行评价，通常包括以下几个步骤：

(a)、

样品提取：称取桂花茶1g于烧杯中，加入45mL沸水后55℃水浴中放置30min，然后使用纱布过滤，定容到50mL容量瓶中，得桂花提取液；长期保存需置于-20℃冰箱中。

在实际中，桂花茶对人体的作用是在经过唾液、胃液及肠液的消化吸收之后发挥作用，故此，对桂花茶进行模拟消化实验。根据人类摄食的特点，将体外消化模型分为三个阶段，分别为口腔消化阶段、胃消化阶段和肠消化阶段，模拟消化液配制见表1。

表1模拟消化液组成

提取液的预处理(即进行模拟消化实验)：

配制完成后，取10mL桂花茶提取液与烧杯中，加入3mL唾液，37℃条件下水浴恒温5min，加入6mL胃液37℃条件下避光2h，加6mL肠液于其中摇匀，然后加入到透析袋中并将其放入500mL大烧杯中，在其中加入约150mL0.9％NaCl使消化液浸没，继续37℃条件避光反应2h。将透析液在47℃下旋蒸，并用蒸馏水定容到10mL，分装后存放在-20℃冰箱中。样品预处理完成，即，得到桂花茶消化后样品。

备注说明：

将上述“桂花茶”相应的改成“茶”、“桂花”，如同上文进行样品提取、提取液的预处理(即进行模拟消化实验)，从而相应获得茶消化后样品、桂花消化后样品。

(b)、测定桂花茶在抗氧化实验中的IC50值，构建等高线图，以桂花的IC50值为横坐标，以茶叶的IC50值为纵坐标，连接横纵坐标的IC50值，构成相加线及其95％置信区间，各个提取物的IC50以及相连的95％的置信限可以通过各个提取物的对数剂量-效应关系线性回归曲线得出(至少四个剂量)。

(c)、从理论上选取桂花茶叶的固定比例，固定比例的混合药物的IC50，add值，可通过下述公式计算：IC50，add＝IC50，A/(P1+R×P2)其中，R为两物质单独应用时的效价比，P1为桂花在混合物中所占比例，P2为茶叶在混合物中所占比例。

(d)、确定固定桂花茶比例的混合物在实验中实际得到的IC_50mix值，IC_50mix即由实验确定的固定比例的桂花茶获得50％效应时所需的总量，该值可以从桂花茶的剂量-效应曲线上求得。

(e)、采用Studenttest等统计方法对各比例比较。

(f)、根据桂花茶的IC₅₀值位置判断他们之间的相互作用。当理论IC_50add和各自的实验IC_50mix没有显著性差异时，则表明桂花和茶叶相互作用的类型为相加；如果IC_50mix显著低于IC_50add(在相加线下方)时，则说明桂花和茶叶具有协同作用；如果IC_50mix显著高于IC_50add(在相加线上方)时，则说明桂花和茶叶具有拮抗作用。

备注说明：图2和图3中，CI是指相互作用指数；

C I = \frac{(I C 50, A) m i x}{I C 50, A} + \frac{(I C 50, B) m i x}{I C 50, B}

式中，(IC_50，A)_mix(IC_50，B)_mix分别为复合组中A,B两种抗氧化剂的IC₅₀值，IC_50,A，IC_50,B分别为AB两种抗氧化剂单独作用时的IC50值。

本发明还利用UPLC方法分析了桂花茶(桂花：茶叶配比为3:1～5:1)的主要功能性成分。

具体操作如下：

(a)、以色谱级甲醇为溶剂，将L-茶氨酸(L-CAS)、没食子酸(GA)、没食子儿茶素(GC)、红景天苷(SAL)、表没食子儿茶素(EGC)、儿茶素(C)、咖啡因(CAF)、咖啡酸(CAC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、毛蕊花糖苷(ACT)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、茶黄素(TF)，配成1.0mg/ml标准溶液储备液，按照比例混合，并在此初始浓度进行不同程度吸收得到混标溶液待测。桂花茶样品稀释一定倍数后过0.45μm微孔滤膜，待测。

(b)、对上述混标溶液提取液进行UPLC成分分析，采用BEHC18(2.1mm×150mm，1.7μm)色谱柱：流动相：A：乙腈、B：85％磷酸水溶液(0.05：99.95)，柱温35℃，样品温度25℃，进样体积1μL，流速0.2mL/min；在210.3-400nm之间进行紫外扫描。梯度洗脱程序如下：0-1min，A相4％；1-5min，A相4-18％；5-7.5min，18-30％A；7.5-9.5，30-60％A；9.5-10min，60-90％A；10-12.5min，90％A；12.5-16min保持A相4％进行洗脱。根据保留时间与紫外吸收光谱进行定性，采用峰面积外标进行定量。以峰面积为纵坐标，对照浓度为横坐标绘制标准曲线。

(c)、对消化后桂花茶提取溶液的UPLC分析，根据保留时间及相应吸收波长，对其中的功能成分定性定量分析。

结果表明，本发明的桂花茶里面均含有L-CAS、GA、GC、SAL、EGC、C、CAF、CAC、EGCG、GCG、ACT、ECG、TF等十三种物质中的部分物质。所含物质均有抗氧化作用。

上述桂花茶指本发明提到的任何桂花干和任何茶叶的配比为3:1～5:1的桂花茶组合。

本发明的桂花茶的用途的实验验证法具体如下：

一、抗衰老功效

本发明利用人衰老成纤维细胞(HDF)模型探究了该桂花茶在抗衰老功能上具有协同增效作用，其特征如下：

(a)、建立衰老细胞模型：

采用人的成纤维细胞系(HDF)接种于含有10％胎牛血清、50mg/L青霉素，100mg/L链霉素的H-DMEM培养基上，在培养基中分别添加适宜浓度的桂花消化后样品、茶叶消化后样品以及本发明所述桂花茶消化后样品，构成实验组以探究其对细胞生长增殖能力的影响。放于培养瓶中，置恒温培养箱(37℃，5％CO₂)内培养，观察细胞贴壁和生长情况。细胞增殖至培养瓶壁80％左右，细胞生长旺盛时，可以用0.25％胰蛋白酶消化、收集细胞、计数传代。将HDF细胞进行连续传代培养，使细胞达到复制性衰老，模拟人体内细胞，建立细胞衰老模型；用β-半乳糖苷酶试剂盒检测细胞衰老情况，细胞群体倍增系数大于35时细胞达到复制性衰老。

(b)、衰老HDF细胞生长增殖能力及相对存活率：

培养的1，2，3，4，5，6，7d时分别用MTT法检测细胞生长增殖情况。每孔加入5g/L的MTT溶液20μL，放入培养箱中孵育4h，然后移去原培养基，每孔中加入二甲基亚砜(DMSO)150μL，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。于酶联免疫检测仪492nm波长处检测光密度值(OD)，并计算细胞相对存活率，公式如下：

细胞相对存活率＝试验组OD值/对照组OD值×100％

(c)、MTT法测定提取物对HDF细胞增殖能力的影响：

MTT可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色甲结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜溶解，用酶标仪在492nm波长处测定其光密度值可间接反映活细胞数量。

实验结果：培养基中含提取物的实验组细胞增殖能力开始显著高于对照组，且桂花茶提取物对细胞增殖能力的促进作用显著高于桂花提取物和茶叶提取物单独作用。本发明所述桂花茶具有协同增效作用，能有效提高衰老HDF细胞的增殖能力，延缓细胞衰老。

二、抗癌功效

本发明以人肿瘤细胞株为模型，采用cellcountingkit-8(CCK-8)检测体外抗肿瘤活性：

(a)、建立体外癌细胞模型：

取人红白血病细胞株K562、人肝癌细胞株SMMC-7221、人结肠癌细胞株HCT116和人肺癌细胞株A549，采用含10％胎牛血清的RPMI-1640(pH7.4)完全培养基,在37℃，5％CO₂条件下常规培养。

(b)、提取物对人癌细胞增殖的抑制作用：

分别取对数生长期的K562、SMMC-7221、HCT116和A549细胞、0.25％胰酶制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×108/L，接种于96孔板，每孔90μL；悬浮细胞K562接种后立即加药，其他贴壁细胞培养24h待其贴壁后加药。每孔加药10μL，每个浓度4个复孔，将桂花消化后样品、茶叶消化后样品、本发明所述桂花茶消化后样品分别以一定浓度梯度加入。阳性对照组加顺铂(DDP,1mg·L^-1)，阴性对照组加10μL无血清RPMI1640，继续培养48h，每孔加入(CCK-810μL继续培养1h，酶标仪450nm波长下检测各孔吸收度A值,按下列公式计算抑制率：

细胞增殖抑制率％＝[1-(A给药组-A空白孔)/(A阴性对照组-A空白孔)]×100。

实验结果：桂花消化后样品、茶叶消化后样品、桂花茶消化后样品对癌细胞均有抑制作用，但该发明所述桂花茶消化后样品对细胞增殖的抑制率明显高于桂花、茶叶单独作用。

三、降血糖功效

本发明利用HepG2胰岛素抵抗细胞模型，探究了该桂花茶在降血糖功能上具有协同增效作用，其特征如下：

(a)、建立HepG2胰岛素抵抗细胞模型：

将盛有HepG2细胞的冻存管从液氮中取出，立即放入37℃水浴锅中，震动冻存管使其在内完全融化。经离心，无菌环境下倒掉上清液，加入少量完全培养液，并用吸管吹散细胞，然后接种于的细胞培养瓶中，吹打均匀，使其成单细胞悬液，于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下的恒温细胞培养箱中培养。当细胞贴壁生长汇集至80％左右时，倒掉培养液，加入0.25％胰酶溶液约1.5mL，轻轻旋转培养瓶，使胰酶浸润所有细胞，当显微镜下观察细胞形态趋于圆形时，倒掉胰酶溶液，加入3mL完全培养液终止胰酶的消化反应，并用吸管轻轻吹打细胞成细胞悬液，根据需要留存适量细胞悬液，并加入新鲜的完全培养液轻轻吹打均匀，于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下的恒温细胞培养箱中培养。2-3d传代1次。当传代至第三代时，取对数生长期细胞制备成细胞悬液，用完全培养液稀释，以5×10^3个/孔的细胞密度接种于96孔细胞培养板，200μL/孔，于37℃，5％CO2的恒温细胞培养箱中继续培养24h，即为HepG2胰岛素抵抗细胞模型。

(b)、提取物对胰岛素抵抗细胞模型葡萄糖消耗的影响

设空白组、正常对照组、胰岛素抵抗模型组、二甲双胍阳性对照组、一定浓度的桂花消化后样品组、一定浓度的茶叶消化后样品组、不同配比的桂花茶消化后样品组，每组设个5平行孔，其中空白组不接种细胞。空白组、正常对照组和胰岛素抵抗模型组各加入完全培养液200μL/孔，二甲双胍组加入二甲双胍溶液(终浓度为1.65×10^-1mg/mL)200μL/孔，各提取组加入各消化后样品200μL/孔。培养24h后采用葡萄糖氧化酶法测定各组上清培养液中葡萄糖含量。

葡萄糖消耗试验结束后将上清培养液移出，每孔加入含0.5％MTT的培养液200μL，培养4h后吸弃培养液，每孔加入DMSO150μL，震荡10min后，酶标仪于490nm处测OD值。

(c)、葡萄糖消耗量的计算

葡萄糖(mmoL/L)＝样本管吸光度(A)×校准液浓度/校准管吸光度(A)

各组葡萄糖消耗量(mmoL/L)＝空白组葡萄糖含量-各组葡萄糖含量

实验结果：用MTT校正后，模型组单位细胞葡萄糖消耗量明显低于正常组。模型组细胞在经过不同提取物的干预后，葡萄糖消耗能力均有不同程度的提高，其中桂花茶消化后样品对细胞降血糖能力的促进作用显著高于桂花消化后样品和茶叶消化后样品单独作用，且在桂花：茶＝4：1时的桂花茶消化后样品的促进作用最为显著。本发明所述桂花茶具有协同增效作用，能有效提高HepG2细胞的降血糖能力。

综上所述，桂花茶提取物中多酚种类繁多，主要包括酚酸、黄酮等，且研究表明它们均具有清除自由基、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、降血糖等多种生理活性。因此本发明研发具有抗氧化协同增效最佳配比的桂花茶，探索新型制备方法并拓展其保健功能具有重要开发意义。

本发明主要的优点是：

(a)在ABTS及DPPH抗氧化实验中，桂花：茶叶均在3:1～5:1的比例范围内清除自由基的能力最强，表现出最高的抗氧化协同作用。

即，确定最佳抗氧化协同增效配比范围为桂花：茶叶＝3:1～5:1，其中4：1时达到最佳，显著提高了桂花茶的抗氧化能力。

备注说明：在发明过程中，发现：当桂花干和茶叶这两种单品复合在一起时，在不同比例下产生的综合抗氧化能力是截然不同的，只有本发明能实现对抗氧化能力的协同增效。

(b)、通过改造传统桂花茶制作工艺，实现更加有效的加工工艺，得到的桂花茶质量好，品质稳定，抗氧化效果更佳。

(c)、所提供桂花茶在抗氧化、抗衰老、抗癌等方面都具有重要用途。

(d)、本发明的桂花茶，提取液进行过体外模拟消化实验后再进行抗氧化试验，更加符合实际情况。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是十三种标准物质UPLC图谱(λ＝210.3)；

图1中：1到13分别为L-CAS、GA、GC、SAL、EGC、C、CAF、CAC、EGCG、GCG、ACT、ECG、TF；

图2是不同配比的金桂龙井茶清除ABTS自由基协同能力比较图；

图3是不同配比的金桂龙井茶清除DPPH自由基协同能力比较图；

图4是不同配比的四季桂乌龙茶清除ABTS自由基协同能力比较图；

图5是不同配比的四季桂乌龙茶清除DPPH自由基协同能力比较图。

图6是对比例3、对比例4与实施例1的金桂龙井茶清除ABTS自由基协同能力比较图；

图7是对比例3、对比例4与实施例1的金桂龙井茶清除DPPH自由基协同能力比较图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、具有最佳抗氧化协同增效作用的桂花茶的制备方法，依次进行以下步骤：

(a)、利用冻干-真空微波联合干燥技术制备桂花干：

先进行真空冷冻干燥：将桂花在-60℃的超低温中速冻3h后，于冷阱温度0℃真空度1Pa的条件下干燥，直至桂花中的水分含量为37％；

然后将上述真空冷冻干燥处理后的桂花进行真空微波干燥(真空度为0.095MPa，微波功率2W/g)，所得的桂花干中的水分含量约为11％。

该桂花干作为加工桂花茶的原料。

(b)、加工桂花茶：

选用以下2者作为原料：金桂花制备而得的金桂花干，西湖龙井茶叶。

将金桂花干：西湖龙井茶叶＝4：1的质量比拼和后，先于50℃加温窨制25min，然后于8～12℃冷却50分钟，从而实现快速充分冷却；最后置于25～35℃的密闭环境中做后续的吸香处理20天；从而让茶叶更加充分吸收花香和实现更加牢固的吸附作用，得桂花茶--金桂龙井茶。

对比例1-1、将实施例1中的“金桂花干：西湖龙井茶叶＝4：1”改成“金桂花干：西湖龙井茶叶＝1：4”，其余同实施例1。

对比例1-2、将实施例1中的“金桂花干：西湖龙井茶叶＝4：1”改成“金桂花干：西湖龙井茶叶＝1：1”，其余同实施例1。

对比例1-3、将实施例1中的“金桂花干：西湖龙井茶叶＝4：1”改成“金桂花干：西湖龙井茶叶＝1：7”，其余同实施例1。

对比例1-4、将实施例1中的“金桂花干：西湖龙井茶叶＝4：1”改成“金桂花干：西湖龙井茶叶＝7：1”，其余同实施例1。

实验1金桂龙井茶清除自由基协同增效作用：

消化前样品配制：称取金桂龙井茶1g于烧杯中，加入45mL沸水后，55℃水浴中放置30min，然后使用纱布过滤，定容到50mL容量瓶中，长期保存样品需置于-20℃冰箱中。

消化后样品配制：取10mL消化前样品于烧杯中，加入3mL唾液，37℃条件下水浴恒温5min，加入6mL胃液37℃条件下避光2h，加6mL肠液于其中摇匀，然后加入到透析袋中并将其放入500mL大烧杯中，在其中加入约150mL0.9％NaCl使消化液浸没，继续37℃条件避光反应2h。将透析液在47℃下旋蒸，并用蒸馏水定容到10mL，分装后存放在-20℃冰箱中。

对消化前后样品均分别进行清除ABTS自由基能力测定和清除DPPH自由基能力测定，实验结果以平均值±标准差(Mean±SD)，采用SPSSStatistic17.0软件及Excel2010对实验数据进行整理，并用等高线图解分析法综合评价桂花茶提取物的抗氧化协同增效作用。结果如图2和图3所示。

根据图2和图3，我们得知当金桂花干：西湖龙井茶叶＝3：1～5:1(特别是4:1)时，清除自由基的协同作用最为明显，具有最佳抗氧化协同增效作用。

实施例2、四季桂乌龙茶清除自由基协同增效作用

将实施例1中的金桂花干改成四季桂花干，将西湖龙井茶叶改成安溪铁观音，其余等同于实施例1；即，四季桂花干：安溪铁观音＝4：1的质量比。

对比例2-1、将实施例2中的“四季桂花干：安溪铁观音＝4：1”改成“四季桂花干：安溪铁观音＝1：4”，其余同实施例2。

对比例2-2、将实施例2中的“四季桂花干：安溪铁观音＝4：1”改成“四季桂花干：安溪铁观音＝1：1”，其余同实施例2。

对比例2-3、将实施例2中的“四季桂花干：安溪铁观音＝4：1”改成“四季桂花干：安溪铁观音＝1：7”，其余同实施例2。

对比例2-4、将实施例2中的“四季桂花干：安溪铁观音＝4：1”改成“四季桂花干：安溪铁观音＝7：1”，其余同实施例2。

实验2、四季桂花/安溪铁观音茶清除自由基协同增效作用：

将四季桂花/安溪铁观音茶如同实验1所述方法进行检测，所得结果如图4、图5所示。

根据图4和图5，我们得知：当四季桂花干：安溪铁观音＝3：1～5:1(最佳为4:1)时，清除自由基的协同作用最为明显，具有最佳抗氧化协同增效作用。

实验3、将实施例1所得的金桂龙井茶(金桂花干：西湖龙井茶叶＝4：1)按照上文告知的UPLC方法进行主要功能性成分的检测：

即，对消化后金桂花：西湖龙井茶＝4:1的桂花茶提取溶液(即，消化后样品)进行UPLC分析，根据保留时间及相应吸收波长，对其中的功能成分定性定量分析。

结果如表2所示：

表2、金桂龙井茶消化后UPLC实验成分分析

注：桂花茶比例为4:1，各含量单位为mg/g，ND表示未检测到。

实验4、将实施例2中的“四季桂花干：安溪铁观音＝4：1”改成“四季桂花干：安溪铁观音＝3：1”，其余同实施例2。

以上述配比所得的四季桂乌龙茶，如同实验3所述的UPLC方法进行主要功能性成分的检测。

即，对消化后四季桂：安溪铁观音＝3:1的四季桂乌龙茶提取溶液进行UPLC分析，根据保留时间及相应吸收波长，对其中的功能成分定性定量分析。

结果如表3所示：

表3、消化后四季桂乌龙茶UPLC实验成分分析

注：桂花茶比例为3:1，各含量单位为mg/g，ND表示未检测到

对比例3：将实施例1中的桂花干由“利用冻干-真空微波联合干燥技术制备而得”改成“常规的自然晾晒法制备而得”，且仍然控制所得的桂花干中的水分含量约为11％。其余等同于实施例1。

对比例4：取消实施例1步骤(b)中的“先于50℃加温窨制25min，然后于8～12℃冷却50分钟，从而实现快速充分冷却；”，即，将拼和后的金桂花干/西湖龙井茶叶直接置于密闭的环境进行吸香处理，其余等同于实施例1。

实验5、将金桂花干、西湖龙井、实施例1、对比例1-1～对比例1-4、对比例3、对比例4所得的金桂龙井茶按照上文告知的“抗衰老功效”的方法进行检测：

结果如表4所示：

表4、桂花茶对衰老HDF细胞生长增殖能力的促进作用

注：*表示与金桂相比有显著性差异(p<0.05)，#表示与西湖龙井相比有显著性差异(p<0.05)。

因此，本发明所述配比为3:1～5:1(特别是4:1)之间的桂花茶对细胞增殖能力的促进明显具有协同增效作用。

实验6、将金桂、西湖龙井、实施例1、对比例1-1～对比例1-4、对比例3、对比例4所得的金桂龙井茶按照上文告知的“抗癌功效”的方法进行检测。

结果如表5所示：

表5、桂花茶对人癌细胞增殖的抑制作用

金桂、西湖龙井、金桂龙井茶均对人癌细胞K562,SMMC-7221,HCT116和A549有抑制作用，且本发明存在明显的协同增效作用。

实验7、将金桂、西湖龙井、实施例1、对比例1-1～对比例1-4、对比例3、对比例4所得的金桂龙井茶按照上文告知的“降血糖功效”的方法进行检测：

结果如表6所示：

表6、桂花茶对胰岛素抵抗细胞模型葡萄糖消耗的影响

对比试验：

将上述对比例3和对比例4所得的金桂龙井茶按照上述方法进行检测，与实施例1的清除ABTS自由基协同能力比较如图6所述，与实施例1的清除DPPH自由基协同能力比较如图7所述。

实验8、将金桂，西湖龙井，金桂龙井茶(实施例1)替换为四季桂，乌龙茶(即安溪铁观音)，四季桂乌龙茶(实施例2)，重复以上实验，得：

表7、四季桂乌龙茶对衰老HDF细胞生长增殖能力的促进作用

注：*表示与四季桂相比有显著性差异(p<0.05)，#表示与乌龙茶相比有显著性差异(p<0.05)。

表8、四季桂乌龙茶对人癌细胞增殖的抑制作用

表9、四季桂乌龙茶对胰岛素抵抗细胞模型葡萄糖消耗的影响

实施例3、将实施例1中的金桂花干改成四季桂花干，将西湖龙井茶叶改成祁门红茶，其余等同于实施例1；即，四季桂花干：祁门红茶＝4：1的质量比；所得称为四季桂红茶。

将金桂，西湖龙井，金桂龙井茶(实施例1)替换为四季桂，祁门红茶，四季桂红茶，重复以上实验，得：

表10、四季桂红茶对衰老HDF细胞生长增殖能力的促进作用

注：*表示与四季桂相比有显著性差异(p<0.05)，#表示与祁门红茶相比有显著性差异(p<0.05)。

表11、四季桂红茶对人癌细胞增殖的抑制作用

表12、四季桂红茶对胰岛素抵抗细胞模型葡萄糖消耗的影响

实施例4、将实施例1中的金桂花干改成丹桂花干，将西湖龙井茶叶改成普洱茶，其余等同于实施例1；即，丹桂花干：普洱茶＝4：1的质量比；所得称为丹桂普洱茶。

将金桂，西湖龙井，金桂龙井茶(实施例1)替换为丹桂，普洱茶，丹桂普洱茶，重复以上实验，得：

表13、丹桂普洱茶对衰老HDF细胞生长增殖能力的促进作用

注：*表示与丹桂相比有显著性差异(p<0.05)，#表示与普洱茶相比有显著性差异(p<0.05)。

表14、丹桂普洱茶对人癌细胞增殖的抑制作用

表15、丹桂普洱茶对胰岛素抵抗细胞模型葡萄糖消耗的影响

实施例5、将实施例1中的金桂花干改成银桂花干，将西湖龙井茶叶改成乌龙茶，其余等同于实施例1；即，银桂花干：乌龙茶＝4：1的质量比；所得称为银桂乌龙茶。

将金桂，西湖龙井，金桂龙井茶(实施例1)替换为银桂，乌龙茶，银桂乌龙茶，重复以上实验，得：

表16、银桂乌龙茶对衰老HDF细胞生长增殖能力的促进作用

注：*表示与银桂相比有显著性差异(p<0.05)，#表示与乌龙茶相比有显著性差异(p<0.05)。

表17、银桂乌龙茶对人癌细胞增殖的抑制作用

表18、银桂乌龙茶对胰岛素抵抗细胞模型葡萄糖消耗的影响

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.具有最佳抗氧化协同增效作用的桂花茶在制备抗癌保健品或食品中的应用，该桂花茶由桂花干：茶叶＝3～5:1的质量比混合而得。

2.根据权利要求1所述的具有最佳抗氧化协同增效作用的桂花茶在制备抗癌保健品或食品中的应用，其特征是：桂花为四季桂、丹桂、金桂、银桂。

3.根据权利要求2所述的具有最佳抗氧化协同增效作用的桂花茶在制备抗癌保健品或食品中的应用，其特征是：茶叶为西湖龙井、祁门红茶、安溪铁观音、普洱茶。

4.根据权利要求3所述的具有最佳抗氧化协同增效作用的桂花茶在制备抗癌保健品或食品中的应用，其特征是：桂花干：茶叶＝4:1的质量比。

5.根据权利要求1～4任一所述的具有最佳抗氧化协同增效作用的桂花茶在制备抗癌保健品或食品中的应用，其特征是该桂花茶的制备方法包括以下步骤：

(a)、利用冻干-真空微波联合干燥技术制备桂花干：

先进行真空冷冻干燥：将桂花在-55～-65℃的超低温中速冻2.5～3.5h后，于冷阱温度0℃、真空度1Pa的条件下干燥，直至桂花中的水分含量为35～45％；

然后将上述真空冷冻干燥处理后的桂花进行真空微波干燥，直至所得的桂花干中的水分含量为9～11％；

该桂花干作为加工桂花茶的原料；

(b)、加工桂花茶：将桂花干和茶叶按相应质量比拼和后，先于48～52℃加温窨制22～28min，然后于8～12℃冷却25～50分钟，最后置于密闭的环境中做后续的吸香处理18～22天；得桂花茶。

6.根据权利要求5所述的具有最佳抗氧化协同增效作用的桂花茶在制备抗癌保健品或食品中的应用，其特征是：所述步骤(a)中真空微波干燥为：真空度为0.095MPa，微波功率2W/g。

7.根据权利要求6所述的具有最佳抗氧化协同增效作用的桂花茶在制备抗癌保健品或食品中的应用，其特征是：所述步骤(b)中吸香处理时的密闭环境的温度为25～35℃。