CN105147588A

CN105147588A - 一种人参发酵原浆及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN105147588A
Application number: CN201510639647.3A
Authority: CN
Inventors: 王昌涛; 李萌; 方国忠; 方晓薇; 赵丹; 张佳婵; 王冬冬
Original assignee: Shanghai Biotruly Biotechnology Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI BIOTRULY BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2015-09-30
Filing date: 2015-09-30
Publication date: 2015-12-16
Anticipated expiration: 2035-09-30
Also published as: CN105147588B

Abstract

本发明公开了一种人参发酵原浆及其制备方法与应用。其制备方法包括如下步骤：将人参干粉、水和两歧双歧杆菌混合得到初始体系，并对初始体系进行发酵培养，得到人参发酵原浆。人参发酵原浆不含任何化学成分，且不需要添加酶等外来物质，不仅节约生产成本，而且最大化的简化了生产步骤，使该发酵技术能够实现大量生产、工业化生产，并能够充分保证产品质量的稳定性。同时，可以直接作为面膜或精华液或爽肤水的成品使用，比现有市面上的其他产品更加天然，不会给肌肤造成任何负作用；与普通提取方法相比，本发明能获得更小的成分，更易让皮肤充分吸收。能广泛用于制备具有抗衰老和/或清除DPPH自由基的产品中。

Description

一种人参发酵原浆及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人参发酵原浆及其制备方法与应用。

背景技术

人参为五加科物人参PanaxginsengC.A,Mey.的干燥根，是孑遗植物，也是珍贵的中药材，在我国药用历史悠久。人参具有对多种疾病防治效果和对人体滋补强壮作用,主要产于我国吉林的长白山等地区。人参中含有皂苷类，糖类，挥发性成分，有机酸及其酯，蛋白质，酶类，甾醇及其苷，多肽类，含氮化合物，木质素，黄酮类，维生素类，无机元素等成分。

现有的人参活性物提取最常采用的是回流法：以有机溶剂为提取溶剂，先通过对药材加热浸提使其中的挥发性溶剂馏出，再通过冷凝重新回到浸出器中继续循环浸提，直至有效成分浸提完全。但是该方法在提取过程中引入有机物，不仅破坏环境，且在应用的过程中存在潜在的安全隐患。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种人参发酵原浆及其制备方法。

本发明提供的人参发酵原浆的制备方法，包括如下步骤：将人参干粉、水和双歧杆菌混合得到初始体系，并对初始体系进行发酵培养，得到人参发酵原浆化妆品。

上述制备方法中，所述双歧杆菌、所述人参干粉和水的配比为(20-40)ml：(2-10)g：500g，具体可为20ml：10g：500g。所述发酵菌的浓度为10⁶-10⁹CFU/ml。

所述发酵培养的温度为27-41℃，具体可为35℃，时间为20-38h，具体可为24h。

所述双歧杆菌具体为两歧双歧杆菌Bifidobacteriumbifidum，ATCC编号为29521。

所述两歧双歧杆菌具体可以其培养液或悬浮液的形式存在，所述两歧双歧杆菌的培养液或悬浮液的pH值为6.5-7.5。

所述人参干粉取自干燥人参，所述人参干粉的目数为20-50目，具体可为30目，将干燥人参经粉碎机粉碎、过筛后得到。

上述制备方法中，还包括对所述发酵培养后所得发酵液依次进行灭菌、离心、取上清液的步骤，即得到人参发酵原浆。

其中，所述灭菌的条件如下：灭菌温度为110-121℃(具体可为115℃)，灭菌时间为15-30min(具体可为20min)。

所述离心的条件如下：离心转速为3500-4500r/min(具体可为4000r/min)，离心时间为18-25min(具体可为20min)，离心半径为9cm。

本发明所制备得到的人参发酵原浆也属于本发明的保护范围。

本发明所制备得到的人参发酵原浆在制备具有下述至少一种功能的化妆品中的应用或在直接作为具有下述至少一种功能的化妆品中的应用：

1)抗衰老；3)清除DPPH自由基。

上述应用中，所述化妆品具体可为面膜、精华液或爽肤水中的任一种。

与现有技术相相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明采用两歧双歧杆菌对人参进行发酵，保留了植物的全部功效成分及其活性，避免了提取方法造成的活性成分流失；

(2)本发明所采用的发酵法，在对人参有效成分提取过程中，不添加任何有机试剂，发酵温度和发酵pH温和，植物活性成分结构不被破坏，保持植物的天然活性，同时，节约生产成本，而且最大化的简化了生产步骤，使该发酵技术能够实现大量生产、工业化生产，并能够充分保证产品质量的稳定性；

(3)本发明提供的人参发酵原浆化妆品，发酵原浆中不添加香精等对化学成分，确保产品对人体的安全性。可以直接作为面膜或精华液或爽肤水的成品使用，比现有市面上的其他产品更加天然，不会给肌肤造成任何负作用；且此方法获得小分子量多肽，易于让皮肤充分吸收；

(4)本发明提供的人参发酵原浆中富含的蛋白质、多糖、黄酮等物质，与发酵滤液中的益生菌发酵产物成分具有协同作用，从而具有显著地抗氧化及抗衰老作用。

附图说明

图1为实施例2中人参发酵原浆的活性多肽分子量分布HPLC图谱。

图2为实施例2中不同浓度的人参发酵原浆(溶剂为去离子水)与DPPH自由基清除率的关系曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的液体培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其在液体培养基中的浓度为：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，pH值为7.0。

下述实施例中的YPD培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其在液体培养基中的浓度为：酵母提取物1％(质量分数)，胰蛋白胨2％(质量分数)，葡萄糖2％(质量分数)，pH值为7.0。

下述实施例中的人参购自青海康普生物科技有限公司。

下述实施例中的两歧双歧杆菌Bifidobacteriumbifidum的ATCC编号为29521，可从ATCC获得。

实施例1、一种人参发酵原浆及其制备方法：

1、菌种的活化：

挑取两歧双歧杆菌菌落一环于液体培养基中，放入摇床中将菌种活化，得到活化后两歧双歧杆菌菌液。

2、菌种的纯化：

将步骤1得到的活化后的菌液梯度稀释铺板，以便获取单菌落，得到纯化后两歧双歧杆菌。

3、菌种的扩大培养：

将步骤2得到的纯化后的菌种接种到YPD培养基(pH值为7.0)中，于25℃的摇床中培养，当OD值＝0.6-1.2时，得到发酵菌菌液(菌种处在对数期，浓度为10⁶-10⁹CFU/ml)。

4、人参发酵原浆的获得：

将20mL步骤3得到的发酵菌菌液(浓度为10⁹CFU/ml)接种到10g的人参花干粉和500g的水中，得到发酵体系；将发酵体系于35℃摇床中发酵24h，得到发酵产物；将发酵产物于115℃高压灭菌20min，使菌失活，得到灭菌后的发酵产物；将灭菌后的发酵产物于4000r/min、离心半径为9cm的条件下离心20min，弃沉淀，收集上清液，即为人参发酵原浆。

该实施例制备所得的人参发酵原浆化妆品的外观为粘稠液体、颜色为淡黄色至棕黄色。pH值5.2-6.3，粘度200-500cP，可溶性固含物含量1.5-5.0％，菌落总数小于50CFU/ml，无致病菌检出。根据化妆品卫生标准GB7916-87，化妆品细菌总数不高于1000CFU/ml，所以此发酵原浆符合化妆品质量要求。

对该人参发酵原浆进行成分分析，蛋白质检测方法参照GB5009.5-2010；粗多糖检测方法参照GB/T5009.8-2008；氨基酸检测方法参照GB/T5009.124-2003；总酚检测方法参照GB/T8313-2008所得结果如下：

本发明制得的人参发酵原浆含蛋白质2.92g/kg、粗多糖7.33g/kg、总黄酮0.057g/kg(以芦丁计)、总酚0.062g/kg。

实施例2、人参发酵原浆在作为化妆品(面膜或精华液或爽肤水)中的应用：

一、人参发酵原浆的安全性检测：

人体斑贴试验主要是用于检测化妆品终产品或原料的刺激性。本发明对实施例1中获得的人参发酵原浆进行人体封闭式斑贴试验，旨在对其潜在皮肤刺激性进行评估。

1、试验对象：

选择合适的志愿者30人，年龄范围在18-60岁随机选择。

2、试验方法：

若为固体样品或半固体的样品，则称取0.020g-0.025g置于斑试器中备用；若是液体样品，则量取0.025mL-0.2mL滴加于滤纸片上，再将滤纸片置于斑试器内。本发明采用后者，每个样品均设置空白对照，在对照斑试器孔内加入与样品等量的样品溶剂，如蒸馏水或橄榄油，本发明采用蒸馏水。

试验部位选为人体背部，利用无刺激性的胶带将斑试器固定贴敷于受试者背部。测试周期持续24h。为了试验结果的准确、可信和科学，在测试期间志愿者按照要求，不能摘掉斑试器，亦不可使受试部位接触水。24h后去除斑试器，静置30min后，等待压痕消失，观察皮肤的反应。如果试验结果为阴性，则需要在斑贴试验后24h和48h分别再观察一次。

3、试验结果：

斑贴试验结果如下表1所示：

其中，*"-"＝阴性反应；

一级不良反应："±"＝可疑反应：仅有微弱红斑；

二级不良反应："+"＝弱阳性反应(红斑反应)：红斑、浸润、水肿、可有丘疹；

三级不良反应："++"＝强阳性反应(疱疹反应)：红斑、浸润、水肿、丘疹、疱疹，反应可超出受试区；

四级不良反应："+++"＝极强阳性反应(融合性疱疹反应)：明显红斑、严重浸润、水肿、融合性疱疹，反应超出受试区。

根据化妆品卫生规范2007，人体斑贴试验判断标准为：30例受试者中出现1级皮肤不良反应的人数多于5例，或二级皮肤不良反应的人数多于2例，或出现任何1例三级或三级以上皮肤不良反应时，则判定受试物对人体有不良反应，反之，则视为对人体无不良反应。

从表1中可以看出：实施例1得到的人参发酵原浆均未产生可疑反应，说明本发明提供的人参发酵物均具有安全性，不会给人体带来不良反应。

表1、实施例1获得的人参发酵原浆的斑贴试验结果

二、人参发酵原浆的分子量大小检测：

分子量大小是检验是否能够进行皮肤渗透的重要因素。本发明通过高效液相色谱(HPLC)测定实施例1制备的人参发酵原浆的分子量大小。具体步骤如下：

1、试验的试剂和溶液的制备：

(1)流动相：乙腈：水：三氟乙酸＝30：70：0.1(v/v/v)。

(2)样品制备：以流动相为溶剂配制浓度为5mg/ml的样品，再在用微孔膜(0.45μm)过滤后供进样。

(3)标准样品制备：将牛血清蛋白(Mw67000)、维生素B₁₂(Mw1335)、氧化型谷胱甘肽(Mw614)配成混标，每种物质的浓度均为5mg/ml。

2、试验方法：

将三种已知分子量的标准品：牛血清白蛋白(Mw67000)，维生素B₁₂(Mw1335)和氧化型谷胱甘肽(Mw614)通过高效液相色谱仪(Waters公司)参照文献“王成忠等.蛋白酶酶解麦胚蛋白及酶解液中多肽分子量分布的研究.粮食加工，2012:37(2)”中的方法进行HPLC分析，绘制分子量对数与洗脱时间的标准曲线。根据凝胶柱渗透层析原理，多肽分子量大的物质先被洗脱出来，洗脱时间与分子量的对数呈线性关系。再按照同样的方法将实施例1中制备的人参发酵原浆进行HPLC分析，得到相应峰的洗脱时间，将洗脱时间代入标准曲线，即可得到实施例1制备的人参发酵原浆的分子量大小。

色谱条件：色谱柱：TsKgel2000SWXL300mm×7.8mm；检测波长：UV280nm；流速：1ml/min；柱温：30℃。

3、试验结果：

标准物质的分子量与洗脱时间的如表2所示，根据分子量的对数和洗脱时间做图得到标准曲线：y＝-2.4738x+17.656，R²＝0.9998。其中y为洗脱时间(min)；x为分子量对数。

表2、标准物质的分子量与洗脱时间

实验组1制备的人参发酵原浆的HPLC图谱如图1所示：从图1中可以看出，人参发酵原浆的图谱中主要包括1个组分峰，洗脱时间为11.60min，将洗脱时间代入标准曲线：y＝-2.4738x+17.656，计算出峰的分子量为280.84Da，并且根据峰面积计算人参发酵原浆占98.71％。一般认为分子量500Da左右活性肽成分更易被皮肤吸收，所以人参发酵物中存在容易被吸收的活性多肽。

三、人参发酵原浆的抗氧化性能检测：

DPPH是一种早期合成的有机自由基，常用来评估抗氧化物的供氢能力，它在有机溶剂中非常稳定，呈紫色，而且在517nm处有一个特征吸收峰，当遇到自由基清除剂时，DPPH的孤对电子被配对而使其退色，也就是在最大吸收波长处的吸光值变小。因此，可通过测定吸光值的变化来评价样品对DPPH自由基的清除效果。

取不同量的实施例1制备得到的人参发酵原浆溶于去离子水中，制得0.63％、1.25％、2.5％、5％和10％体积百分含量的人参发酵原浆待测液。

DPPH自由基清除实验的具体实验步骤为：

(1)取等体积(一般为3mL)的待测液与2×10^-4mol/L的DPPH溶液混匀(A₁管)；

(2)取等体积的无水乙醇(待测物溶剂)与2×10^-4mol/L的DPPH溶液混匀(A₂管)；

(3)取等体积的无水乙醇与待测液混匀(A₃管)；

(4)反应30min后，在517nm下测A₁、A₂、A₃管吸光度值。

清除率计算公式为：清除率(％)＝[(A₂+A₃)-A₁]/A₂

以人参发酵原浆待测液的体积百分含量为横坐标，清除率为纵坐标，做出人参发酵原浆对DPPH自由基清除作用曲线，见附图2。

由图2可知，实施例1所得人参发酵原浆对DPPH清除作用的IC50＝9.9％，说明人参发酵原浆具有较强的抗氧化能力可清除自由基，促进细胞代谢，增强细胞活力，改善机体的结构和功能，提高机体生命力，从而延缓细胞老化，发挥其抗衰老的作用。

Claims

1.一种人参发酵原浆制备方法，包括如下步骤：将人参干粉、水和双歧杆菌混合得到初始体系，并对初始体系进行发酵培养，得到人参发酵原浆化妆品。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述双歧杆菌、所述人参干粉和水的配比为(20-40)ml：(2-10)g：500g，所述双歧杆菌浓度为10⁶-10⁹CFU/ml。

3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述发酵培养的温度为27-41℃，时间为20-38h；

所述双歧杆菌为两歧双歧杆菌Bifidobacteriumbifidum。

4.如权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述人参干粉取自干燥人参。

5.如权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述人参干粉的目数为20-50目。

6.如权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征在于：上述制备方法中，还包括对所述发酵培养后所得发酵液依次进行灭菌、离心、取上清液的步骤。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述灭菌的条件如下：灭菌温度为110-121℃，灭菌时间为15-30min；

所述离心的条件如下：离心转速为3500-4500r/min，离心时间为18-25min，离心半径为9cm。

8.权利要求1-7中任一项所述的制备方法而得到的人参发酵原浆。

9.权利要求8所述的人参发酵原浆在制备具有下述至少一种功能的化妆品中的应用或在直接作为具有下述至少一种功能的化妆品中的应用：

1)抗衰老；3)清除DPPH自由基。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述化妆品为面膜、精华液或爽肤水。