CN113384506A

CN113384506A - 一种低刺激性植物酵素美白纳米组合物和制备方法及其应用

Info

Publication number: CN113384506A
Application number: CN202110776263.1A
Authority: CN
Inventors: 杜养标; 骆晔媛; 赵炳天; 梁蓉
Original assignee: Jiangsu Ruiting Biotechnology Co ltd
Current assignee: Jiangsu Ruiting Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-07-08
Filing date: 2021-07-08
Publication date: 2021-09-14
Anticipated expiration: 2041-07-08
Also published as: CN113384506B

Abstract

本发明公开了一种低刺激性植物酵素美白纳米组合物和制备方法及其应用，包括，包括，脂溶性美白活性物、植物酵素、油脂、助溶剂、乳化剂和其它添加剂。其中所述美白活性物为0.1～10％，所述油脂为1～10％，所述助溶剂为20～60％，所述乳化剂为0.5～10％，所述其它添加剂为0.1～1％，余量为植物酵素补足至100％；所述美白活性物为苯乙基间苯二酚、4‑丁基间苯二酚、己基间苯二酚中的一种或几种。本发明将植物酵素和美白活性物组合使用，能够在提高美白活性物有效使用浓度的同时降低其刺激性，大大扩展了其应用性。

Description

一种低刺激性植物酵素美白纳米组合物和制备方法及其应用

技术领域

本发明属于微纳米载体技术领域，具体涉及到一种低刺激性植物酵素美白纳米组合物和制备方法及其应用。

背景技术

随着生活水平的提高，人们对皮肤护理(特别是面部皮肤的护理及保养)越来越重视。

近年来人们对生活必备的化妆品要求越来越高，不仅要求具备较好的功效，更对其所引起的皮肤的安全问题十分关注。

目前，市面上的美白类护肤品普遍存在的以下问题：低浓度使用时难以达到消费者期望的显著效果；增加使用量又会发生比较严重的接触性皮炎，过敏等问题，表现为皮肤的红肿、瘙痒、疼痛等表现；产品稳定性差，对光、热、金属离子敏感；有效成分生物利用度低；有效成分透皮吸收差。

因此，本领域亟需一种低刺激性植物酵素美白纳米组合物和制备方法，具备良好的抗炎活性，降低皮肤致敏致痘的风险。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种低刺激性植物酵素美白纳米组合物。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种低刺激性植物酵素美白纳米组合物，包括，

脂溶性美白活性物、植物酵素、油脂、助溶剂、乳化剂、螯合剂、抗氧化剂和光稳定剂；

按原料总质量百分比计，所述美白活性物含量为0.1～10％，所述油脂含量为1～10％，所述助溶剂含量为20～60％，所述乳化剂含量为3～10％，所述螯合剂含量为0.1～1％，所述抗氧化剂含量为0.1～1％，所述光稳定剂含量为0.1～1％，植物酵素含量为20％～50％，原料总质量为100％。

作为本发明所述低刺激性植物酵素美白纳米组合物的一种优选方案，其中：所述美白活性物包括苯乙基间苯二酚、4-丁基间苯二酚、己基间苯二酚中的一种或几种。

作为本发明所述低刺激性植物酵素美白纳米组合物的一种优选方案，其中：所述油脂包括辛酸癸酸甘油酯、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、异壬酸异壬酯、角鲨烷、角鲨烯、异构十六烷、鲸蜡硬脂醇、山嵛醇、蜂蜡中的一种或几种。

作为本发明所述低刺激性植物酵素美白纳米组合物的一种优选方案，其中：所述助溶剂包括甘油、二乙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、山梨醇中的一种或几种。

作为本发明所述低刺激性植物酵素美白纳米组合物的一种优选方案，其中：所述乳化剂包括卵磷脂、氢化卵磷脂、聚山梨醇酯、月桂醇聚醚、PEG-20植物甾醇、聚甘油-10月桂酸甘油酯、聚甘油-10肉豆蔻酸甘油酯、甘油硬脂酸酯、PEG-60氢化蓖麻油、和糖酯中的一种或几种。

本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种低刺激性植物酵素美白纳米组合物的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种低刺激性植物酵素美白纳米组合物的制备方法，包括，

按照原料配比将美白活性物、油脂、光稳定剂、抗氧化剂混合得油相，水浴锅中加热磁力搅拌至完全溶解；

将乳化剂和助溶剂、植物酵素、螯合剂混合得水相，于水浴锅中加热搅拌至完全溶解；

将油相加入水相，10000～15000rpm高速分散3～5min，然后高压均质，80MPa循环均质6次，制备得到低刺激性植物酵素美白纳米组合物。

作为本发明所述低刺激性植物酵素美白纳米组合物制备方法的一种优选方案，其中：按原料总质量百分比计，所述美白活性物含量为0.1～10％，所述油脂含量为1～10％，所述助溶剂含量为20～60％，所述乳化剂含量为3～10％，所述螯合剂含量为0.1～1％，所述抗氧化剂含量为0.1～1％，所述光稳定剂含量为0.1～1％，植物酵素含量为20％～50％，原料总质量为100％。

本发明的另一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种低刺激性植物酵素美白纳米组合物在化妆品中的应用，所述的化妆品包括洗面奶、面膜、化妆水、乳液、膏霜、精华中的一种或多种。

本发明有益效果：

(1)本发明将植物酵素和美白活性物组合使用，能够在提高美白活性物有效使用浓度的同时降低其刺激性，大大扩展了其应用性；本发明采用植物酵素代替水制备的纳米组合物，提升了植物提取物的生物利用率，将植物中大分子有效成分通过生物发酵转化为更易于皮肤吸收的小分子，提升了其抗炎活性，降低了皮肤致敏致痘的风险。

(2)本发明通过纳米技术将植物酵素、美白活性物和其它添加剂有效的组合，提高了功能性成分的光、热稳定性；制备了具有良好水分散性的纳米乳液，使其可以与化妆品配方任意搭配；良好的透皮吸收性，有效成分从皮肤表面进入表皮和真皮，传输作用到靶点部位积聚发挥作用，大大提高了其生物利用度。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为本发明细胞毒性测定结果对比图；

图2为本发明皮肤开放型斑贴试验图示；

图3为本发明B16-F10细胞内黑色素含量测定结果对比图；

图4为本发明皮肤封闭型型斑贴试验图示。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

本发明中植物酵素的制备方法如下：

取植物叶片，粉碎过60～100目筛，按照50～75g/L的添加量加入去离子水中，同时加入10g/L的葡萄糖，调节体系pH为4.5～5.0；

将发酵培养基在121℃、0.1Mpa的条件下灭菌20min，制得灭菌后的发酵培养基；

将植物乳杆菌接种于MRS培养基中，于37℃，200rpm培养18～24h，待菌体浓度达到10⁶～10⁷CFU/mL时，以5％～10％的接种量接种于灭菌后的发酵培养基中发酵培养后，陶瓷膜过滤，即得到积雪草发酵滤液；其中，

将接种植物乳杆菌后的培养基于35±2℃，200rpm培养48～72h，待残糖为0时，终止发酵；发酵结束后的发酵液在121℃、0.1Mpa的条件下灭菌20min，将灭菌发酵液，先由200～300目纱布过滤除去固体不溶物，然后将过滤的清液经陶瓷膜过滤，得到发酵滤液；

其中，植物乳杆菌为CICC24202，购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心，植物为积雪草、紫草、甘草和马齿苋。

实施例1

按照表1中原料配比制备样品，将活性物、油脂、光稳定剂、抗氧化剂混合得油相，水浴锅中加热磁力搅拌至完全溶解；

将油相加入水相，采用高速分散于15000rpm，分散3min，然后采用高压均质技术，80MPa，循环6次，制备得到的样品。

表1样品原料配比表(％)

实施例2

各样品粒径结果见表2，如下所示：

表2

从表2可以看出：植物酵素-美白活性物-其它添加剂组成的纳米乳液的热稳定性最佳。

实施例3

按照表3中原料配比制备样品，将活性物、油脂、光稳定剂、抗氧化剂混合得油相，水浴锅中加热磁力搅拌至完全溶解；

表3

原料	样品1	样品12	样品13	样品14
					苯乙基间苯二酚(份)	10	10	10	10
积雪草发酵液(份)	38.3	48.3	58.3	68.3
					甘油(份)	35	25	15	5
辛酸癸酸甘油酯(份)	7	7	7	7
					角鲨烷(份)	1	1	1	1
山嵛醇(份)	2	2	2	2
					氢化卵磷脂(份)	4	4	4	4
糖酯(份)	1	1	1	1
					PEG-60氢化蓖麻油(份)	0.5	0.5	0.5	0.5
螯合剂(份)	0.1	0.1	0.1	0.1
					抗氧化剂(份)	1.0	1.0	1.0	1.0
光稳定剂(份)	0.1	0.1	0.1	0.1

各样品粒径结果见表4，如下所示：

表4

从表4可以看出：植物酵素含量高，乳液不稳定，可能植物酵素含量高由于会导致体系中电解质含量过高，造成乳液不稳定。

实施例4

细胞毒性试验

本实验选用人永生化表皮细胞(HaCaT细胞)作为模型细胞，考察植物酵素和美白活性物对皮肤细胞的毒性作用。

接种：HaCaT细胞按照1.0×10⁵个/mL接种到96孔板，每孔100μL。

加样：细胞融合度达到约90％，去培养基，并用PBS洗3次。样品组细胞向每孔加入100μL DMEM培养基稀释的积雪草发酵液(DMEM浓度大于70％对细胞生长影响较小)，于培养箱中培养24h,对照组和空白组细胞DMEM培养。

刺激：用100μg/mL苯乙基间苯二酚刺激样品组和对照组细胞24h，空白组细胞不刺激。

细胞活力检测：去培养液，每孔加入150μL浓度为0.5mg/mL的MTT溶液(DMEM配制)。培养箱中放置4h后，吸去溶液并加入100μLDMSO，于490nm下测吸光度。

细胞毒性测定结果见图1。

结果显示：随着积雪草发酵产物滤液的含量的增加，HaCaT细胞存活率越来越高，可见积雪草发酵产物滤液有效的降低了苯乙基间苯二酚对HaCaT细胞的刺激。

实施例5

选取18～35岁的志愿者50名，随机分成5组，每组10人。参照《化妆品卫生规范》(2015版)中“人体皮肤斑贴试验”的相关要求进行人体皮肤不良反应测试。

样品：1号样品——实施例1中样品1的5％水溶液；

2号样品——实施例1中样品2的5％水溶液；

3号样品——实施例1中样品8的5％水溶液；

阴性对照——纯水。

皮肤开放型斑贴试验图示，见图2。

斑试方法：前臂屈侧作为受试部位，面积3×3cm²，受试部位应保持干燥，将试验物0.020ml每天2次均匀地涂于受试部位，连续7天，同时观察皮肤反应，按《化妆品安全技术规范》(2015年版)中皮肤反应分级标准(表35)记录其结果(表46)。

表5皮肤开放型斑贴试验皮肤反应分级标准

表6皮肤开放型斑贴试验试验结果

从表6中可以看出涂抹1号样品的志愿者的试验结果均为阴性，无不良皮肤反应发生。涂抹2号样品的部分志愿者出现阳性反应。涂抹3号样品的部分志愿者出现阳性反应。表明制备的低刺激植物酵素美白纳米组合物更温和、无刺激，安全性好。

实施例6

B16-F10细胞内黑色素含量测定

样品：1号样品——实施例1中样品1

2号样品——实施例1中样品2

将B16-F10细胞接种于6孔板中，接种密度为4×10⁵个/mL，每孔2mL培养24h，使用含有一定浓度梯度的样品及500nMα-MSH的完全培养液孵育细胞72h。孵育结束后使用PBS清洗2遍，每孔加入500μL的胰酶酶解，3min后加入500μLDMEM停止消化，收集于离心管中，13000r/min下离心5min，除去上清液，对离心后的细胞使用300μL含10％DMSO的1M NaOH溶解，405nm下测其吸光度。实验结果以相对黑素含量表示。结果见图3。

从图3结果可以看出，植物酵素美白纳米组合物在降低刺激性的同时，还可以提高体系的美白效果。

实施例7

试验的人员：18～35岁的志愿者50名，选用合格的斑试器，以封闭式斑贴试验方法，将0.020mL的样品涂于斑试器内，24小时后去除受试物，分别于去除后0.5、24、48小时观察皮肤反应，按《化妆品安全技术规范》(2015年版)中皮肤反应分级标准记录其结果。

样品：3号样品——实施例1中样品3的12％水溶液

4号样品——实施例1中样品4的12％水溶液

阴性对照——纯水

皮肤封闭型型斑贴试验图示，图4。

表7皮肤封闭型斑贴试验皮肤反应分级标准

表8皮肤封闭型斑贴试验试验结果

从表8中可以看出涂抹3号样品的志愿者的试验结果均为阴性，无不良皮肤反应发生。涂抹4号样品的部分志愿者出现阳性反应。表明制备的低刺激植物酵素美白纳米组合物更温和、无刺激，安全性好。

实施例8

DPRA(直接肽反应)检测

化合物透过皮肤后与角质细胞上具有亲核中心的蛋白结合形成稳定的免疫复合物，从而引起免疫反应。通过考察受试物与具有亲核中心的半胱氨酸或赖氨酸多肽的结合来模拟免疫复合物的形成，采用高效液相色谱检测多肽的消耗率，根据多肽的消耗量来预测受试物的皮肤致敏能力。

样品：实施例1中样品7

合成多肽(纯度>90％)：半胱氨酸多肽(Ac-RFAACAA-COOH)，赖氨酸多肽(Ac-RFAAKAA-COOH)。

其它：乙腈(HPLC级)，三氟乙酸，二水合磷酸二氢钠，十二水合磷酸氢二钠，乙酸铵，氨水，肉桂醛(AR级)。

实验方法：

1、溶液配制

多肽贮备液的配制：半胱氨酸多肽用pH 7.5的0.1M PBS缓冲液溶解，浓度为1.0mM，赖氨酸多肽用pH 10.2的0.1M乙酸铵缓冲液溶解，浓度为1.0mM。

受试物：4％4,6-糖透明质酸溶液。

阳性对照溶液：肉桂醛用乙腈配制成0.1M溶液。

2、进样溶液准备

在进样瓶中按下表加入试剂，混匀。

表9测定进样表

样品组	空白A	空白B
			50μL多肽溶液	50μL多肽溶液
10μL待测样品		25μL待测样品
			20μL缓冲液	30μL缓冲液	55μL缓冲液
检测前加入20μL乙腈	检测前加入20μL乙腈	检测前加入20μL乙腈

将进样瓶在25±2.5℃下避光孵育24±2h。

3、液相色谱条件

流动相：A相为0.1％三氟乙酸水溶液，B相为0.1％三氟乙酸乙腈溶液。

检测条件：C-18色谱柱，柱温25℃，进样量10μL，于220nm处检测出峰。

流动相洗脱条件：80％A液+20％B液，流速1mL/min，洗脱12min。

4、数据处理

5、结果分析

表10 DPRA检测结果分析标准

表11-1 DPRA检测结果(赖氨酸多肽消耗率)

样品	赖氨酸多肽消耗率/％	DPRA结果
			样品7	3.33±0.31	阴性
肉桂醛	91.71±2.01	阳性

表12-2 DPRA检测结果(半胱氨酸多肽消耗率)

样品	半胱氨酸多肽消耗率/％	DPRA结果
			样品7	5.72±0.34	阴性
肉桂醛	96.78±1.23	阳性

DPRA实验结果表明，样品7在0.5％的体系浓度下无致敏性。

针对目前市售美白产品目前存在稳定性差、容易致敏、生物利用率低的问题，本发明将植物酵素和美白性功能成分和其它添加剂通过纳米技术进行有机结合。在保证载体粒子达到纳米级粒度的同时，大大提高了功能性成分的光、热稳定性；制备了具有良好水分散性的纳米乳液，使其可以与化妆品配方任意搭配；良好的透皮吸收性，有效成分从皮肤表面进入表皮和真皮，传输作用到靶点部位积聚发挥作用，提高了其生物利用度。

采用植物酵素代替水制备的纳米组合物，提升了植物提取物的生物利用率，将植物中大分子有效成分通过生物发酵转化为更易于皮肤吸收的小分子，提升了其抗炎活性，降低了皮肤致敏致痘的风险；能够在提高美白活性物有效使用浓度的同时降低其刺激性，大大扩展了其应用性。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种低刺激性植物酵素美白纳米组合物，其特征在于：包括，

2.如权利要求1所述的低刺激性植物酵素美白纳米组合物，其特征在于：所述植物酵素包括积雪草发酵产物滤液、紫草发酵产物滤液、甘草发酵产物滤液和马齿苋发酵产物滤液中的一种或几种。

3.如权利要求2所述的低刺激性植物酵素美白纳米组合物，其特征在于：所述美白活性物包括苯乙基间苯二酚、4-丁基间苯二酚、己基间苯二酚中的一种或几种。

4.如权利要求1～3中任一所述的低刺激性植物酵素美白纳米组合物，其特征在于：所述油脂包括辛酸癸酸甘油酯、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、异壬酸异壬酯、角鲨烷、角鲨烯、异构十六烷、鲸蜡硬脂醇、山嵛醇、蜂蜡中的一种或几种。

5.如权利要求1～3中任一所述的低刺激性植物酵素美白纳米组合物，其特征在于：所述助溶剂包括甘油、二乙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、山梨醇中的一种或几种。

6.如权利要求1～3中任一所述的低刺激性植物酵素美白纳米组合物，其特征在于：所述乳化剂包括卵磷脂、氢化卵磷脂、聚山梨醇酯、月桂醇聚醚、PEG-20植物甾醇、聚甘油-10月桂酸甘油酯、聚甘油-10肉豆蔻酸甘油酯、甘油硬脂酸酯、PEG-60氢化蓖麻油、和糖酯中的一种或几种。

7.权利要求1～6中任一所述的低刺激性植物酵素美白纳米组合物的制备方法，其特征在于：包括，

8.如权利要求7所述的低刺激性植物酵素美白纳米组合物的制备方法，其特征在于：按原料总质量百分比计，所述美白活性物含量为0.1～10％，所述油脂含量为1～10％，所述助溶剂含量为20～60％，所述乳化剂含量为3～10％，所述螯合剂含量为0.1～1％，所述抗氧化剂含量为0.1～1％，所述光稳定剂含量为0.1～1％，植物酵素含量为20％～50％，原料总质量为100％。

9.权利要求1～6中任一所述的低刺激性植物酵素美白纳米组合物在化妆品中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的化妆品包括洗面奶、面膜、化妆水、乳液、膏霜、精华中的一种或多种。