CN113440457A - 一种白及组方及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种白及复方本草组合物及其制备方法。本发明首创闪式提取‑酶解‑絮凝‑离心联用方法，能够提高复方的有效成分提取效率并提高药材残渣的除去效率，整体上提高有效成分含量，减少提取物杂质，最终提高护肤应用的功效。本发明的方法制备的提取物原料，在美白、抗衰老、保湿、护肤方面功效提升10％‑30％不等，肤感也有较高的提升。

Description

一种白及组方及其制备方法
技术领域
本发明涉及日化领域，并具体涉及一种复方本草组合物及其提取方法。
背景技术
白及是一种常见的中药，系兰科植物白及(Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.)的干燥块茎。白及多糖是中药白及中的有效成分，其主要原料的功效物质基础是粘液质多糖(粘多糖)，具有补肺止血、消肿敛疮、祛瘀生肌、润肺止咳及抗肿瘤功效。
茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核。而白茯苓为药材茯苓块切去赤茯苓后的白色部分，味甘、淡、性平，入药具有利水渗湿、益脾和胃、宁心安神之功用。白茯苓富含多糖类成分，在化妆品中广为使用，主要应用在以古方七白散为基础的中药组方中，常与白及、白芍、桑白皮、白术等中药配伍，用于美白嫩肤等护肤产品中。傅国强等用多巴色素法测定对酪氨酸酶抑制作用的研究表明白僵蚕、白蒺藜、白及、白附子、白茯苓、白芍都对酪氨酸酶有不同程度的抑制作用。酪氨酸酶是合成黑色素的关键催化剂，通过实验室相关研究，证实白芍、白术、茯苓、白芷、白蔹、白芨、薏苡仁等美白药物在抑制酪氨酸酶方面有很大优势。同时通过对比常用美白中药的醇、水提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用，发现其不同提取方式对其临床治疗效果有较大影响。通过不断努力,中药在治疗色素增多性皮肤病方面将大有作为。
藏菖蒲系藏族习用药材，为天南星科植物藏菖蒲Acorws calamus L.的干燥根茎。秋、冬二季采挖，除去须根和泥沙，晒干。苦、辛，温、燥、锐。温胃，消炎止痛。用于补胃阳，消化不良，食物积滞，白喉，炭疽等。藏菖蒲又称水菖蒲，多生于湖泊、池塘、河流岸边的浅水处，因全株带有浓烈而刺激的土腥味，故又称"臭蒲"。中医认为水菖蒲性温，味辛苦，有除湿健脾、杀虫止痒功效，其水煎液对治疗细菌感染、过敏、疥疮等引起的皮肤瘙痒，效果明显。民间常用本品煎洗治疗风疹瘙痒、湿疹等。在传统用药中，菖蒲为常用中草药，其下品类众多，“菖蒲”始载于《神农本经》，列为上品。藏菖蒲和石菖蒲虽通归于菖蒲药材品种下，但是它们的功效却有显著差异，藏菖蒲味辛、苦、温、燥、锐，温胃，消炎止痛，用于补胃阳，消化不良，食物积滞，白喉，炭疽等。而石菖蒲味辛、性微温，化湿开胃，开窍豁痰，醒神益智，用于脘痞不饥，噤口下痢，神昏癫病，健忘耳聋。因此，两者组方和用药的功效上具有显著的差异。
中草药做为安全有效的活性成分被广泛应用在化妆品中，这些应用很多来自古方的启发，一些来自临床药用经验方及创新。化妆品用中草药原料安全也比其他领域更要关注，因为其长期使用的特点，并非来古临床或古方的中草药原料就是安全的，所以除了有效之外，中草药安全性评估也是很重要的评价因素。例如，在古方和皮肤病科医院常用中草药白芷在古方中应用广泛，但现代研究表明，白芷中香豆素类成分具有很强的光毒性，长期使用具有致敏致斑的问题，所以化妆品原料安全评估也是非常重要的研究之一。
现有技术中未见白及、白茯苓与藏菖蒲组合，以及含有白及、白茯苓与藏菖蒲的具有美白、抗衰老、抗炎、保湿和/或护肤的复方本草组合物或产品。
另外，多糖提取方法主要有：水提醇沉法、醇提取法、逆流提取法、碱水提取法、超声提取法、酶解提取法等。水提醇沉法和醇提取法是多糖提取常用的方法，操作比较简单，但这两种工艺均涉及酒精原料，需要回收酒精，并且对生产车间有防爆相关设备的要求。碱水提取法则存在腐蚀性大、残留等问题。超声提取法和酶解提取法能够在一定程度上促进破裂植物细胞组织并提高提取效率，但是单独应用效果有限。
现有技术未见闪式提取-酶解-絮凝-离心联用提取方法。
现有技术对具有美白、抗衰老、抗炎、保湿和/或护肤以及极佳的安全性的复方本草组合物以及提取率高、提取时间短以及所提取的组合物在美白、抗衰老、抗炎、保湿和/或护肤等方面具有改善功效和/或具有极佳的安全性的提取方法的需求。
发明内容
本发明通过包含白及、白茯苓和藏菖蒲的复方本草组合物以及该复方本草组合物的制备方法解决了现有技术中存在的问题。
本发明的复方本草组合物(即白及组方)富含多糖，其主要原料的功效物质基础是粘液质多糖(粘多糖)。为了将白及组方作为化妆品功效原料，在白及组方的提取工艺中，分离除去淀粉等杂质并最大程度分离提取物获得粘多糖是化妆品功效原料工艺的终极目标。本发明提供的闪式提取-酶解-絮凝-离心联用提取白及组方多糖不仅提高了多糖提取率，更把提取、纯化在一套流程完成，且制备的提取物从多个维度评价具有更优异的护肤特性。
本发明的第一方面涉及一种复方本草组合物，其包含白及、白茯苓和藏菖蒲。
本发明的第二方面涉及一种复方本草组合物的制备方法，其包括以下步骤：(1)闪式提取；(2)酶解；(3)絮凝；(4)离心。
本发明的第三方面涉及由(1)闪式提取；(2)酶解；(3)絮凝；(4)离心制备的复方本草组合物。
本发明的第四方面涉及用于美白、抗衰老、抗炎、保湿和/或护肤和/或具有极佳的安全性的复方本草组合物。
本发明的第五方面涉及复方本草组合物在制备用于美白、抗衰老、抗炎、保湿和/或护肤和/或具有极佳的安全性的产品中的用途。
本发明的第六方面涉及一种美容产品或化妆品，其包含复方本草组合物，所述复方本草组合物包含白及、白茯苓和藏菖蒲。
本发明的第七方面涉及一种美容方法，其包括涂抹包含白及、白茯苓和藏菖蒲的复方本草组合物。
附图说明
图1是本发明的闪式提取-酶解-絮凝-离心联用方法获得的提取物与对比实施例获得的提取物的肤感测试结果。
图2是本发明的闪式提取-酶解-絮凝-离心联用方法获得提取物与对比实施例获得的提取物的肤感测试结果。
图3是含有本发明复方本草组合物凝胶对粉刺、丘疹、脓疱个数的影响。
图4是含有本发明复方本草组合物凝胶对粉刺、丘疹、脓疱数量变化率的影响。
图5是含有本发明的复方本草组合物凝胶施用后2周或4周肌肤问题改善情况。
图6是含有本发明的复方本草组合物凝胶施用4周后的对比图。
图7是在施用含有本发明的复方本草组合物精华液1周、2周、4周、6周及7周后皮肤弹性的变化。
图8是在施用含有本发明的复方本草组合物精华液1周、2周、4周、6周及7周后皮肤紧致度的变化。
发明详述
本发明的第一方面涉及一种复方本草组合物，其包含白及、白茯苓和藏菖蒲。在一些实施方案中，本发明的复方本草组合物包含白及、白茯苓和藏菖蒲作为主要活性成分。在一些实施方案中，本发明的复方本草组合物主要由白及、白茯苓和藏菖蒲组成。在一些实施方案中，本发明的复方本草组合物由作为主要活性成分的白及、白茯苓和藏菖蒲组成。在一些实施方案中，本发明的复方本草组合物由白及、白茯苓和藏菖蒲组成。
在一些实施方案中，复方本草组合物还包含其它活性成分。进一步地，所述活性成分包括红景天、甘草、沙棘果、黄芪、芍药、姜根、积雪草和柑橘果皮。在一些实施方案中，复方本草组合物还包含美容学或药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在一些实施方案中，在本发明的复方本草组合物中，按重量百分比，白及为1～99％，白茯苓为1～99％且藏菖蒲为1～99％。在一些实施方案中，本发明的复方本草组合物中的白及、白茯苓和藏菖蒲选自下述重量百分比：1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、33.3％、33.4％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％以及任意上述重量百分比之间的范围，例如，在本发明的复方本草组合物中，按重量百分比，白及为10～70％、白茯苓为10～70％和藏菖蒲为10～70％；在本发明的复方本草组合物中，按重量百分比，白及为20～60％、白茯苓为20～60％和藏菖蒲为20～60％；在本发明的复方本草组合物中，按重量百分比，白及为20～50％、白茯苓为20～50％和藏菖蒲为20～50％；在本发明的复方本草组合物中，按重量百分比，白及为30～40％、白茯苓为30～40％和藏菖蒲为30～40％；在本发明的复方本草组合物中，按重量百分比，白及为33.3％、白茯苓为33.3％和藏菖蒲为33.4％(相当于重量份的比值为1:1:1)；在本发明的复方本草组合物中，按重量百分比，白及为60％、白茯苓为20％和藏菖蒲为20％；在本发明的复方本草组合物中，按重量百分比，白及为20％、白茯苓为60％和藏菖蒲为20％；和在本发明的复方本草组合物中，按重量百分比，白及为20％、白茯苓为20％和藏菖蒲为60％。
在一些实施方案中，本发明的复方本草组合物中的白及、白茯苓和藏菖蒲按重量份的比值为：1～99:1～99:1～99。在一些实施方案中，本发明的复方本草组合物中的白及、白茯苓和藏菖蒲按重量份的比值为1～99:1～99:1～99中任意整数或整数范围的比值。在一些实施方案中，本发明的复方本草组合物中的白及、白茯苓和藏菖蒲按重量份的比值为10～70:10～70:10～70。在一些实施方案中，本发明的复方本草组合物中的白及、白茯苓和藏菖蒲按重量份的比值为20～60:20～60:20～60。在一些实施方案中，本发明的复方本草组合物中的白及、白茯苓和藏菖蒲按重量份的比值为1～3:1～3:1～3。在一些实施方案中，本发明的复方本草组合物中的白及、白茯苓和藏菖蒲按重量份的比值为60:20:20。在一些实施方案中，本发明的复方本草组合物中的白及、白茯苓和藏菖蒲按重量份的比值为20:60:20。在一些实施方案中，本发明的复方本草组合物中的白及、白茯苓和藏菖蒲按重量份的比值为20:20:60。在一些实施方案中，本发明的复方本草组合物中的白及、白茯苓和藏菖蒲按重量份的比值为1:1:1。
本发明的第二方面涉及一种复方本草组合物的制备方法，其包括以下步骤：(1)闪式提取；(2)酶解；(3)絮凝；(4)离心。
在一些实施方案中，闪式提取步骤包括将复方药材经闪式提取器提取，转速5000-20000r/min，提取温度10～90℃，提取时间0.5～60min。在一些方案中，所述转速为5000-10000r/min或9000-10000r/min。进一步地，所述转速为9000r/min或10000r/min。进一步地，所述提取温度是10℃、25℃或90℃。在一些实施方案中，所述提取时间为0.5～50min、0.5～40min、0.5～30min、0.5～20min、0.5～10min或1～10min。进一步地，所述提取时间为1min、2min或10min。在一些实施方案中，闪式提取步骤包括以水或者0-30％乙醇为溶剂，将复方药材按照0.1％-10％的投料比例投料，闪式提取器提取，转速9000-10000r/min，提取温度10～90℃，提取时间0.5～10min。进一步地，投料比例为2％。
在一些实施方案中，酶解步骤包括在提取混合液中加入0.01％-5％的复合酶继续提取1～60min，停止提取，酶解0.1-2h。在一些实施方案中，继续提取1～10min。在一些实施方案中，酶解0.1h或2h。在一些实施方案中，酶解步骤包括闪式提取器转速调至10-500r/min，提取混合液中加入0.01％-5％的复合酶继续提取1～10min，停止提取，酶解0.1-2h，酶解温度20～60℃，pH 4.7-5.3。进一步地，所述酶解温度是20℃、50℃或60℃。在一些实施方案中，复合酶选自下述任意两种或更多种酶：纤维素酶、木瓜蛋白酶、半纤维素酶、中温α-淀粉酶、果胶酶和木聚糖酶，例如，复合酶选自：纤维素酶和木瓜蛋白酶；半纤维素酶和中温α-淀粉酶；半纤维素酶和果胶酶；或者果胶酶和木聚糖酶。在一些实施方案中，所述中温α-淀粉酶是15 000U/g和100 000U/g；木瓜蛋白酶是8000U/g。
在一些实施方案中，絮凝步骤包括在提取混合液中加入0.01％-5％的絮凝剂继续提取1～60min，停止提取，静置絮凝1-60min，絮凝温度4～60℃。在一些实施方案中，继续提取1～50min、1～40min、1～30min、1～20min、1～10min或5min。在一些实施方案中，静置絮凝1～50min、1～40min、1～30min、1～20min、1～10min或5min。在一些实施方案中，加入0.01％、0.1或5％的絮凝剂。在一些实施方案中，絮凝温度是4～50℃、4～40℃、4～30℃或25℃。在一些实施方案中，絮凝步骤包括闪式提取器转速调至10-500r/min，提取混合液中加入0.01％-5％的絮凝剂继续提取1～10min，停止提取，静置絮凝1-10min，絮凝温度4～60℃。在一些实施方案中，所述转速调制500r/min。
在一些实施方案中，离心步骤包括将提取物进样至高速转鼓离心机进行离心分离，离心转速5000-20000r/min。在一些实施方案中，离心步骤包括将提取物进样至高速转鼓离心机进行离心分离，离心转速5000-20000r/min，离心进样速率10～150L/h。在一些实施方案中，离心进样速率为30或150L/h。
在一个实施方案中，闪式提取步骤包括以水或者0-30％乙醇为溶剂，将复方药材按照0.1％-10％的投料比例投料，闪式提取器提取，转速9000-10000r/min，提取温度10～90℃，提取时间0.5～10min。
任选地，闪式提取步骤包括以水为溶剂，将复方药材按照2％的投料比例投料，闪式提取器提取，转速9000r/min，提取温度25℃，提取时间0.5min。
任选地，闪式提取步骤包括以1％乙醇为溶剂，将复方药材按照0.1％的投料比例投料，闪式提取器提取，转速10000r/min，提取温度90℃，提取时间10min。
任选地，闪式提取步骤包括以10％乙醇为溶剂，将复方药材按照5％的投料比例投料，闪式提取器提取，转速9500r/min，提取温度80℃，提取时间5min。
任选地，闪式提取步骤包括以30％乙醇为溶剂，将复方药材按照10％的投料比例投料，闪式提取器提取，转速10000r/min，提取温度70℃，提取时间8min。
任选地，闪式提取步骤包括以30％乙醇为溶剂，将复方药材按照8％的投料比例投料，闪式提取器提取，转速10000r/min，提取温度10℃，提取时间10min。
在一个实施方案中，酶解步骤包括闪式提取器转速调至10-500r/min，提取混合液中加入0.01％-5％的复合酶继续提取1-10min，停止提取，酶解0.1-2h，酶解温度20～60℃，pH 4.7-5.3。
任选地，复合酶包括纤维素酶和木瓜蛋白酶。
任选地，酶解步骤包括闪式提取器转速调至500r/min，提取混合液中加入0.01％的复合酶继续提取10min，停止提取，酶解2h，酶解温度50℃，pH 5.0。
任选地，酶解步骤包括闪式提取器转速调至200r/min，提取混合液中加入0.1％的复合酶继续提取1min，停止提取，酶解1h，酶解温度20℃，pH 4.7。
任选地，酶解步骤包括闪式提取器转速调至10r/min，提取混合液中加入10％的复合酶继续提取8min，停止提取，酶解0.1h，酶解温度60℃，pH 5.3。
在一个实施方案中，絮凝步骤包括闪式提取器转速调至10-500r/min，提取混合液中加入0.01％-5％的絮凝剂继续提取1～10min，停止提取，静置絮凝1-10min，絮凝温度4～60℃。
任选地，絮凝步骤包括闪式提取器转速调至500r/min，提取混合液中加入0.01％的絮凝剂继续提取5min，停止提取，静置絮凝5min，絮凝温度25℃。
任选地，絮凝步骤包括闪式提取器转速调至10r/min，提取混合液中加入5％的絮凝剂继续提取10min，停止提取，静置絮凝10min，絮凝温度60℃。
任选地，絮凝步骤包括闪式提取器转速调至250r/min，提取混合液中加入0.1％的絮凝剂继续提取8min，停止提取，静置絮凝1min，絮凝温度4℃。
本发明的第三方面涉及由(1)闪式提取；(2)酶解；(3)絮凝；(4)离心制备的复方本草组合物。进一步地，所述(1)闪式提取；(2)酶解；(3)絮凝；(4)离心的具体步骤如在本发明第二方面所限定的。在一些实施方案中，所述复方本草组合物包含白及、白茯苓和藏菖蒲。进一步地，所述复方本草组合物如在本发明的第一方面所限定。
本发明的第四方面涉及用于美白、抗衰老、抗炎、保湿和/或护肤和/或具有极佳的安全性的复方本草组合物。进一步地，所述安全性是指不具有潜在的光毒性。在一些实施方案中，抗衰老包括去皱且护肤包括防止胶原蛋白流失，使皮肤致密紧实。在一些实施方案中，护肤还包括抑制粉刺、炎性丘疹和脓疱。在一些实施方案中，护肤包括祛痘。在一些实施方案中，所述复方本草组合物如在本发明的第一方面所限定的。在一些实施方案中，所述复方本草组合物是如在本发明的第三方面所限定的制备方法获得的复方本草组合物。
本发明的第五方面涉及复方本草组合物在制备用于美白、抗衰老、抗炎、保湿和/或护肤和/或具有极佳的安全性的产品中的用途。进一步地，所述安全性是指不具有潜在的光毒性。在一些实施方案中，抗衰老包括去皱且护肤包括防止胶原蛋白流失，使皮肤致密紧实。在一些实施方案中，护肤还包括抑制粉刺、炎性丘疹和脓疱。在一些实施方案中，护肤包括祛痘。在一些实施方案中，所述复方本草组合物如在本发明的第一方面所限定的。在一些实施方案中，所述复方本草组合物是如在本发明的第三方面所限定的制备方法获得的复方本草组合物。在一些实施方案中，所述产品是美容产品或化妆品。
本发明的第六方面涉及一种美容产品或化妆品，其包含复方本草组合物，所述复方本草组合物包含白及、白茯苓和藏菖蒲。在一些实施方案中，本发明涉及一种美容产品或化妆品，所述美容产品或化妆品包含复方本草组合物，所述复方本草组合物由白及、白茯苓和藏菖蒲组成。在一些实施方案中，所述美容产品或化妆品除了本发明的复方本草组合物之外，还包含其它活性成分。进一步地，所述活性成分包括红景天提取物、芍药提取物、甘油、丁二醇、氢化磷脂、辛酸/癸酸甘油三脂、植物甾醇油酸酯、丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物、PEG-40硬脂酸酯、辛甘醇和水。在一些实施方案中，所述美容产品或化妆品包含(按重量百分比计)本发明的复方本草组合物(10-90％)、红景天提取物(0.1-5％)、芍药提取物(0.1-5％)、甘油(1-5％)、丁二醇(0.2-5％)、氢化磷脂(0.05-1％)、辛酸/癸酸甘油三脂(0.5-2％)、植物甾醇油酸酯(0.5-2％)、丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物(0.2-3％)、PEG-40硬脂酸酯(0.5-2％)、辛甘醇(0.1-1％)和水(适量到100％)。在一些实施方案中，本发明涉及一种美容产品或化妆品，所述美容产品或化妆品包含所述复方本草组合物以及美容学或药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一些实施方案中，本发明涉及一种美容产品或化妆品，所述美容产品或化妆品还包含其它活性成分。所述其它活性成分。进一步地，所述活性成分包括红景天、甘草、沙棘果、黄芪、芍药、姜根、积雪草和柑橘果皮。在一些实施方案中，所述美容产品或化妆品是凝胶或精华液。
本发明的第七方面涉及一种美容方法，其包括涂抹包含白及、白茯苓和藏菖蒲的复方本草组合物。在一些实施方案中，本发明涉及一种美容方法，其包括涂抹包含所述复方本草组合物的美容产品或化妆品。在一些实施方案中，，所述复方本草组合物如在本发明的第一方面所限定的。在一些实施方案中，所述复方本草组合物是如在本发明的第三方面所限定的制备方法获得的复方本草组合物。在一些实施方案中，所述美容产品或化妆品如在本发明的第路方面所限定的。
本发明的有益效果如下：
1、本发明提供一种新的复方本草组合物，其包含白及、白茯苓和藏菖蒲，所述复方本草组合物在美白、抗衰老、抗炎、保湿、护肤以及安全性等方面带来了预料不到的效果或协同作用。在三种中药的组合下，能产生显著的协同作用，相同生药浓度(生药浓度＝药材质量/最终提取物质量×100％)下，其功效增强50％以上。
2、闪式提取-酶解-絮凝-离心联用方法为本申请发明人首创。药材破碎程度和酶解程度影响复方的整体成分的提取效率，而且药材破碎程度和酶解程度影响后续药材残渣细碎颗粒的有效除杂。本发明的方法能够提高复方的有效成分提取效率并提高药材残渣的除去效率，整体上提高有效成分含量，减少提取物杂质，最终提高护肤应用的功效。
3、与最常规的水提醇沉法比较，通过本发明的闪式提取-酶解-絮凝联用提取技术得到的提取物的方法的提取率高20％，提取时间由两天(48h)缩短至4h；提取物相关护肤功效测定结果相对于常规水提醇沉法提取所获得的测定结果而言，在美白、抗衰老、抗炎、保湿、护肤方面功效提升10％-30％不等。在同样的生药浓度条件下，本发明设计的闪式提取-酶解-絮凝-离心联用技术制备的提取物在肤感测试方面具有更优异的表现。
具体实施方式
本发明可通过以下实施方案进行实施，但本发明并不限于此。
本发明实施方案中涉及的百分比如无明确指示均为重量比。
本发明实施方案中采用的仪器设备均为本领域常规仪器设备并可采用符合相应标准的仪器设备替代。
本发明实施方案中采用的试剂如无明确指示均为市售分析纯试剂。
本发明所提及的原材料及仪器设备均为本领域常用原材料及仪器设备，仅为示例，并不旨在限定本发明的保护范围。本领域技术人员可以基于本发明的公开的内容选取等效的原材料及相关仪器设备。
实施例
一、本发明复方本草组合的制备
实验材料及其来源：
白及、白茯苓、藏菖蒲购于安徽亳州药材市场。
复合酶选自下述两种或更多种：纤维素酶，果胶酶，半纤维素酶，木聚糖酶，中温α-淀粉酶15 000U/g和100 000U/g；木瓜蛋白酶，8000U/g(河南喜来客化工产品有限公司)。
水：去离子水。
絮凝剂：ZTC101果汁澄清剂，武汉正天成生物科技有限公司。
壳聚糖，山东奥康生物科技有限公司。
提取设备：JHBE-50V闪式提取器，JHBE-200SC型闪式提取器，河南智晶生物科技股份有限公司。
离心机：GQ105B立式高速转鼓离心机，上海天本离心机有限公司。卧螺式离心机，广州富一液体分离技术有限公司。
实施例1-闪式提取-酶解-絮凝-离心联用方法提取复方本草提取物
在闪式提取器中加入50kg水为溶剂，将白及、白茯苓和藏菖蒲(按照33.3％：33.3％：33.4％的重量百分比)以2％投料比例投料1kg，闪式提取器提取，转速9000r/min，提取温度90℃，提取时间1min。冷却至室温，闪式提取器转速调至500r/min,提取混合液中加入0.01％的复合酶(纤维素酶与木瓜蛋白酶)继续提取10min，停止提取，酶解2h，pH＝4.7，酶解温度20℃.酶解完毕后，开启闪式提取器转速调至500r/min，提取混合液中加入0.01％的ZTC101絮凝剂继续提取5min，停止提取，静置絮凝5min，絮凝温度25℃。放出提取物后进入高速转鼓离心机进行离心分离，离心转速20000r/min，离心进样速率30L/h，即得。
实施例2-闪式提取-酶解-絮凝-离心联用方法提取复方本草提取物
在闪式提取器中加入50kg水为溶剂，将白及、白茯苓和藏菖蒲(按照33.3％：33.3％：33.4％的重量百分比)以2％投料比例投料1kg，闪式提取器提取，转速9000r/min，提取温度25℃，提取时间2min。闪式提取器转速调至500r/min，提取混合液中加入1％的复合酶(纤维素酶和木瓜蛋白酶)继续提取10min，停止提取，酶解2h，pH＝5.0，酶解温度50℃。酶解完毕后，开启闪式提取器转速调至500r/min，提取混合液中加入0.1％的絮凝剂继续提取5min，停止提取，静置絮凝5min，絮凝温度25℃。放出提取物后进入高速转鼓离心机进行离心分离，离心转速10000r/min，离心进样速率30L/h，即得。
实施例3-闪式提取-酶解-絮凝-离心联用方法提取复方本草提取物
在闪式提取器中加入50kg水为溶剂，将白及、白茯苓和藏菖蒲(按照33.3％：33.3％：33.4％的重量百分比)以2％投料比例投料1kg，闪式提取器提取，转速10000r/min，提取温度10℃，提取时间10min。闪式提取器转速调至500r/min,提取混合液中加入5％的半纤维素酶和中温α-淀粉酶复合酶继续提取10min，停止提取，酶解0.1h，pH＝5.3，酶解温度60℃。酶解完毕后，开启闪式提取器转速调至500r/min，提取混合液中加入5％的壳多糖絮凝剂继续提取5min，停止提取，静置絮凝5min，絮凝温度25℃。放出提取物后进入卧螺式离心机进行离心分离，离心转速5000r/min，离心进样速率150L/h，即得。
实施例4-闪式提取-酶解-絮凝-离心联用方法提取复方本草提取物(组方配比变化及不同酶制剂)
在闪式提取器中加入50kg水为溶剂，按照重量百分比将白及(60％)、白茯苓(20％)和藏菖蒲(20％)以2％投料比例投料1kg。除了2.5％复合酶为半纤维素酶和果胶酶，随后步骤与实施例2相同。
实施例5-闪式提取-酶解-絮凝-离心联用方法提取复方本草提取物(组方配比变化及不同酶制剂)
在闪式提取器中加入50kg水为溶剂，按照重量百分比将白及(20％)、白茯苓(60％)和藏菖蒲(20％)以2％投料比例投料1kg。除了0.05％复合酶为木聚糖酶和果胶酶，随后步骤与实施例2相同。
实施例6-闪式提取-酶解-絮凝-离心联用方法提取复方本草提取物(组方配比变化及不同酶制剂)
在闪式提取器中加入50kg水为溶剂，按照重量百分比将白及(20％)、白茯苓(20％)和藏菖蒲(60％)以2％投料比例投料1kg。除了5％复合酶为木聚糖酶和果胶酶，随后步骤与实施例2相同。
实施例7–含有本发明的复方本草组合物的精华液
本发明实施例2的复方本草组合物80％(重量百分比，下同)
Figure BDA0002535450710000141
对比实施例1-传统水提醇沉提取复方白及提取物(传统常用工艺)
水提醇沉工艺：提取罐中加入50kg水为溶剂，将白及、白茯苓和藏菖蒲药材饮片(按照33.33％:33.33％:33.34％的重量百分比)以2％投料比例投料1.0kg，加热搅拌提取，提取温度85℃，提取时间2h。停止提取，板框过滤0.45μm膜过滤，滤液加乙醇至80％进行醇沉，醇沉时间12h，板框过滤收集沉淀加水复溶配制成提取物，板框过滤，即得。
对比实施例2-酶解-絮凝-离心联用方法提取复方白及提取物(联用法缺少闪式提取步骤以加热提取代替)
酶解-絮凝-离心联用工艺：在提取罐中加入50kg水为溶剂，将白及、白茯苓和藏菖蒲药材饮片(按照33.33％:33.33％:33.34％的重量百分比)以2％投料比例投料1.0kg，提取温度85℃，提取时间2h。停止提取，降至室温后，提取混合液中加入1％的复合酶(纤维素酶和木瓜蛋白酶)继续提取10min，停止提取，酶解2h，酶解温度50℃。酶解完毕后，开启提取罐搅拌转速调至500r/min，提取混合液中加入0.01％的絮凝剂继续提取5min，停止提取，静置絮凝5min，絮凝温度25℃。放出提取物后进入高速转鼓离心机进行离心分离，离心转速10000r/min，离心进样速率30L/h，即得。
对比实施例3-闪式提取-絮凝-离心联用方法提取复方白及提取物(联用法缺少酶解步骤)
闪式提取-絮凝-离心联用工艺：在闪式提取器中加入50kg水为溶剂，将白及、白茯苓和藏菖蒲药材饮片(按照33.33％:33.33％:33.34％的重量百分比)以2％投料比例投料1.0kg，闪式提取器提取，转速9000r/min，提取温度25℃，提取时间1min。闪式提取器转速调至500r/min，提取混合液中加入0.01％的絮凝剂继续提取5min，停止提取，静置絮凝5min，絮凝温度25℃。放出提取物后进入高速转鼓离心机进行离心分离，离心转速10000r/min，离心进样速率30L/h，即得。
对比实施例4-闪式提取-酶解-离心联用方法提取复方白及提取物(联用法缺少絮凝步骤)
闪式提取-酶解-离心联用工艺：在闪式提取器中加入50kg水为溶剂，将白及、白茯苓和藏菖蒲药材饮片(按照33.33％:33.33％:33.34％的重量百分比)以2％投料比例投料1.0kg，闪式提取器提取，转速9000r/min，提取温度25℃，提取时间1min。闪式提取器转速调至500r/min，提取混合液中加入1％的复合酶(纤维素酶和木瓜蛋白酶)继续提取10min，停止提取，酶解2h，酶解温度50℃。酶解完毕后。放出提取物后进入高速转鼓离心机进行离心分离，离心转速10000r/min，离心进样速率30L/h，即得。
对比实施例5-闪式提取-酶解-絮凝法提取复方白及提取物(联用法缺少离心步骤)
闪式提取-酶解-絮凝联用工艺：在闪式提取器中加入50kg水为溶剂，将白及、白茯苓和藏菖蒲药材饮片(按照33.33％:33.33％:33.34％的重量百分比)以2％投料比例投料1.0kg，闪式提取器提取，转速9000r/min，提取温度25℃，提取时间1min。闪式提取器转速调至500r/min，提取混合液中加入1％的复合酶(纤维素酶和木瓜蛋白酶)继续提取10min，停止提取，酶解2h，pH＝5.0，酶解温度50℃。酶解完毕后，开启闪式提取器转速调至500r/min，提取混合液中加入0.01％的絮凝剂继续提取5min，停止提取，静置絮凝5min，絮凝温度25℃。静置24h，取上清液过滤，即得。
对比实施例6-闪式提取-酶解-絮凝-离心联用方法提取白及提取物
闪式提取-酶解-离心联用工艺：在闪式提取器中加入50kg水为溶剂，白及药材饮片按照2％投料比例投料1.0kg，闪式提取器提取，转速9000r/min，提取温度25℃，提取时间1min。闪式提取器转速调至500r/min，提取混合液中加入1％的复合酶(纤维素酶和木瓜蛋白酶)继续提取10min，停止提取，酶解2h，pH＝5.0，酶解温度50℃。酶解完毕后，开启闪式提取器转速调至500r/min，提取混合液中加入0.01％的絮凝剂继续提取5min，停止提取，静置絮凝5min，絮凝温度25℃。放出提取物后进入高速转鼓离心机进行离心分离，离心转速10000r/min，离心进样速率30L/h，即得。
对比实施例7-闪式提取-酶解-絮凝-离心联用方法提取白茯苓提取物
闪式提取-酶解-絮凝-离心联用工艺：在闪式提取器中加入50kg水为溶剂，白茯苓药材饮片按照2％投料比例投料1.0kg，闪式提取器提取，转速9000r/min，提取温度25℃，提取时间1min。闪式提取器转速调至500r/min，提取混合液中加入1％的复合酶(纤维素酶和木瓜蛋白酶)继续提取10min，停止提取，酶解2h，pH＝5.0，酶解温度50℃。酶解完毕后，开启闪式提取器转速调至500r/min，提取混合液中加入0.01％的絮凝剂继续提取5min，停止提取，静置絮凝5min，絮凝温度25℃。放出提取物后进入高速转鼓离心机进行离心分离，离心转速10000r/min，离心进样速率30L/h，即得。
对比实施例8-闪式提取-酶解-絮凝-离心联用方法提取藏菖蒲提取物
闪式提取-酶解-絮凝-离心联用工艺：在闪式提取器中加入50kg水为溶剂，藏菖蒲药材饮片按照2％投料比例投料1.0kg，闪式提取器提取，转速9000r/min，提取温度25℃，提取时间1min。闪式提取器转速调至500r/min，提取混合液中加入1％的复合酶(纤维素酶和木瓜蛋白酶)继续提取10min，停止提取，酶解2h，pH＝5.0，酶解温度50℃。酶解完毕后，开启闪式提取器转速调至500r/min，提取混合液中加入0.01％的絮凝剂继续提取5min，停止提取，静置絮凝5min，絮凝温度25℃。放出提取物后进入高速转鼓离心机进行离心分离，离心转速10000r/min，离心进样速率30L/h，即得。
对比实施例9-闪式提取-酶解-絮凝-离心联用方法提取白及和白茯苓提取物
闪式提取-酶解-絮凝-离心联用工艺：闪式提取器中加入50kg水为溶剂，白及和白茯苓药材饮片(按照50％:50％的重量百分比)以2％投料比例投料1.0kg，闪式提取器提取，转速9000r/min，提取温度25℃，提取时间1min。闪式提取器转速调至500r/min，提取混合液中加入1％的复合酶(纤维素酶和木瓜蛋白酶)继续提取10min，停止提取，酶解2h，pH＝5.0，酶解温度50℃。酶解完毕后，开启闪式提取器转速调至500r/min，提取混合液中加入0.01％的絮凝剂继续提取5min，停止提取，静置絮凝5min，絮凝温度25℃。放出提取物后进入高速转鼓离心机进行离心分离，离心转速10000r/min，离心进样速率30L/h，即得。
对比实施例10-闪式提取-酶解-絮凝-离心联用方法提取白及和藏菖蒲提取物
闪式提取-酶解-絮凝-离心联用工艺：在闪式提取器中加入50kg水为溶剂，白及、藏菖蒲药材饮片(按照50％:50％的重量百分比)以2％投料比例投料1.0kg，闪式提取器提取，转速9000r/min，提取温度25℃，提取时间1min。闪式提取器转速调至500r/min，提取混合液中加入1％的复合酶(纤维素酶和木瓜蛋白酶)继续提取10min，停止提取，酶解2h，pH＝5.0，酶解温度50℃。酶解完毕后，开启闪式提取器转速调至500r/min，提取混合液中加入0.01％的絮凝剂继续提取5min，停止提取，静置絮凝5min，絮凝温度25℃。放出提取物后进入高速转鼓离心机进行离心分离，离心转速10000r/min，离心进样速率30L/h，即得。
对比实施例11-闪式提取-酶解-絮凝-离心联用方法提取白茯苓和藏菖蒲提取物
闪式提取-酶解-絮凝-离心联用工艺：闪式提取器中加入50kg水为溶剂，白茯苓、藏菖蒲药材饮片(按照50％:50％的重量百分比)以2％投料比例投料1.0kg，闪式提取器提取，转速9000r/min，提取温度25℃，提取时间1min。闪式提取器转速调至500r/min，提取混合液中加入1％的复合酶(纤维素酶和木瓜蛋白酶)继续提取10min，停止提取，酶解2h，pH＝5.0，酶解温度50℃。酶解完毕后，开启闪式提取器转速调至500r/min，提取混合液中加入0.01％的絮凝剂继续提取5min，停止提取，静置絮凝5min，絮凝温度25℃。放出提取物后进入高速转鼓离心机进行离心分离，离心转速10000r/min，离心进样速率30L/h，即得。
对比实施例12-闪式提取-酶解-絮凝-离心联用方法提取白芷组方提取物
在闪式提取器中加入50kg水为溶剂，将白及、白茯苓和白芷(按照33.3％：33.3％：33.4％的重量百分比)以2％投料比例投料1kg，闪式提取器提取，转速9000r/min，提取温度25℃，提取时间2min。闪式提取器转速调至500r/min，提取混合液中加入1％的复合酶(纤维素酶和木瓜蛋白酶)继续提取10min，停止提取，酶解2h，pH＝5.0，酶解温度50℃。酶解完毕后，开启闪式提取器转速调至500r/min，提取混合液中加入0.1％的絮凝剂继续提取5min，停止提取，静置絮凝5min，絮凝温度25℃。放出提取物后进入高速转鼓离心机进行离心分离，离心转速10000r/min，离心进样速率30L/h，即得。
由下表1-3可知，本发明的闪式提取-酶解-絮凝-离心联用方法相对于同样提取白及、白茯苓和藏菖蒲药材饮片的对比例实施例1-5，实验时间显著更短、不溶性固体含量低且提取物中多糖含量高。本发明的白及、白茯苓和藏菖蒲药材饮片的闪式提取-酶解-絮凝-离心联用方法相对于同样使用闪式提取-酶解-絮凝-离心联用方法的对比实施例6-11而言，优势和差别在于：在肤感测试对比实验中，实施例2的复方组合物的肤感喜好度以及护肤功效均较单用药材或者缺少某一味药材的(对比实施例6-11)美白、保湿、抗衰老测试效果好(请参见表4-10)。
表1闪式提取-酶解-絮凝-离心联用方法验证
Figure BDA0002535450710000191
注＊：工艺不可行一般会出现提取物固含量高粘度太大，过滤不动，无法进行；最终提取物不澄清浑浊(不溶性固体含量大于0.01％)，多糖成分提取不充分。
表2闪式提取-酶解-絮凝-离心联用与传统及其它方法比较验证
Figure BDA0002535450710000201
表3本发明工艺作用对象所涉及的复方草药配伍性验证
Figure BDA0002535450710000202
Figure BDA0002535450710000211
二、肤感测试对比实验
1、提取物肤感测试的实验方法
配方肤感专家组10人，在即时涂抹后和干燥后，从丝滑感、涂抹吸收感、铺展性、粘稠度感、涂抹干燥后的光滑感以及肤感喜好度6个维度，进行肤感感观测评打分，满分10分(表4和表5前5列)。然后根据肤感差异肤感专家进行总体喜好度评分。其中，不喜欢0，一般1，喜欢2，很喜欢3，非常喜欢4，计算总体平均值±标准差表4，和表5第6列。肤感感受1-10的评分数据说明肤感专家对各个实施例样品的几个维度肤感主观感受有差异，能感受到样品的肤感差别，其中涂抹丝滑感较容易感受出差别，铺展性比较不容易感受差别。在此基础上，肤感专家按照0-4的喜好度值打分评价。肤感喜好度均分为各专家打分的均值±标准差。明显喜好度百分比＝(打3分的专家人数+打4分的专家人数)/10＊100％2、实验结果
由表4可知，本发明的复方本草组合物相对于非闪式提取-酶解-絮凝-离心联用方法获得的本草组合物而言，在肤感喜好度方面具有显著差异。
表4
Figure BDA0002535450710000212
由表5可知，本发明的复方本草组合物相对于单药或任意两两组合的本草组合物而言，在肤感喜好度方面具有显著差异。
表5
Figure BDA0002535450710000221
三、功效对比实验
1、本申请的复方本草组合物对B16黑素细胞分泌的黑色素含量的影响
1.1、实验试剂与材料
细胞：小鼠B16黑色素瘤细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心
DMSO：Sigma
DMEM培养液：Sigma
阳性对照药：Sym
Figure BDA0002535450710000222
377(0.01％)
1.2、实验仪器与设备
超净工作台：Heal Force
细胞培养箱150i：Thermo HERH Cell
超纯水过滤仪：Millipore
DK-8D电热恒温水槽：上海精宏实验设备
低温高速离心机、PCR扩增仪、移液器和涡旋振荡仪：Eppendorf
-80℃低温冰箱、NanoDrop 2000分光光度计：Thermo Fisher
分析天平FA2104N：上海菁海仪器
1.3、实施例
实施例2(闪式提取-酶解-絮凝-离心联用方法得到复方白及提取物)(0.5％、1％、2％，按体积百分比计，下同)
对比实施例6(闪式提取-酶解-絮凝-离心联用方法得到白及提取物)(0.5％、1％、2％)
对比实施例7(闪式提取-酶解-絮凝-离心联用方法得到白茯苓提取物)(0.5％、1％、2％)
对比实施例8(闪式提取-酶解-絮凝-离心联用方法得到藏菖蒲提取物)(0.5％、1％、2％)
对比实施例9(闪式提取-酶解-絮凝-离心联用方法得到白及、白茯苓提取物)(0.5％、1％、2％)
对比实施例10(闪式提取-酶解-絮凝-离心联用方法得到白及、藏菖蒲提取物)(0.5％、1％、2％)
对比实施例11(闪式提取-酶解-絮凝-离心联用方法得到白茯苓、藏菖蒲提取物)(0.5％、1％、2％)
1.4、实验方法
培养的小鼠B16黑色素瘤细胞，胰酶消化细胞，接种于48孔板，每孔450μL，培养24h，待细胞完全贴壁，加入测试药物，继续培养24h，显微镜下观察细胞黑色素生成情况；吸去培养液，用DMSO和NaOH混合液(1mol/L NaOH为稀释液，加DMSO，稀释DMSO终浓度为10％)溶解细胞，烘箱孵育，待细胞黑色素溶解，转移到96孔板，405nm检测吸光度A，检测细胞内黑色素含量的变化。Sym
Figure BDA0002535450710000231
377作为抑制黑色素阳性对照。
实验分组包括：
A：对照组：不加待测物，待测物体积用PBS缓冲溶液代替
B：实验组：不同浓度待测物，用PBS缓冲溶液配制
B16细胞黑色素相对含量％计算公式如下：含量％＝B/A×100％
统计学分析：
实验数据以平均值±标准差
Figure BDA0002535450710000232
表示，两平均值的比较用SPSS 16.0统计软件中单因素ANOVA分析，P<0.05表示差异有统计学意义。
1.5、实验结果
结果表明，本发明的复方本草组合物在0.5mg/mL浓度下对B16细胞的黑色素产生具有明显的抑制作用(其它浓度未示出，P<0.05＊具有显著性差异，P<0.01＊＊具有极显著差异)。复方本草组合物对B16细胞的黑色素产生的抑制作用显著强于单药或者任意两两组合的本草组合物(请参见表6)。考虑到B16黑色素的相对含量降低代表活性物具有美白作用，因此本发明的复方本草组合物相对于单药或者任意两两组合的本草组合物而言具有显著的美白作用。
表6各组对B16黑素细胞分泌的黑色素含量的影响
浓度 Ave SD(±) 与对照组比 与实施例2组比
对照 / 100％ 0.0832 / P<0.01**
Sym377 0.01％ 65.5％ 0.0264 P<0.01** P<0.01**
实施例2 0.5％ 73.3％ 0.0098 P<0.01** /
对比实施例6 0.5％ 87.8％ 0.0189 P<0.05* P<0.01**
对比实施例7 0.5％ 99.7％ 0.0622 P>0.05 P<0.01**
对比实施例8 0.5％ 87.4％ 0.0746 P>0.05 P<0.01**
对比实施例9 0.5％ 85.3％ 0.0287 P<0.05* P<0.01**
对比实施例10 0.5％ 88.1％ 0.0301 P<0.05* P<0.01**
对比实施例11 0.5％ 89.7％ 0.0623 P>0.05 P<0.01**
2、本发明的复方本草组合物对1079SK细胞COL1A1和SMC4基因的影响
2.1、实验试剂与材料
细胞：1079SK细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心
Trizol试剂：(Sigma,Cat.T9424)
其余同1.1
2.2、实验仪器与设备
同1.2
2.3、实施例
同1.3
2.4、实验方法
1079SK细胞接种于12孔板，每孔加DMEM培养液450μL，培养24h，待细胞完全贴壁，加入PBS配制测试药物，继续培养24h后，利用Trizol试剂提取总RNA，质控和调整RNA浓度，RT-PCR反转录为cDNA，RT-qPCR TapMan Probe检测SMC4和COL1A1基因相对表达量，2-ΔΔCT法计算基因相对表达量。
实验分组包括
A：对照组：不加待测物，待测物体积用PBS缓冲溶液代替
B：实验组：不同浓度待测物，用PBS缓冲溶液配制
统计学计算方法同1.4。
2.5、实验结果
胶原蛋白是构成皮肤结缔组织的主要成份，不仅是肌肤真皮层中支撑皮肤构架的主要“黏合剂”与弹力纤维一起合力构成网状的支撑体,仿佛撑起皮肤组织的钢筋架构一样。人体一旦缺少胶原蛋白就会导致皱纹横生、毛孔变粗、皮肤暗沉、长色斑、皮肤干燥脱皮等皮肤问题。通过调控COL1A1的表达可以影响胶原蛋白合成，从而达到抗衰老作用。
本实验结果表明，本发明的复方本草组合物在0.5mg/mL浓度下对COL1A1的表达具有明显的促进作用(其它浓度未示出，P<0.05*具有显著性差异，P<0.01*＊具有极显著差异)。本发明的复方本草组合物对COL1A1表达的促进作用显著强于单药或者任意两两组合的本草组合物(请参见表7)。考虑到COL1A1基因表达上调代表活性物具有抗衰老作用，因此本发明的复方本草组合物相对于单药或者任意两两组合的本草组合物而言具有显著的抗衰老作用。根据该实验结果，可以预期该本草组合物添加到产品中可以减少胶原蛋白流失，增加皮肤弹性，延缓皮肤衰老。
表7各组对COL1A1基因表达的影响
Figure BDA0002535450710000251
Figure BDA0002535450710000261
果还表明，本发明的复方本草组合物在0.5mg/mL浓度下对SMC4的表达具有明显的促进作用。本发明的复方本草组合物对SMC4表达的促进作用显著强于单药或者任意两两组合的本草组合物(请参见表8)。考虑到SMC4基因表达上调代表活性物具有一定程度的抗衰老作用，因此本发明的复方本草组合物相对于单药或者任意两两组合的本草组合物而言具有显著的抗衰老作用。
表8各组对SMC4基因表达的影响
浓度 Ave SD(±) 与对照组比 与实施例2组比
对照 / 1.00 0.0750 / P<0.05*
TGF-β 5ng/mL 1.40 0.0504 P<0.001*** P<0.001***
实施例2 0.5％ 1.12 0.0374 P<0.05* /
对比实施例6 0.5％ 0.99 0.0275 P>0.05 P<0.001***
对比实施例7 0.5％ 1.08 0.0314 P>0.05 P<0.05*
对比实施例8 0.5％ 1.04 0.0133 P>0.05 P<0.01**
对比实施例9 0.5％ 1.02 0.0217 P>0.05 P<0.01**
对比实施例10 0.5％ 1.09 0.0150 P>0.05 P<0.05*
对比实施例11 0.5％ 1.04 0.0359 P>0.05 P<0.01**
3、本发明的复方本草组合物对HaCat细胞AQP3和FLG基因表达的影响
3.1、实验试剂与材料
细胞：HaCat细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心
其余同1.1
3.2、实验仪器与设备
同1.2
3.3、实施例
同1.3
3.4、实验方法
HaCat细胞接种于12孔板，每孔加DMEM培养液450μL，培养24h，待细胞完全贴壁，加入PBS配制测试药物，继续培养24h后，利用试剂盒或Trizol试剂提取总RNA，质控和调整RNA浓度，RT-PCR反转录为cDNA，RT-qPCR TapMan Probe检测AQP3和FLG基因相对表达量，2-ΔΔCT法计算基因相对表达量。
实验分组包括：
A：对照组：不加待测物，待测物体积用PBS缓冲溶液代替
B：实验组：不同浓度待测物，用PBS缓冲溶液配制
统计学计算方法同1.4。
3.5、实验结果
结果表明，本发明的复方本草组合物在0.5mg/mL浓度下对AQP3的表达具有显著的促进作用(其它浓度未示出，P<0.05＊具有显著性差异，P<0.001＊＊＊具有极显著差异)。本发明的复方本草组合物对AQP3表达的促进作用显著强于单药或者任意两两组合的本草组合物(请参考表9)。考虑到AQP3基因表达上调代表活性物具有保湿作用，因此本发明的复方本草组合物相对于单药或者任意两两组合的本草组合物而言具有显著的保湿作用。
表9各组对AQP3基因表达的影响
浓度 Ave SD(±) 与对照组比 与实施例2组比
对照 / 1.02 0.0221 / P<0.001***
实施例2 0.5％ 1.19 0.0137 P<0.001*** /
对比实施例6 0.5％ 1.04 0.0452 P>0.05 P<0.001***
对比实施例7 0.5％ 1.02 0.0413 P>0.05 P<0.001***
对比实施例8 0.5％ 1.01 0.0193 P>0.05 P<0.001***
对比实施例9 0.5％ 1.02 0.0406 P>0.05 P<0.001***
对比实施例10 0.5％ 1.03 0.0146 P>0.05 P<0.001***
对比实施例11 0.5％ 1.03 0.0146 P>0.05 P<0.001***
结果还表明，本发明的复方本草组合物在2mg/mL浓度下对FLG的表达具有显著的促进作用(其它浓度未示出，P<0.05＊具有显著性差异，P<0.001＊＊＊具有极显著差异)。本发明的复方本草组合物对FLG表达的促进作用显著强于单药或者任意两两组合的本草组合物(请参考表10)。考虑到FLG基因表达上调代表活性物具有一定程度的保湿作用，因此本发明的复方本草组合物相对于单药或者任意两两组合的本草组合物而言具有显著的保湿作用。
表10各组对FLG基因表达的影响
浓度 Ave SD(±) 与对照组比 与实施例2组比
对照 / 1.07 0.0482 / /
实施例2 2％ 1.75 0.0154 P<0.001*** /
对比实施例6 2％ 1.12 0.0167 P>0.05 P<0.001***
对比实施例7 2％ 1.11 0.0144 P>0.05 P<0.001***
对比实施例8 2％ 1.14 0.0133 P<0.05* P<0.001***
对比实施例9 2％ 1.07 0.0150 P>0.05 P<0.001***
对比实施例10 2％ 1.09 0.0193 P>0.05 P<0.001***
对比实施例11 2％ 1.09 0.0214 P>0.05 P<0.001***
4、本发明的复方本草组合物对3D皮肤真皮层中COL1A1基因表达的影响
4.1、实验试剂与材料
细胞：人成纤维细胞及角质细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心
DMSO：Sigma
DMEM培养液：Sigma
4.2、实验仪器与设备
同1.2
4.3、实施例
同1.3
4.4、实验方法
体外利用人成纤维细胞和角质形成细胞构建具有真皮层和表皮层的3D皮肤，待表皮层分化为基底层、棘层、颗粒层和角质层时，即可将对照组和样品组加到皮肤表层，进行为期24h的培养。对真皮层中的COL1A1基因表达进行测定。
4.5、实验结果
胶原蛋白是构成皮肤结缔组织的主要成份，不仅是肌肤真皮层中支撑皮肤构架的主要“黏合剂”,与弹力纤维一起合力构成网状的支撑体,仿佛撑起皮肤组织的钢筋架构一样。人体一旦缺少胶原蛋白就会导致皱纹横生、毛孔变粗、皮肤暗沉、长色斑、皮肤干燥脱皮等皮肤问题。通过调控COL1A1的表达可以影响胶原蛋白合成，从而达到一定程度的抗衰老作用。
结果表明，本发明的复方本草组合物在2mg/mL浓度下对COL1A1的表达具有显著的促进作用(其它浓度未示出，P<0.001＊＊＊具有极显著差异)。本发明的复方本草组合物对COL1A1表达的促进作用显著强于单药或者任意两两组合的本草组合物(请参考表11)。考虑到COL1A1基因表达上调代表活性物具有一定程度的抗衰老作用，因此本发明的复方本草组合物相对于单药或者任意两两组合的本草组合物而言具有显著的抗衰老作用。添加到产品中可以减少胶原蛋白流失，增加皮肤弹性，延缓皮肤衰老。
统计学计算方法同1.4。
表11各组对COL1A1基因表达的影响(T检验)
浓度 Ave SD(±) 与对照组比 与实施例2组比
对照 / 1.02 0.0270 / /
TGF-β 5ng/mL 1.24 0.0239 P<0.001*** /
实施例2 2％ 1.24 0.0342 P<0.001*** /
对比实施例6 2％ 1.06 0.0519 P>0.05 P<0.001***
对比实施例7 2％ 1.04 0.0311 P>0.05 P<0.001***
对比实施例8 2％ 1.02 0.0355 P>0.05 P<0.001***
对比实施例9 2％ 1.03 0.0142 P>0.05 P<0.001***
对比实施例10 2％ 1.04 0.0209 P>0.05 P<0.001***
对比实施例11 2％ 1.06 0.0186 P>0.05 P<0.001***
5、本发明的复方本草组合物对炎症因子NF-κB的表达的影响
5.1、实验试剂与材料
细胞：H-HaCat细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心
阳性对照药：EGCG(50μM/L)(Sigma,Cat.E4143)
造模药：TNF-α(10ng/mL)(Sigma,Cat.H8916)
其余同1.1
5.2、实验仪器与设备
同1.2
5.3、实施例
同1.3
5.4、实验方法
自培养箱取出培养的H-HaCat细胞，经消化离心，制成细胞悬液，调整细胞密度为1×105个/ml至5×105个/ml，种96孔板，继续培养12-24h。培养完毕后向孔板中加入预先配好的各个浓度样品、EGCG、PBS，继续培养12-24h后，向孔板中每孔加入TNF-α。继续培养12-24h，培养完毕后向孔板中每孔加入裂解液每孔100μL，取出荧光素酶检测试剂盒(PromegaCat.E4030，内包含裂解液)，按试剂盒说明书进行余下操作后，放入荧光酶标仪Lum模式读值。
统计学计算方法同1.4。
5.5、实验结果
结果表明，本发明的复方本草组合物在2mg/mL浓度下对NF-κB的表达具有显著的抑制作用(其它浓度未示出，P<0.001＊＊＊具有极显著差异)。本发明的复方本草组合物对NF-κB表达的抑制作用显著强于单药或者任意两两组合的本草组合物(请参考表11)。考虑到NF-κB基因表达下调代表活性物具有一定程度的抗炎作用，因此本发明的复方本草组合物相对于单药或者任意两两组合的本草组合物而言具有显著的抗炎作用。
表11各组对NF-κB表达的影响
Ave SD(±) 与TNF-α组比 与EGCG组比 与实施例2组比
对照 / 1.00 0.0157 / /
TNF-α 10ng/mL 4.17 0.0596 / /
EGCG 50μM/mL 2.67 0.0596 P<0.001*** /
实施例2 2％ 2.67 0.0196 P<0.001*** P>0.05 /
对比实施例6 2％ 3.50 0.0360 P<0.001*** P<0.001*** P<0.001***
对比实施例7 2％ 3.39 0.0096 P<0.001*** P<0.001*** P<0.001***
对比实施例8 2％ 3.80 0.0448 P<0.001*** P<0.001*** P<0.001***
对比实施例9 2％ 3.54 0.0396 P<0.001*** P<0.001*** P<0.001***
对比实施例10 2％ 3.20 0.0356 P<0.001*** P<0.001*** P<0.001***
对比实施例11 2％ 3.32 0.0226 P<0.001*** P<0.001*** P<0.001***
6、本发明的复方本草组合物祛痘临床功效
6.1.测试样品配制：
复方本草组合物凝胶配方(以重量百分比计)：本发明实施例2的复方本草组合物20％，聚丙烯酸酯交联聚合物-6 0.8％，去离子水73.2％，甘油5％，己二醇0.5％，对羟基苯乙酮0.5％。
6.2.受试人群:
31名健康受试者，面部轻度或中度的痤疮，作为受试者使用本款产品。女性25名，男性6名，年龄20-34岁，平均年龄25.13岁。
6.3.测试方法：
志愿者洁面后于测试环境中休息20分钟并填写问卷，后由皮肤科医师对痤疮皮损计数和VISIA拍照，专家评估(计数法)，志愿者问卷自评。
6.4.产品使用方法：
早晚洁面后点涂痤疮皮损处，测试期间不得更换新的化妆品，且不能参加其他肌肤测试。
6.5.试用4周后测试结果：
6.5.1专家评估结果
含有本发明的复方本草组合物的凝胶持续使用4周后，粉刺和炎性丘疹数量在2周、4周均有明显减少(p＜0.05)，脓疱在4周有明显减少(p＜0.05)，即产品对粉刺、炎性丘疹和脓疱明显有效，本发明凝胶具有明显祛痘效果(请参见图3和图4)。
6.6.2问卷自评结果(请参见图5)
Figure BDA0002535450710000311
77.42％的受试者整体比较喜欢/很喜欢本款祛痘产品；
Figure BDA0002535450710000312
74.19％的受试者认为痘痘整体情况明显减少(轻)/稍减少(轻)；
Figure BDA0002535450710000313
61.29％的受试者感觉皮肤整体变好；
Figure BDA0002535450710000314
80.65％的受试者感觉产品能加速痘痘修复和皮肤愈合；
Figure BDA0002535450710000315
77.42％的受试者认为粉刺数量明显减少(轻)/稍减少(轻)；
Figure BDA0002535450710000316
74.19％的受试者认为红肿型痘痘数量明显减少(轻)/稍减少(轻)；
Figure BDA0002535450710000321
70.97％的受试者感觉皮肤油脂分泌量明显减少(轻)/稍减少(轻)；
Figure BDA0002535450710000322
61.29％的受试者认为脓疱数量明显减少/稍减轻，痘痘疼痛程度明显减轻/稍减轻；
6.6.3 VISIA拍照(请参见图6)
2位祛痘效果前后对比图片(产品使用前、产品使用4周后)
由图3-图6表明，含有本发明的复方本草组合物的凝胶对粉刺、炎性丘疹和脓疱具有良好的抑制效果。另外，含有本发明的复方本草组合物的凝胶具有良好的祛痘效果。
7、本发明的复方本草组合物对皮肤的弹性和紧致度的影响
7.1测试目的
通过志愿者使用产品七周来评价产品改善皮肤的弹性及紧致度的效果。
7.2材料与方法
7.2.1受试者
28-45岁身体健康女性，肤色偏暗沉，受法令纹鱼尾纹困扰。最终有效完成志愿者33人。
7.2.2测试样品
含有本发明的复方本草组合物精华液(实施例7)
7.2.3实验方法
每天早晚用测试样品替换日常使用的精华。根据日常习惯用提供的水霜产品(无任何美白抗老功效的产品)进行护肤，试验期间不得使用其他护肤品(除防晒品)，尤其需要注意防晒。在使用产品0周、1周、2周、4周、6周、7周进行仪器皮肤测试。
7.2.4测试仪器
皮肤弹性测试仪
Figure BDA0002535450710000323
MPA 580(Courage&Khazaka,德国)
7.3实验结果
7.3.1皮肤弹性Q1值
在使用1周、2周、4周、6周及7周后皮肤弹性显著提升(请参见图7)。其中，数据越大越接近1，表明皮肤弹性越好，W0↑表示该时间点与W0存在差异，(p<0.05)
7.3.2皮肤紧致F4值
在使用1周、2周、4周、6周及7周后皮肤紧致度显著提升。其中，数据越小，表明皮肤紧致度越好，W0↓表示该时间点与W0存在差异，(p<0.05)
7.4实验结论
使用1周、2周、4周、6周、7周后，产品使用区域肌肤弹性的Q1值显著增加，产品具有明显提升皮肤弹性的效果。使用1周、2周、4周、6周、7周后，产品使用区域肌肤紧致的F4值显著降低，产品具有明显提升皮肤紧致的效果。
8、本发明的复方本草组合物与白芷组方的安全性比较及细胞光毒性的影响
8.1主要材料与仪器
细胞株选用BalB/c 3T3细胞，自有细胞；
DMEM培养基(含1 000mg·L－1葡萄糖，110mg·L－1丙酮酸钠，酚红，GlutaMAXTM)，购自Invitrogen公司；
DMEM完全培养基(DMEM培养基中添加质量分数为10％的胎牛血清，100IU青霉素，100g·L－1链霉素)；胎牛血清、青霉素和链霉素，均购自Hyclone公司；中性红培养基(DMEM完全培养基中加入50g·L－1中性红)；
受试标准品参照ECVAM标准，选择了5种受试物作为标准品，包括3种阳性物质(盐酸异丙嗪、盐酸氯丙嗪、诺氟沙星)和2种阴性物质(十二烷基硫酸钠(SDS)和L－组氨酸)，购自美国Sigma公司。
8.2样品光毒性检测
产品的光毒性检测采用ECVAM的标准方法，每次检测取2块培养板，分别作为阴性对照组和UVA照射组。将检测的样品配制成8个质量浓度(样品用PBS溶解，水溶性差的可用DMSO或乙醇溶解)的溶液，加入培养基中，样品的最大质量浓度均为2g·L－1，UVA总能量为5J·cm－2。
8.3评判标准
8.3.1以PIF为评判标准
通过分析+UVA(有光照)和－UVA(无光照)2种情况下获得的细胞毒性的质量浓度反应曲线，确定能抑制50％细胞活性的受试物质量浓度(EC50)，并通过以下公式来计算PIF:
PIF＝EC50(-UVA)/EC50(+UVA)
PIF的评判标准:PIF＜2，预测无潜在光毒性；PIF＞5，预测有潜在光毒性；2≤PIF≤5，需重新进行试验再行判定。
8.2实验结果
由表12可知，本发明的复方本草组合物无潜在的光毒性，具有良好的安全性。与之相对，白芷组方有潜在的光毒性，安全性差。
表12光毒性评测结果
样品名称 PIF
实施例1 ＊1
实施例2 ＊1
实施例3 ＊1
对比实施例12 27.18
本领域技术人员在考虑本文公开的说明书及实践本发明后，将容易想到本发明的其它实施方案。本说明书旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本说明书的一般性原理并包括本技术领域中的公知常识或常用技术手段。本说明书和实施方案仅被视为示例性的，本发明的保护范围由所附权利要求书指出。
应当理解的是，本说明书并不局限于上面已经描述和在说明书附图中示出的技术方案，并且可以在不脱离其范围的情况下对各种技术方案进行各种修改和改变。本发明的保护范围由所附权利要求书来限制。
以上所记载的内容仅为本发明的较佳实施方案而已，这些实施方案并不用来限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。

Claims (13)

1.复方本草组合物，其包含白及、白茯苓和藏菖蒲。
2.根据权利要求1所述的复方本草组合物，其中按重量百分比，白及为20～60％，白茯苓为20～60％和藏菖蒲为20～60％。
3.根据权利要求2所述的复方本草组合物，其中按重量百分比，白及为30～40％，白茯苓为30～40％和藏菖蒲为30～40％。
4.复方本草组合物的制备方法，其包括以下步骤：
(1)闪式提取；
(2)酶解；
(3)絮凝；
(4)离心。
5.根据权利要求4所述的方法，其中闪式提取步骤包括将复方药材经闪式提取器提取，转速5000-20000r/min，提取温度10～90℃，提取时间0.5～60min。
6.根据权利要求4所述的方法，其中酶解步骤包括在提取混合液中加入0.01％-5％的复合酶继续提取1～60min，停止提取，酶解0.1-2h。
7.根据权利要求6所述的方法，其中复合酶选自下述任意两种或更多种酶：纤维素酶、木瓜蛋白酶、半纤维素酶、中温α-淀粉酶、果胶酶和木聚糖酶。
8.根据权利要求4所述的方法，其中絮凝步骤包括在提取混合液中加入0.01％-5％的絮凝剂继续提取1～60min，停止提取，静置絮凝1-60min，絮凝温度4～60℃。
9.根据权利要求4-8中任一项所述的方法，其中离心步骤包括将提取物进样至高速转鼓离心机进行离心分离，离心转速5000-20000r/min。
10.根据权利要求4-9中任一项的方法获得的复方本草组合物。
11.美容产品或化妆品，其包含权利要求1-3和10中任一项的复方本草组合物。
12.根据权利要求1-3和10中任一项的复方本草组合物，其用于美白、抗衰老、抗炎、保湿和/或护肤。
13.根据权利要求1-3和10中任一项的复方本草组合物在制备用于美白、抗衰老、抗炎、保湿和/或护肤的产品中的用途。
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