CN106109339B - 一种黄精枸杞复方提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄精枸杞复方提取物及其制备方法和应用，由黄精和枸杞提取物组成，其中黄精和枸杞原料重量比为1:5‑5:1，提取物生药浓度为0.1mg/mL‑5mg/mL。本发明的黄精枸杞复方提取物能增强细胞内抗氧化蛋白的表达和/或降低UVA辐射后成纤维细胞内的ROS含量，并且能提高表皮角质细胞线粒体活性和/或表皮角质细胞中三磷酸腺苷含量。可以作为功效添加剂加入到皮肤外用剂中使用，用于皮肤护理。

Description

一种黄精枸杞复方提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及中药复方提取物，特别是黄精枸杞复方提取物及其制备方法和应用，其能够增强皮肤细胞尤其是表皮细胞线粒体活性和/或提高表皮细胞三磷酸腺苷(ATP)含量，且能增强细胞内抗氧化蛋白的表达和/或降低UVA辐射后成纤维细胞内的ROS含量,可以作为功效添加剂加入到皮肤外用剂中使用，用于皮肤护理。

背景技术

皮肤由表皮、真皮和皮下组织构成，是人体最大的器官。皮肤覆盖全身，是保护人体的天然屏障，既可以保护人体内各组织和器官免受病原微生物等外界物质以及物理等机械损伤的侵袭，还可以保持人体的水分、电解质和营养物质等的流失。在有效保持人体内环境稳定的同时，皮肤还参与人体的新陈代谢过程。

新陈代谢是指机体与外界环境之间的物质和能量交换，以及生物体内物质和能量自我更新的过程，是生命现象最基本的特征之一，包括物质代谢和能量代谢两个方面。机体通过物质代谢，从外界摄取营养物质，经过体内分解吸收，将其中蕴藏的化学能释放出来，转化为组织和细胞可以利用的能量，维持机体正常的生命活动。

细胞的活力主要反映在其新陈代谢水平上。皮肤的新陈代谢旺盛，细胞活力充沛，皮肤就呈现富有弹性、自然、容光焕发的健康状态；皮肤的新陈代谢缓慢，细胞活力减退，就会出现皮肤老化、暗沉、敏感等肌肤问题。表皮是皮肤细胞新陈代谢的主要功能细胞，因此，促进皮肤新陈代谢，提高皮肤细胞的活力对于保持健康、年轻的皮肤是必须的。

线粒体是真核细胞的重要细胞器，是细胞氧化代谢的关键部位，是细胞产生ATP的重要场所，被称为“细胞的能量工厂”，其活性可以直接反映细胞的新陈代谢能力。线粒体可以促进细胞的更新，激励皮肤细胞功能性增强，增加细胞能量，从而增加皮肤的亮度和皮肤抗衰老的作用。表皮细胞中的线粒体，通过参与细胞的有氧代谢过程，为皮肤细胞的其他各项生理功能和化学反应提供能量，保持细胞的正常运行，从而保持皮肤细胞充沛的活力。若线粒体收到损伤或者失去活性，皮肤细胞能量不足，功能性降低，就会导致皮肤老化，产生皱纹，失去光泽。因此，表皮细胞中的线粒体活性大小是衡量细胞活力的重要指标。

ATP，即三磷酸腺苷，是各种活细胞内普遍存在的一种高能磷酸化合物，是细胞内的直接能源物质，常被称为“细胞中的能量通货”。细胞内的ATP在ATP酶的作用下，水解时可以释放出大量的能量，为细胞新陈代谢等化学反应的发生和进行提供动力。通过提高ATP水平，可以为肌肤细胞提供新生能量，使皮肤达到良好的新陈代谢平衡状态，全面改善肌肤状态，重新恢复自然、健康的肌肤状态。由于ATP主要由线粒体等细胞器产生，因此，通过检测细胞内ATP含量可以反映出细胞内线粒体活性的强弱。

黄精为百合科黄精属(Liliaceae)多年生草本植物黄精(Polygonatum sibiricumRed.)、滇黄精(Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.)和多花黄精(Polygonatumcyrtonema Hua)的干燥根茎，始载于《明医别录》，别名为“仙人余粮”、“救命草”、“老虎姜”等，是一种传统的名贵中药，具有宽中益气、益肾填精、滋阴润肺、生津补脾之功效。《神仙芝草经》中有言其“宽中益气，使五脏调良，肌肉充盛，多年不老，颜色鲜明，发白更黑，齿落更生”，说明黄精有延年益寿、葆精养颜的作用。《中国药典》中以黄精、多花黄精和滇黄精的干燥根茎作为黄精药材入药，其化学成分有生物碱、黄酮、醌类、木脂素、多糖、甾体皂苷及微量元素等；现代药理研究表明，黄精具有抗衰老、清除自由基、抗炎、抗肿瘤、免疫调节、降血糖、降血脂等多种作用。

枸杞，俗称枸杞子，始载于《神农本草经》，位列上品，为茄科植物宁夏枸杞(Lyciumbarbarum L.)或枸杞(Lycium chinense Mil.)的干燥成熟果实，有滋补肝肾、益面色、长肌肉、坚筋骨之功效，具有很高的药用和营养价值。《药性论》中记载：“枸杞补精气，诸不足，易颜色，变白，明目安神，令人长寿。”；《神农本草经》中亦有记载：“枸杞主五内邪气，热中消渴，周痹风湿，久服峰筋骨，轻身不老，耐寒暑。”枸杞的化学成分主要是枸杞多糖、甜菜碱、类胡萝卜素及类胡萝卜素酯、维生素C、氨基酸及微量元素等成分；枸杞多糖为其主要活性成分之一，具有免疫调节、抗疲劳、抗衰老，降糖明目、保肝、降脂及抗肿瘤等作用。现代研究表明，枸杞具有良好的促进免疫、降血糖、抗氧化、延缓衰老、促进肿瘤细胞凋亡、抗辐射损伤、降血脂等作用。

中国专利申请CN102065837公开了一种枸杞提取物用于保持和/或恢复皮肤张力和/或紧致的美容用途，该专利发明所述的有效量的浆果选自枸杞、蓝莓、蔓越桔、黑莓、醋栗、白醋栗、树莓等，主要涉及称作“松弛皮肤”的皮肤的预防和治疗。美国专利申请US20150352037公开了一种用于抗皮肤衰老的成分，该成分以中国枸杞提取物和欧洲樟子松叶提取物作为有效成分，为肌肤提供维生素A酸衍生物来达到抗衰老或改善皱纹的作用。欧洲专利申请EP1003538公开了一种真皮细胞弹性蛋白合成促进剂，该促进剂包含黄精或滇黄精或多花黄精植物的根茎提取物，用于促进皮肤弹性蛋白的合成，改善皮肤弹性。韩国专利申请KR20150002048公开了一种抗皱或抗皮肤衰老的组合物，该组合物包含黄精等5种植物提取物，用于促进皮肤细胞中胶原蛋白的生物合成以及I型胶原蛋白的表达。日本专利申请JPH08283172公开了一种具有活性氧清除作用的皮肤外用剂，该发明涉及对羟自由基、过氧化氢、活性氧等至少一种具有清除作用，该皮肤外用组合剂包含一种或多种植物提取物，包括黄精、枸杞根、水皂角全草等十多种植物成分，可用于抗皮肤衰老和皮肤美容。上述专利虽涉及枸杞或黄精对皮肤相关的美容功效，但并未提到黄精和枸杞的配伍使用及配伍比例，也未提及对线粒体活性以及能量ATP含量的作用效果。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种黄精枸杞复方提取物。

本发明的目的之二是提供一种黄精枸杞复方提取物的制备方法。

本发明的目的之三是提供一种黄精枸杞复方提取物在皮肤外用剂中的应用。

本发明的这些以及其它目的将通过下列详细描述和说明来进一步的阐述。

本发明的黄精枸杞复方提取物由黄精和枸杞提取物组成，其中黄精和枸杞原料重量比为1:5-5:1，提取物生药浓度为0.1mg/mL-5mg/mL。所述生药浓度是指药材投料量和药液质量或体积的比值。

可以选择的，本发明的黄精枸杞复方提取物由黄精和枸杞提取物组成，其中黄精和枸杞原料重量比为1:5-3:1。

较好的是，本发明的黄精枸杞复方提取物由黄精和枸杞提取物组成，提取物生药浓度为0.2mg/ml-4mg/ml。

本发明的黄精枸杞复方提取物的制备方法，包括如下步骤：

A、将黄精、枸杞分别进行预处理，所述预处理包括粉碎、脱脂，所述粉碎是指用高速粉碎机，功率1500W，粉碎20-30s，所述脱脂是指用95％-100％乙醇浸泡24h-48h后，去除上清液；

B、加入溶剂进行提取，提取1-3次，所述提取包括浸提、煎煮、回流提取、超声提取、微波提取和/或动态提取，使用一种或使用二种以上提取方法；

C、过滤取滤液，浓缩，所述过滤包括筛网过滤、滤纸过滤和/高速离心过滤，使用一种或使用两种以上过滤方法，所述浓缩包括煎煮浓缩、真空减压浓缩、反渗透膜浓缩。

在本发明的黄精枸杞复方提取物的制备方法中，所述的溶剂包括去离子水、甲醇、乙醇、丙酮、丙二醇、丁二醇和/或甘油，及其两种以上的混合物。

本发明的黄精枸杞复方提取物在制备提高表皮角质细胞线粒体活性和/或表皮角质细胞中三磷酸腺苷含量的皮肤外用剂组合物中的应用。

本发明黄精枸杞复方提取物在制备增强细胞内抗氧化蛋白的表达和/或降低UVA辐射后成纤维细胞内的ROS含量的皮肤外用剂组合物中的应用。

本发明的黄精枸杞复方提取物在皮肤外用剂组合物中的应用，其中黄精枸杞复方提取物占组合物总重量的0.0001％-20％(w/w)。

较好的是，本发明的黄精枸杞复方提取物在皮肤外用剂组合物中的应用，其中黄精枸杞复方提取物占组合物总重量的0.01％-5％(w/w)。

在本发明中，浸提法属于萃取的一种，利用相似相溶原理，用液体溶剂浸泡药材，将药材中的有效成分提取出来的方法。在一些实施方式中，本发明浸提过程采用的溶剂选自：水、乙醇、甲醇或多元醇。在一个具体的实施方式中，本发明浸提过程采用的溶剂是体积浓度为70％的乙醇。

煎煮法是将经预处理的药材，加8-12倍(质量比)的水再加热煮沸，使药材中的有效成分充分提取出来，这样煎煮2-3次，收集各次煎出液，沉淀或者过滤，在进一步将上清液蒸发浓缩至一定浓度。在一些实施方式中，本发明煎煮过程采用的溶剂选自水。在一个具体的实施方式中，本发明煎煮过程采用的溶剂是去离子水，在90-95℃下进行提取。

膜分离是指在分子水平上，将含有不同粒径分子的水提液通过半透膜，实现选择性分离的技术。在一些实施方式中，本发明膜分离包括管式膜分离步骤和RO膜分离步骤。在一个具体的实施方式中，本发明膜分离过程采用的是孔径200nm的管式陶瓷膜。

回流提取法是指用有机溶剂加热提取中药有效成分时，为防止溶剂的挥发损失，采用冷凝回流装置，从而提高提取效率。

超声提取法是利用超声波具有的机械效应，空化效应和热效应，通过增大介质分子的运动速度、增大介质的穿透力以提取有效成分。

微波提取法是利用高频电磁波穿透提取介质，到达物料的内部，在这个过程中，微波能迅速转化为热能，使物料细胞内部的温度快速上升。当细胞内部的压力超过细胞的承受能力时,细胞就会破裂,有效成分即从胞内流出，并在较低的温度下溶解于提取介质，再通过进一步过滤分离得到提取物。

动态提取法是指药材与溶剂在浸出容器中相对运动，连续而充分地进行接触提取的一种提取方法。这样天然物质在温和的动态环境下进行提取，加热温度较低、有效成分破坏较少，使溶液中杂质含量少，属于连续式生产。

所述皮肤外用剂组合物是通常用于皮肤外部的所有成分的统称概念，例如可以是化妆料组合物或药学组合物。所述化妆料组合物中可以是基础化妆料、面部妆容化妆料、身体用化妆料、头发护理用化妆料等，对其剂型无特殊限制，根据不同目的可合理选择。

所述化妆料组合物中根据剂型和目的的不同还含有不同的化妆品学层面允许的介质或基质赋形剂。

可以用于本发明皮肤外用剂组合物的化妆品、皮肤病学或药学上可接受的赋形剂为水相、油相、凝胶、水包蜡型乳液、水包油型乳液或油包水型乳液的形式。水相为一种或多种水溶性或分散性组分的混合物，其在室温(25℃)下可以为液体、半固体或固体。赋形剂包括或可以为在水或水-醇赋形剂中的混悬液、分散液或溶液的形式，其可以含有增稠剂或凝胶剂。本领域技术人员可以基于本领域技术人员掌握的知识选择合适的产品形式，其中包含的组分。

所述的组合物可以包括水相，该水相可以含有水或水与至少一种亲水性有机溶剂的混合物，所述的亲水性有机溶剂诸如醇，尤其是含有2-5个碳原子的直链或支链低级一元醇，如乙醇或丙醇；多元醇，如丙二醇、山梨醇、甘油、泛醇或聚乙二醇及其混合物。

当发明的组合物为乳液形式时，该组合物还可以任选包含表面活性剂。

所述的组合物还可以包含成膜聚合物，如聚氨基甲酸酯、聚丙烯酸均聚物或共聚物、聚酯、基于烃的树脂和/或硅氧烷树脂。可以将聚合物溶于或分散于化妆品可接受的赋形剂中并且任选与增塑剂合并。

本发明的组合物还可以包含油相，所述的油相含有在室温(25℃)下为液体的油溶性或油分散性组分和/或在室温下为油状或蜡状的物质，如蜡、半固体、树胶及其混合物。该油相还可以含有有机溶剂。

通常在室温下为液体，合适的油性物质包括：来源于动物的基于烃的油，如全氢化角鲨烯；基于烃的植物油，如液体的C4-10脂肪酸的甘油三酯类，例如庚酸或辛酸甘油三酯类，或油，例如向日葵油、玉米油、大豆油、葡萄籽油、蓖麻油、鳄梨油、辛酸/癸酸甘油三酯类、霍霍巴油；矿物或合成来源的直链或支链烃类，例如液体石蜡及其衍生物、凡士林；合成酯类和醚类，特别是脂肪醇的酯类，例如肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸2-乙基己酯、硬脂酸2-辛基十二烷基酯、异硬脂酸异硬脂醇酯；羟基化酯类，例如乳酸异硬脂醇酯、羟基硬脂酸辛酯、羟基硬脂酸辛酯、羟基硬脂酸辛基十二烷基酯、脂肪醇的庚酸酯类、辛酸酯类和癸酸脂类；多元醇酯类，例如丙二醇二辛酸酯、新戊二醇二庚酸酯、二甘醇二异壬酸酯和季戊四醇酯类；含有C12-26的脂肪醇类，例如辛基十二烷醇、2-丁基辛醇、2-己基癸醇、2-十一烷基十五烷醇、油醇；基于部分烃的氟油和/或氟硅油，硅油，在室温下为液体或半固体的挥发性或非挥发性的直链或环状聚甲基硅氧烷，例如环状聚二甲基硅氧烷和聚二甲基硅氧烷，其任选包含苯基，例如苯基三甲基硅氧烷、硅氧烷及其混合物。

本发明的组合物可以进一步包含常用于化妆品领域中的任何组分。这些组分包括防腐剂、水相增稠剂(提取物生物聚合物、合成聚合物)和脂肪相增稠剂、芳香剂、亲水性和亲脂性活性剂及其混合物。

本发明的组合物还可以包含另外的颗粒相，所述的颗粒相可以为化妆品组合物中使用的颜料和/或珠光剂和/或填充剂。

颜料可以存在于组合物中，合适的无机颜料包括氧化钛、氧化锆和氧化铈以及氧化锌、氧化铁和铁蓝；合适的有机颜料包括钡、锶、钙和铝色淀和碳黑。

珠光剂可以存在于组合物中，合适的珠光剂包括涂覆了氧化钛、氧化铁或天然颜料的云母。

填充剂可以存在于组合物中，合适的填充剂包括滑石粉、二氧化硅、硬脂酸锌、云母、高岭土、尼龙粉末、聚乙烯粉末、特氟龙、淀粉、一氮化硼、共聚物微球，例如硅氧烷树脂微珠。

本发明组合物的油相可以包含一种或多种蜡、树胶或其混合物。蜡包括基于烃的蜡、氟蜡和/或硅氧烷蜡，并且可以来源于植物、矿物、动物和/或合成来源。合适的蜡包括蜂蜡、巴西棕榈蜡、小烛树蜡、石蜡、微晶蜡、地蜡；合成蜡包括聚乙烯蜡、含有C16-45的硅氧烷蜡。树胶一般为聚二甲基硅氧烷或羧甲基纤维素钠或提取物类，并且半固体物质一般为基于烃的化合物，如羊毛脂及其衍生物。

可以将本发明的组合物配制成任何合适的产品形式。这类产品形式包括，但不限于气溶胶型喷雾剂、霜剂、乳液、固体、液体、分散体、泡沫、凝胶、化妆水、摩丝、软膏、粉剂、贴剂、润发油、溶液、手按泵型喷雾剂、棒状物、面膜和湿纸巾。可以将本发明的组合物通过本领域众所周知的各种方法便利地用于制备或作为化妆品、皮肤病学或药物局部施用产品。

本发明的皮肤外用剂组合物可以包括一种或多种下列成分：抗过敏剂、抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、着色剂去色素剂、润肤剂、乳化剂、表皮脱落剂、成膜剂、香料、保湿剂、昆虫驱避剂、润滑剂、药物活性剂、增湿剂、耐光剂、防腐剂、护肤剂、皮肤渗透增强剂、防晒剂、稳定剂、表面活性剂、增稠剂、粘度调节剂、维生素或其任意组合。

具体实施方法

将黄精(青浦中药饮片厂)、枸杞(上海华宇药业有限公司)预处理后，加入适量溶剂，进行提取，去渣取提取液，浓缩，制成一定生药浓度的黄精枸杞浓缩液。

预处理方式可以包括粉碎、脱脂，溶剂包括去离子水、甲醇、乙醇、丙酮、丙二醇、丁二醇、甘油等亲水性溶剂及其混合溶剂，提取方式包括浸提、煎煮、回流提取、超声提取、微波提取、动态提取等。

实施例1：黄精枸杞提取物的制备

黄精：枸杞(1:1)→10倍去离子水煎煮提取→过滤→滤液，采用200nm陶瓷膜进行膜分离→透析液煎煮浓缩，即黄精枸杞复方提取物1，生药浓度0.69g/g，固体含量19.58％。

实施例2：黄精枸杞提取物的制备

黄精：枸杞(1:1)→10倍70％乙醇浸渍提取→过滤→滤液减压浓缩，即黄精枸杞复方提取物2，生药浓度0.56g/g，固含量15.04％。

实施例3：黄精枸杞提取物的制备

黄精：枸杞(1:1)→10倍去离子水煎煮提取→过滤→滤液浓缩至1倍生药量→70％乙醇醇沉→过滤→滤液减压浓缩，即得黄精枸杞复方提取物3，生药浓度1.0g/g，固含量24.74％。

实施例4：黄精枸杞提取物的制备

黄精：枸杞(1:3)→10倍去离子水煎煮提取→过滤→滤液浓缩至1倍生药量→70％乙醇醇沉→过滤→滤液减压浓缩，即黄精枸杞复方提取物4，生药浓度1.0g/g，固体含量31.80％。

实施例5：黄精枸杞提取物的制备

黄精：枸杞(3:1)→10倍去离子水煎煮提取→过滤→滤液浓缩至1倍生药量→70％乙醇醇沉→过滤→滤液减压浓缩，即黄精枸杞复方提取物5，生药浓度1.0g/g，固体含量33.25％。

实施例6：黄精枸杞提取物的制备

黄精：枸杞(1:5)→10倍去离子水煎煮提取→过滤→滤液浓缩至1倍生药量→70％乙醇醇沉→过滤→滤液减压浓缩，即黄精枸杞复方提取物6，生药浓度1.0g/g，固体含量29.69％。

实施例7：黄精枸杞提取物的制备

黄精：枸杞(5:1)→10倍去离子水煎煮提取→过滤→滤液浓缩至1倍生药量→70％乙醇醇沉→过滤→滤液减压浓缩，即黄精枸杞复方提取物7，生药浓度1.0g/g，固体含量31.26％。

实施例8：黄精提取物的制备

黄精→10倍去离子水煎煮提取→过滤→滤液浓缩至1倍生药量→70％乙醇醇沉→过滤→滤液减压浓缩，即黄精提取物，生药浓度1.0g/g，固体含量30.03％。

实施例9：枸杞提取物的制备

枸杞→10倍去离子水煎煮提取→过滤→滤液浓缩至1倍生药量→70％乙醇醇沉→过滤→滤液减压浓缩，即枸杞提取物，生药浓度1.0g/g，固体含量21.75％。

取实施例1-9所得黄精枸杞复方提取浓缩液作为体外功效测试样品，小体积分装后于-20℃保存，每次使用时用细胞培养液稀释，过滤除菌后进行细胞实验。

实施例10：对表皮角质细胞(HaCaT)线粒体活性的影响

样品经过细胞毒性测试，确定最终加药浓度分别为0.5mg/ml、0.1mg/ml、0.4mg/ml生药浓度。用60℃预热的培养液将XTT溶解，配制成0.2mg/mL的溶液，将96孔板中的细胞培养液移除，每孔中加入XTT/PMS(200:1)后，于37℃条件下培养2h，在酶标仪上450nm波长处测定吸光度值OD。结果显示(表1)。

表1不同实施例样品在不同浓度下对表皮细胞线粒体活性的影响

注：OD/OD₀为样品与阴性对照在450nm处吸光度比值。

由实验数据可知，相比阴性对照细胞OD值为1.0，不同实施例样品在不同浓度下对处理过的细胞线粒体活力均有不同程度的作用，其中实施例1样品在浓度为0.5mg/mL时，提升比例最高，达到26.9％，能够显著增强表皮角质细胞的线粒体活性(*P<0.05)。由实施例3-9提取物对线粒体活力提升作用效果比较结果可知，黄精和枸杞单味药提取物对线粒体活力没有作用效果，或者提升比例很小，而黄精枸杞配伍组方后在一定的配比范围内，可以提高其提取物对线粒体活力的作用效果。

实施例11：对表皮角质细胞(HaCaT)ATP含量的影响

根据XTT检测结果，确定样品的最终加药浓度为0.5mg/ml生药浓度。将HaCaT细胞接种于含DK-SFM培养液的培养瓶中，置于37℃，CO：(体积分数为5％)恒温培养箱中培养5天至细胞融合，隔天换培养液。实验时，将细胞培养瓶取出，用胰蛋白酶将HaCaT细胞消化4min，然后将细胞接种于96孔板孵育24h，加药组每孔加入200μl用培养液稀释的0.1mg/mL固含量的实施例样品，对照组每孔直接加入200μl培养液，于培养箱中培养48h后进行测定。ATP含量：采用细胞能量检测包检测细胞内ATP含量，操作方法按照试剂盒说明书进行。三磷酸腺苷(ATP)细胞能量检测包，LuminUltra公司。

表2不同实施例样品对表皮细胞中ATP含量的影响

ATP含量检测结果显示，相比阴性对照细胞OD值为1.0，不同实施例样品在浓度0.5mg/ml时对处理过的细胞ATP含量有不同程度的提高，其中实施例1样品对表皮细胞ATP含量的提升比例最高，达到25.4％，能够显著增强表皮角质细胞的ATP含量(*P<0.05)；与实施例8和9提取物的实验数据对比可知，黄精枸杞按一定比例配伍后，可以提高其对表皮细胞中ATP含量的作用效果，表现出特有的协同增效的作用。

实施例12：对ARE激活水平的影响

本实验采用ARE表达水平检测方法，将编码luciferase荧光酶的一段报告基因转染到293T细胞的ARE序列之后，当ARE激活时，其下游的报告基因就会表达luciferase荧光酶。通过检测细胞中luciferase的表达量变化，从而反映出细胞内ARE的激活水平。

经过细胞毒性测试，确定样品的最终加药浓度为5mg/ml、1mg/ml及0.2mg/ml生药浓度。

表3不同实施例样品对表皮细胞中ARE激活水平的影响

实验结果表明(表3)，与阴性对照组的OD值为1.0相比，不同实施例样品在不同浓度下处理细胞后，细胞内ARE激活水平明显高于对照组(*P<0.05)，即细胞内抗氧化蛋白的表达多于对照组，且相同浓度作用下，黄精枸杞复方提取物的抗氧化表达效果明显优于黄精和枸杞单味中药的提取物，其中黄精枸杞复方的实施例1样品在浓度为5mg/ml时，对细胞内ARE表达水平的提升比例最高，高达269.9％，表现出特有的协同增效的作用。

实施例13：对UVA辐照后成纤维细胞中ROS含量的影响

本实验采用UVA辐照成纤维细胞，模拟外界环境压力对皮肤造成的损伤。借助检测试剂盒，能够有效测量在UVA辐照后成纤维细胞内产生的ROS的量。首先经过细胞毒性测试，确定样品最终加药浓度为0.5mg/ml生药浓度。

表4不同实施例样品对UVA辐照后成纤维细胞中ROS含量的影响

实验结果表明(表4)，与阴性对照组成纤维细胞中的ROS含量(OD值为1.0)相比，不同实施例样品在浓度为0.5mg/ml时可不同程度地降低细胞内的ROS含量，其中实施例1样品能够显著降低UVA辐射后成纤维细胞内的ROS含量(*P<0.05)，且降低比例最高，达到19.6％。

实施例10-13的实验结果表明，黄精和枸杞按一定比例配伍之后，在某一配比范围内，其复方的功效明显优于黄精或枸杞的单味药提取物；黄精枸杞复方提取物可以在一定程度上提高表皮细胞的线粒体活性以及表皮细胞中的ATP含量，从而提高表皮细胞的活力，同时，还可以提高细胞内的ARE激活水平，并显著减少细胞内ROS的含量，起到抗氧化的作用。

取实施例1-7中制备的包含黄精枸杞复方提取物，用于皮肤外用剂的制备。所述皮肤外用剂优选为化妆品组合物，例如化妆水、精华液、乳霜等。所述包含黄精枸杞复方提取物在皮肤外用剂中的重量百分比为0.0001％-20％(w/w)，优选的重量百分比为0.001％-10％(w/w)，更优选的重量百分比为0.01％-5％(w/w)。

以下是包含黄精枸杞复方提取物在皮肤外用剂中的具体应用的实施例，及其这些剂型的配方和制备方法。以下各表中“-”表示无添加。

以下实施例14-24中所使用的包含黄精枸杞复方提取物均为实施例1-7制备得到,复方提取物在配方中的优选生药浓度为0.1mg/mL-5mg/mL。

实施例14：面霜的制备

工艺：A相加热到80℃，均质下慢慢加入到预先分散均匀并加热至80℃的E相中，加入B相均质3分钟，加入C相调节pH 6～7，搅拌冷却到50℃加入D相，搅拌、冷却到35℃即得。需要在D相添加防腐剂极美2型复配物:中值0.5，最低值0.2，最高值1

实施例15：乳液的制备

工艺：A相加热到80℃，均质下慢慢将预先分散均匀并加热至80℃的D相加入，加完后均质3分钟，加入C相调节pH6～7，搅拌冷却到50℃加入B相，搅拌、冷却到35℃即得。

实施例16：啫喱的制备

工艺：A相分散均匀后将D相加入，加热到80℃溶解、分散均匀，加入C相调节pH6～7，搅拌冷却到50℃加入B相，搅拌、冷却到35℃即得。

实施例17：化妆水的制备

工艺：B相混合、搅拌到溶解透明，A相搅拌均匀后加入到B相中，搅拌混合均匀后，过滤即得。

实施例18：精华液的制备

工艺：A相、D相分别加热到80℃搅拌溶解均匀，均质下D相加热到A相中，加完均质3分钟，加入C相调节pH6～7，搅拌冷却到50℃加入B相，搅拌、冷却到35℃即得。

实施例19：面膜的制备

工艺：A相、B相分别加热到80℃搅拌溶解均匀，均质下B相加热到A相中，加完均质3分钟，加入预先分散均匀的C相，搅拌冷却到50℃加入D相，搅拌、冷却到35℃即得。

实施例20：眼霜的制备

工艺：在30～50℃下将A相搅拌直至清澈，在搅拌下缓慢加入B相，边搅拌边加入C相。将料体均质搅拌均匀即得。

实施例21：气雾(清洁泡)的制备

工艺：将去离子水加热后加入尼泊金甲酯，加热溶解后冷却，再依次加入椰油酰基谷氨酸三乙醇胺、PEG-7甘油椰油酸酯、香精、羊肚菌提取物、甲基异噻唑啉酮混合搅拌均匀至澄清。后在气雾剂灌装流水线上充填入液化石油气即得。

实施例22：喷雾的制备

工艺：将去离子水加热后加入尼泊金甲酯，加热溶解后冷却，再依次加入肉苁蓉上清混合物、丙二醇后搅拌均匀至澄清即得。

实施例23：沐浴露的制备

工艺：A相加热至70-75℃，搅拌至充分溶解透明；加入B相，搅拌至充分溶解透明；降温至45-50℃，加入C相，搅拌至均匀混合；加入适量柠檬酸和氯化钠调节pH值和黏度至目标范围，搅拌均匀即可出料。

实施例24：洗面奶的制备

工艺：A相加热至70-75℃，搅拌至充分溶解透明；加入B相，搅拌至充分溶解透明；降温至45-50℃，加入C相，搅拌至均匀混合；加入适量柠檬酸和氯化钠调节pH值和黏度至目标范围，搅拌均匀即可出料。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (6)

1.一种黄精枸杞复方提取物，其特征在于，由黄精和枸杞提取物组成，提取物的生药浓度为0.l mg/mL-5mg/mL，

其中，所述黄精枸杞复方提取物按如下步骤制备：

A、将黄精、枸杞分别进行预处理，所述预处理包括粉碎、脱脂，所述脱脂是指用95%-100% 乙醇浸泡，去除上清液；

B、加入溶剂进行提取，提取1-3次，所述提取包括浸提、煎煮、回流提取、超声提取、微波提取和/或动态提取，使用一种或使用二种以上提取方法；

C、过滤取滤液，浓缩，所述过滤包括筛网过滤、滤纸过滤和/高速离心过滤，使用一种或使用两种以上过滤方法，所述浓缩包括煎煮浓缩、真空减压浓缩、反渗透膜浓缩，

其中，所述溶剂选自：去离子水、甲醇、乙醇、丙酮、丙二醇、丁二醇和/或甘油，

其中，当所述溶剂是去离子水时，黄精和枸杞原料重量比为1:5-3:1，

其中，当所述溶剂包含甲醇、乙醇、丙酮、丙二醇、丁二醇和/或甘油时，黄精和枸杞原料重量比为1:1。

2.根据权利要求l 所述的黄精枸杞复方提取物，其特征在于由黄精和枸杞提取物组成，提取物中生药浓度为0.2 mg/ml – 4 mg/ml 。

3.如权利要求1或2所述的黄精枸杞复方提取物在制备提高表皮角质细胞线粒体活性和/或表皮角质细胞中三磷酸腺苷含量的皮肤外用剂组合物中的应用。

4.如权利要求1或2所述的黄精枸杞复方提取物在制备增强细胞内抗氧化蛋白的表达和/或降低UVA辐射后成纤维细胞内的ROS含量的皮肤外用剂组合物中的应用。

5.根据权利要求3或4所述的在皮肤外用剂组合物中的应用，其特征在于黄精枸杞复方提取物占组合物总重量的0.0001 %-20% (w/w) 。

6.根据权利要求3或4所述的在皮肤外用剂组合物中的应用，其特征在于黄精枸杞复方提取物占组合物总重量的0.01%-5%(w/w) 。