CN115651949A - 一种白及甘露低聚糖及其制备方法和应用 - Google Patents
一种白及甘露低聚糖及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种白及甘露低聚糖及其制备方法和应用，所述白及甘露低聚糖的分子量为402‑700 Da。本发明涉及的白及甘露低聚糖由于分子量较低，可以很好的被皮肤吸收，具有一定的抗炎症、舒缓抗敏、抗皱紧致等功效，有利于在化妆品中的应用，本发明白及甘露低聚糖的制备方法具有生产过程简单，耗时短，制备得到的产物分子量低等特点。
Description
技术领域
本发明属于化妆品生产技术领域，具体涉及一种白及甘露低聚糖及其制备方法和应用。
背景技术
白及，为兰科白及属植物，属药食同源，药（食）用部位为干燥块茎，主要化学成分包括白及多糖、芪类化合物等，主要有止血、免疫调节、促进伤口愈合、抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗溃疡、促进造血、抗病毒等药理活性。在现有的研究中，大多数以白及多糖为研究对象；在功效应用方面，主要以止血功效为主。
低聚糖又称寡糖，指由2-10个相同或不同的单糖通过糖苷键连接聚合而成的直链或支链的低度聚合糖，包括功能性低聚糖和普通低聚糖。功能性低聚糖在自然界分布广泛，种类多，因其具有低热量、防龋齿、防便秘、降低血清胆固醇、增强机体免疫力、抗肿瘤等特点，使得功能性低聚糖成为功能性食品生产中重要的基础原料与食品添加剂，现已被世界许多国家的工业生产所用。
CN113698502A公开了一种白及须根低聚糖及其制备方法和应用，制备方法包括：将白及须根烘干后，粉碎，并溶解在热水中得到白及须根溶液；将白及须根溶液通过提取，脱色，浓缩，醇沉，得到白及须根粗提物；将白及须根粗提物离心，洗涤，除蛋白，冻干即可，白及须根低聚糖的分子量为1000-1500 Da，其主要由鼠李糖、阿拉伯糖、岩藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成。但该发明未提及对于白及块茎的成分的提取，并且在工艺设计中，引入有机溶剂丙酮、三氯乙酸，存在一定的安全问题。
CN111004335A公开了一种从白及根茎中提取得到的白及低聚糖及其制备方法，包括以下步骤：1)提取：将白及茎块切片，加去离子水进行多次提取，合并提取液，离心过滤得白及茎块提取液；2)氧化铝柱处理：将白及茎块提取液经中性氧化铝柱处理，得到流出液A；3)交联葡聚糖凝胶柱处理：将流出液A浓缩后，上样至处理好的交联葡聚糖凝胶柱进行吸附分离，然后用去离子水洗脱，收集洗脱液得到流出液B；4)干燥：将流出液B经浓缩、冷冻干燥得到白及低聚糖。但是该方法收率低，不适用于工业生产。
CN113278082A公开了一种白及提取物及其在制备抗氧化化妆品中的应用，包含以下步骤：S1、将白及块茎药材干燥，粉碎，得到白及块茎粉末；S2、将白及块茎粉末加入到乙醇溶液中，分散均匀，回流提取，弃红褐色液体，取药渣，烘干；S3、将药渣加入到纯水中，超声提取，重复操作1-2次，合并提取液，离心，取上清液；S4、将果胶酶加入到上清液中，酶解，再加入α-淀粉酶，酶解，将酶灭活，离心，减压浓缩，得到浓缩液；S5、在浓缩液中滴加乙醇，离心，收集沉淀物，将沉淀物用纯水复溶，冷冻干燥，得到白及提取物。该方法得到的产物为白及多糖，在化妆品领域应用效果不如低聚糖对于皮肤更好吸收。
因此，开发一种白及甘露低聚糖，以及从白及根茎中高效提取分子量较小的白及甘露低聚糖的方法，该方法可以投入工业使用是本领域的研究重点。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种白及甘露低聚糖及其制备方法和应用，所述制备方法生产过程简单、生产条件温和、耗时短，通过筛选反应物和优化反应条件，所制备得到的产物分子量402-700 Da，可以更好的被皮肤吸收，更有利于在化妆品中的应用，本发明所制备得到的白及甘露低聚糖具有一定的抗炎症、舒缓抗敏、抗皱紧致等功效。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种白及甘露低聚糖，所述白及甘露低聚糖的分子量为402-700 Da。
本发明提供的白及甘露低聚糖，分子量在402-700 Da之间，可以很好的被皮肤吸收，具有一定的抗炎症、舒缓抗敏、抗皱紧致等功效，有利于在化妆品中的应用。
所述白及甘露低聚糖的分子量为402-700 Da，例如可以为650 Da、600 Da、550Da、500 Da、450 Da、430 Da或410 Da等。
第二方面，本发明提供如第一方面提供的一种白及甘露低聚糖的制备方法，所述制备方法包括：
（1）称取白及块茎药材，干燥，粉碎，得到白及粉末；
（2）白及粉末与乙醇水溶液混合后进行提取，回收滤渣；
（3）将步骤（2）所得滤渣与水、水解酶混合后进行保温酶解，一次过滤，滤液浓缩得到浸膏；
（4）将步骤（3）所得浸膏进行二次过滤，冻干，得到白及甘露低聚糖。
本发明涉及的白及甘露低聚糖的制备方法具有生产过程简单，耗时短，制备得到的产物分子量低、功效好等特点。本发明将白及块茎药材进行干燥并粉碎得到白及粉末，增大了药材与溶剂接触面积，减少提取时间，从而提高了提取效率。将提取后的滤渣进行酶解，高效地将水提出的多糖高效、快速进行水解形成低聚糖，降低最终产物中糖的分子量。
优选地，所述白及粉末粒径为20-40目，例如可以为22目、24目、26目、28目、30目、32目、34目、36目或38目等，优选为24目。
优选地，所述乙醇水溶液的质量分数为75-80%，例如可以为76%、77%、78%或79%等，优选为80%。
优选地，所述提取包括一次提取、二次提取。
优选地，所述一次提取时白及粉末和乙醇水溶液的质量体积比为1g:(10-12) mL，例如可以为1g:10 mL、1g:11 mL或1g:12 mL等，提取时间为1-2.5 h，例如可以为1.2 h、1.4h、1.6 h、1.8 h、2 h、2.2 h或2.4 h等。
优选地，所述二次提取时白及粉末和乙醇水溶液的质量体积比为1g:(6-9) mL，例如可以为1 g:6 mL、1 g:7 mL、1 g:8 mL或1 g:9 mL等，提取时间为1-2 h，例如可以为1.2h、1.4 h、1.6 h或1.8 h等。
上述各项数值范围中的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
本发明提取时采用75-80%的乙醇水溶液可以有效的将白及粉末中的色素和醇溶性杂质去除，得到纯度较高、颜色较浅的白及粉末。
优选地，所述水解酶为果胶酶和半纤维素酶的组合。
优选地，所述水解酶的用量为所述白及块茎药材质量的0.8-1.2%，例如可以为0.8%、0.9%、1.0%、1.1%或1.2%等。
优选地，所述果胶酶与半纤维素酶的质量比为(2-3):(5-9)，例如可以为2:5、2:6、2:7、2:8、2:9、3:5、3:6、3:7、3:8或3:9等，优选为3:5。
优选地，步骤（3）中所述酶解的温度为50-60℃，例如可以为52℃、54℃、56℃、58℃或60℃等，酶解的时间为2-3 h，例如可以为2.2 h、2.4 h、2.6 h、2.8 h或3 h等。
本发明采用复合酶对白及进行酶解，其中果胶酶可以高效地将白及多糖溶出，提高生产效率；半纤维素酶对溶出的多糖再进行水解，得到分子量较小、功效较好的白及甘露低聚糖。
优选地，步骤（3）中所述滤渣与所述水的质量体积比为1g:(10-12) mL，例如可以为1g:10.5 mL、1g:11 mL或1g:11.5 mL等。
优选地，所述冻干的温度为-40~30℃，例如可以为-38℃、-36℃、-34℃或-32℃等，压力为10-30 Pa，例如可以为15 Pa、20 Pa或25 Pa等，时间为24-36 h，例如可以为25 h、27h、29 h、31 h、33 h或35 h等。
优选地，所述一次过滤和所述二次过滤均采用聚丙烯滤膜。
优选地，所述一次过滤采用0.8-1.2 μm聚丙烯滤膜，例如可以为0.8 μm、0.9 μm、1.0 μm、1.1 μm或1.2 μm等，优选为1.0 μm。
优选地，所述二次过滤采用0.4-0.5 μm聚丙烯滤膜例如可以为0.4 μm、0.45 μm或0.5 μm等，优选为0.45 μm。
上述各项数值范围中的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的白及甘露低聚糖在化妆品中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明涉及的白及甘露低聚糖具备较低分子量，可以更好的被皮肤吸收，更有利于在化妆品中的应用，本发明提供的白及甘露低聚糖的制备方法具有生产过程简单，耗时短，制备得到的产物分子量低、功效好等特点。本发明将白及块茎药材进行干燥并粉碎得到白及粉末，增大了药材与溶剂接触面积，减少提取时间，从而提高了提取效率。将提取后的滤渣进行酶解，果胶酶与半纤维素酶复配使用，有效地将提取出的多糖高效、快速进行水解形成低聚糖，降低最终产物中糖的分子量。因此，最终产物白及甘露低聚糖可以更好的被皮肤吸收，更有利于在化妆品中的应用，本发明所制备得到的白及甘露低聚糖具有一定的抗炎症、舒缓抗敏、抗皱紧致等功效。
附图说明
图1为实施例1制备的白及甘露低聚糖分子量测试图；
图2为实施例1制备的白及甘露低聚糖的IL-6测试结果图；
图3为实施例1制备的白及甘露低聚糖的TNF-α抑制率测试结果图；
图4为实施例1制备的白及甘露低聚糖的ROS抑制率测试结果图；
图5为甘露糖对照品的特征谱图；
图6为实施例1制备的白及甘露低聚糖的特征谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
本文所用术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，还可包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。
本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求（即出现次数）无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显只指单数形式。
本发明所描述的术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例性地”、“具体示例”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本文中，对上述术语的示意性表述不是必须针对相同的实施例或示例。
以下实施例中试剂及试药来源如下：
果胶酶：沧州夏盛酶生物技术有限公司，批号：MY20052101；
半纤维素酶：沧州夏盛酶生物技术有限公司，批号：22109028；
白及块茎药材：四川佰草庄园生物科技有限公司。
实施例1
本实施例提供一种白及甘露低聚糖，其制备方法如下：
（1）称取干燥的白及块茎药材100 g，粉碎得到24目白及粉末后与1000 mL的80%乙醇水溶液混合，回流提取1.5 h后收集滤渣，二次提取时将滤渣与700 mL的80%乙醇水溶液混合，回流提取1 h后回收滤渣。
（2）将步骤（1）所得滤渣与10倍量的水、果胶酶0.3 g、半纤维素酶0.5 g混合后在60℃条件下进行保温酶解2.5 h，酶解完成后采用1 μm聚丙烯滤膜进行一次过滤，收集滤液并浓缩得到浸膏。
（3）所得浸膏采用0.45 μm聚丙烯滤膜进行二次过滤，收集滤渣放入冷冻干燥机中，设置温度为-40℃，真空度为20-30 Pa，时长为24-36 h，得到白及甘露低聚糖。
实施例2
本实施例提供一种白及甘露低聚糖，其制备方法如下：
（1）称取干燥的白及块茎药材100 g，粉碎得到24目白及粉末后与1100 mL的75%乙醇水溶液混合，回流提取2.5 h后收集滤渣，二次提取时将滤渣与600 mL的75%乙醇水溶液混合，回流提取1.5 h后回收滤渣。
（2）将步骤（1）所得滤渣与8倍量的水、果胶酶0.2 g、半纤维素酶0.6 g混合后在50℃条件下进行保温酶解3 h，酶解完成后采用1 μm聚丙烯滤膜进行一次过滤，收集滤液并浓缩得到浸膏。
（3）所得浸膏采用0.45 μm聚丙烯滤膜进行二次过滤，收集滤渣放入冷冻干燥机中，设置温度为-40℃，真空度为20-30 Pa，时长为24-36 h，得到白及甘露低聚糖。
实施例3
本实施例提供一种白及甘露低聚糖，其制备方法如下：
（1）称取干燥的白及块茎药材100 g，粉碎得到24目白及粉末后与1200 mL的75%乙醇水溶液混合，回流提取1.5 h后收集滤渣，二次提取时将滤渣与800 mL的75%乙醇水溶液混合，回流提取2 h后回收滤渣。
（2）将步骤（1）所得滤渣与12倍量的水、果胶酶0.3 g、半纤维素酶0.7 g混合后在60℃条件下进行保温酶解2 h，酶解完成后采用1 μm聚丙烯滤膜进行一次过滤，收集滤液并浓缩得到浸膏。
（3）所得浸膏采用0.45 μm聚丙烯滤膜进行二次过滤，收集滤渣放入冷冻干燥机中，设置温度为-40℃，真空度为20-30 Pa，时长为24-36 h，得到白及甘露低聚糖。
实施例4
本实施例提供一种白及甘露低聚糖，其制备方法如下：
其与实施例1的区别仅在于，将果胶酶替换为等质量的半纤维素酶，其他组分、用量及制备方法均与实施例1相同。
实施例5
本实施例提供一种白及甘露低聚糖，其制备方法如下：
其与实施例1的区别仅在于，将半纤维素酶替换为等质量的果胶酶，其他组分、用量及制备方法均与实施例1相同。
实施例6
本实施例提供一种白及甘露低聚糖，其制备方法如下：
其与实施例1的区别仅在于，果胶酶为0.6 g，半纤维素酶为0.2 g，其他组分、用量及制备方法均与实施例1相同。
实施例7
本实施例提供一种白及甘露低聚糖，其制备方法如下：
其与实施例1的区别仅在于，果胶酶为0.1 g，半纤维素酶为0.7 g，其他组分、用量及制备方法均与实施例1相同。
对比例1
本对比例提供一种白及甘露低聚糖，其制备方法如下：
（1）称取干燥的白及块茎药材100 g，粉碎得到24目白及粉末后与1000 mL的80%乙醇水溶液混合，回流提取1.5 h后收集滤渣，二次提取时将滤渣与700 mL的80%乙醇水溶液混合，回流提取1 h后回收滤渣。
（2）将步骤（1）采用1 μm聚丙烯滤膜进行一次过滤，收集滤液并浓缩得到浸膏。
（3）所得浸膏采用0.45 μm聚丙烯滤膜进行二次过滤，收集滤渣放入冷冻干燥机中，设置温度为-40℃，真空度为20-30 Pa，时长为24-36 h，得到白及甘露低聚糖。
对比例2
本对比例提供一种白及甘露低聚糖，其制备方法如下：
（1）称取干燥的白及块茎药材100 g，粉碎得到24目白及粉末后与1000 mL的80%乙醇水溶液混合，回流提取1.5 h后收集滤渣，二次提取时将滤渣与700 mL的80%乙醇水溶液混合，回流提取1 h后回收滤渣。
（2）将步骤（1）所得滤渣与10倍量的水、果胶酶0.3 g、半纤维素酶0.5 g混合后在60℃条件下进行保温酶解1 h，酶解完成后采用1 μm聚丙烯滤膜进行一次过滤，收集滤液并浓缩得到浸膏。
（3）所得浸膏采用0.45 μm聚丙烯滤膜进行二次过滤，收集滤渣放入冷冻干燥机中，设置温度为-40℃，真空度为20-30 Pa，时长为24-36 h，得到白及甘露低聚糖。
对比例3
本对比例提供一种白及多糖，其制备方法如下：
制备方法参照CN113754791A，得到一种白及多糖。CN113754791A公开了白及多糖的测试结果如下表所示：
测试例1
分子量测试
采用凝胶渗透色谱法对实施例1-7和对比例1-2制备得到的白及甘露低聚糖进行分子量测试，称取白及甘露低聚糖样品0.02 g，加入2 mL一级水，静置溶解过滤后，于GPC液相色谱仪上检测，检测器：RID；色谱柱：Waters Ultrahydrogel 1000和WatersUltrahydrogel 150串联；流动相：0.1 mol/L NaNO3水溶液；流速：0.8 mL/min；柱温：40℃；进样量：20 μL。
示例性地，实施例1制备的白及甘露低聚糖分子量测试图如图1所示；分子量测试结果如表1所示：
表1
根据实施例1-7和对比例1-2可知，影响白及甘露低聚糖分子量的因素主要是果胶酶和半纤维素酶的复配比例，最佳配比为果胶酶：半纤维素酶＝3:5，在果胶酶与半纤维素酶的质量比为(2-3):(5-9)的范围内，均可制得分子量402-700 Da的白及甘露低聚糖；根据对比例2可知，酶解时间过短，所得到的白及甘露低聚糖的分子量越大，优选酶解时间为2-3h。
测试例2
抗炎：IL-6抑制实验
本测试例以实施例1-3和对比例1制备得到的白及甘露低聚糖通过脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞(RAW264.7)得到的炎症模型，测定对IL-6（白细胞介素-6）的抑制作用。
实验方法如下：
（1）分组：共分为四组，设置空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和实验组，另设3个无细胞的孔作调零组，按照每组3个复孔进行布板；
（2）接种：当细胞密度达到70%时，弃除培养基，加入5 mL PBS清洗细胞后重新加入4 mL DMEM基础培养基，移液枪吹打细胞至重悬，转移至2 mL离心管中，1000 rpm离心4min，弃上清；重新加入1 mL完全培养基，混匀后，稀释并计数，根据计数的结果将细胞密度调整为1×105 cell/mL，按照每孔200 μL的体积接种细胞至96孔板中，放回培养箱孵育，37℃，通入5%CO2；
（3）配液：将实施例1-3和对比例1制备得到的白及甘露低聚糖分别稀释成187.5 μg/mL，作为实验组的样品待测液；以地塞米松(100 μg/mL)为阳性对照进行实验；以经LPS致炎的巨噬细胞Raw264.7为阴性对照组，以正常的Raw264.7巨噬细胞为空白对照组；
（4）给药：24 h后取出96孔板，弃除旧培养基，按照每组每个浓度3个复孔进行加样，调零孔、空白对照组、阴性对照组和实验组每组3个复孔，每孔加1800 μL基础培养基，阳性对照组每孔加1800 μL地塞米松(100 μg/mL)，然后放回培养箱培养(37℃，5%CO2)；1 h后取出96孔板，调零孔、空白对照组每孔加200 μL基础培养基，阴性对照组、阳性对照组和实验组每孔加200 μL LPS(3 ng/mL)，然后放回培养箱孵育(37℃，5%CO2)；
（5）细胞上清液收集：给药24 h后取出96孔板，分别收集各组对应的细胞上清液至离心管中，1000 rpm离心10 min，收集上清置于2 mL离心管中，4℃储存备用；
（6）测试：利用ELISA试剂盒测定细胞上清中IL-6浓度，测试前30 min取出试剂盒及待测溶液，放置于25℃后使用，测试操作严格按照试剂盒说明书操作。
IL-6抑制率(%)=(LPS刺激组炎症因子浓度-待测物作用组炎症因子浓度)/(LPS刺激组炎症因子浓度-未刺激组炎症因子浓度)×100%。IL-6抑制率越高，说明抗炎效果越好。示例性地，实施例1制备的白及甘露低聚糖的测试结果如图2所示，其中，实验组为实施例1；实施例1-3和对比例1的测试结果如表2所示。
测试例3
舒缓：TNF-α抑制实验（舒缓功效评价：参照T/SHRH 034-2021化妆品舒缓功效测试-体外TNF-α炎症因子含量测定：脂多糖诱导巨噬细胞RAW264.7测试方法）；
本测试例以实施例1-3和对比例1制备得到的白及甘露低聚糖通过脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞(RAW264.7)炎症模型，测定样品对的TNF-α抑制作用。
实验方法如下：
（1）分组：共分为四组，设置空白对照组、阴性対照组、阳性对照组和实验组，另设3个无细胞的孔作调零组，按照每组3个复孔进行布板；
（2）接种：当细胞密度达到70%时，弃除培养基，加入5 mL PBS清洗细胞后重新加入4 mL DMEM基础培养基，移液枪吹打细胞至重悬，转移至2 mL离心管中，1000 rpm离心4min，弃上清；重新加入1 mL完全培养基，混匀后，稀释并计数，根据计数的结果将细胞密度调整为1×105 cell/mL，按照每孔200 μL的体积接种细胞至96孔板中，放回培养箱孵育，37℃，通入5%CO2；
（3）配液：将实施例1-3和对比例1制备得到的白及甘露低聚糖分别稀释成187.5 μg/mL，作为实验组的样品待测液；以地塞米松(100 μg/mL)为阳性对照进行实验；以经LPS致炎的巨噬细胞Raw264.7为阴性对照组，以正常的Raw264.7巨噬细胞为空白对照组；
（4）给药：24 h后取出96孔板，弃除旧培养基，按照每组每个浓度3个复孔进行加样，调零孔、空白对照组、阴性对照组和实验组每组3个复孔，每孔加180 μL基础培养基，阳性对照组每孔加180 μL地塞米松(100 μg/mL)，然后放回培养箱培养(37℃，5%CO2)；1 h后取出96孔板，调零孔、空白对照组每孔加20 μL基础培养基，阴性对照组、阳性对照组和实验组每孔加20 μL LPS(3 ng/mL)，然后放回培养箱孵育(37℃，5%CO2)；
（5）细胞上清液收集：给药24 h后取出96孔板，分别收集各组对应的细胞上清液至离心管中，1000 rpm离心10 min，收集上清置于1.5 mL离心管中，-20℃储存备用；
（6）测试：利用ELISA试剂盒测定细胞上清中TNF-α浓度，测试前30 min取出试剂盒及待测溶液，放置于25℃后使用，测试操作严格按照试剂盒说明书操作。
TNF-α抑制率(%)=(LPS刺激组炎症因子浓度-待测物作用组炎症因子浓度)/(LPS刺激组炎症因子浓度-未刺激组炎症因子浓度)×100%。TNF-α抑制率越高，说明舒缓效果越好。示例性地，实施例1制备的白及甘露低聚糖的测试结果如图3所示，其中，实验组为实施例1；实施例1-3和对比例1的测试结果如表2所示。
测试例4
抗皱紧致：ROS抑制实验（抗皱紧致功效评价：参照TSHRH032-2020化妆品紧致、抗皱功效测试-体外角质形成细胞活性氧抑制测试方法）；
本测试例以实施例1-3和对比例1制备得到的白及甘露低聚糖，以UVB作为外源性氧化剂，诱导人角质细胞内活性氧(ROS)含量升高作为光老化细胞模型，通过比较各实验组细胞内荧光染料DCFH-DA的荧光强度变化来表征活性氧ROS的表达强度。
实验方法如下：
（1）接种：当细胞密度为70%时，弃除培养基，胰蛋白酶消化细胞并重悬，1000 rpm离心4分钟，弃上清；重新加入1 mL完全培养基，吹打混匀后，稀释并计数，根据计数的结果将细胞密度调整为1×105 cell/mL，按照每孔1000 μL的体积接种细胞至24孔板中，放回培养箱孵育，37℃，通入5%CO2；
（2）实验分组：共分为四组，设置空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和实验组，另设3个无细胞的孔作调零组，按照每组3个复孔进行布板；
（3）配液：将实施例1-3和对比例1制备得到的白及甘露低聚糖分别配制为0.02、0.05%溶液作为实验组；以VE醋酸酯(0.02%)为阳性对照进行实验；
（4）给药：24 h后取出24孔板，弃除旧培养基，按照每组每个浓度4个复孔进行加样，空白对照组(BC)和阴性对照组(NC)每孔加1000 μL基础培养基，阳性对照组每孔加1000μL VE醋酸酯溶液(0.02%)，实验组每个浓度4个复孔，每孔加1000 μL对应浓度样品，然后放回培养箱培养(37℃，5%CO2)；
（5）UVB照射：24 h后取出24孔板，对阴性对照组(NC)、阳性对照组(PC)和实验组分别进行15 mJ/cm2的UVB辐照，空白对照组(BC)不辐照。培养箱(37℃、5%CO2、95%相对湿度)中孵育30 min；
（6）ROS检测：吸去细胞培养上清，PBS清洗细胞后，每孔加200 μL探针DCFH-DA，37℃细胞培养箱孵育30 min，弃除DCFH-DA溶液，用PBS清洗细胞3次，用胰酶消化细胞并将细胞收集至2 mL离心管中，2500 rpm离心10 min，弃上清，每管重新加入300 μL PBS重悬细胞，将重悬的细胞悬液按照每孔200 μL加入96孔板中，荧光酶标仪（入射光波长525 nm，激发光波长488 nm）检测荧光强度。示例性地，实施例1制备的白及甘露低聚糖的测试结果如图4所示，其中，实验组为实施例1；实施例1-3和对比例1的测试结果如表2所示：
表2
根据表格数据及对比例3数据可知，本发明采用果胶酶和半纤维素酶进行协同作用增强白及块茎药材的酶解效率，有效地将水提出的多糖高效、快速进行水解形成低聚糖，降低最终产物中糖的分子量，使得制备得到的白及甘露低聚糖更好被皮肤吸收，有利于甘露低聚糖在化妆品中的应用，促进白及甘露低聚糖的抗炎症、舒缓抗敏、抗皱紧致等功效；当白及粉末未进行酶解得到的产物，抗炎症、舒缓抗敏、抗皱紧致功效大大降低。
测试例5
含量测定
测试方法及过程如下：
对照品溶液的制备：精密称取甘露糖对照品，加水配成浓度为0.2 mg/mL的标准品溶液。
供试品溶液的制备：精密称取实施例制备的白及甘露低聚糖粉末50 mg，置于25mL试管中，加水10 mL溶解，再精密量取3 mol/L HCl溶液5 mL，加入上述溶液中，摇匀，密塞，于105℃烘箱中反应1 h；冷却后精密量取3 mol/L NaOH溶液4.2 mL中和至中性，即得供试品溶液。
HAG内标溶液的配制：精密称取盐酸氨基葡萄糖内标品，加水配成浓度为0.15 mg/mL的HAG内标溶液。
0.5 mol/L PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）甲醇溶液的配制：称取0.871 g PMP试剂于10 mL试管中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得。
对照品及白及甘露低聚糖样品衍生化处理：精密量取甘露糖对照品溶液及白及甘露低聚糖样品溶液0.5 mL，分别加入HAG内标液0.5 mL、0.3 mol/L的NaOH水溶液1 mL，摇匀，立即加入0.5 mol/L PMP甲醇溶液0.8mL，摇匀，密塞，于70℃保温反应100 min，放冷，再加入0.3 mol/L HCl溶液1 mL，摇匀，立即用三氯甲烷试剂萃取3次，4 mL/次，弃去三氯甲烷层，收集水层，水层液在3000 rpm条件下于离心机离心10 min，取上清液，备用，0.45 μm滤膜过滤，注入高效液相色谱仪中，测定。
色谱条件与系统适应性试验：用伊利特Hypersil BDS C18 (5 μm,4.6 mm×250mm)柱子，以磷酸盐缓冲液(pH＝6.8)-乙腈(84:16)为流动相等度洗脱；流速1 mL/min，柱温30℃，检测波长为250 nm，进样量10 μL。
甘露糖对照品的特征谱图如图5所示；示例性地，实施例1制备的白及甘露低聚糖的特征谱图如图6所示；根据特征谱图可知，实施例1所制备的白及甘露低聚糖中甘露糖含量为68.66%。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种白及甘露低聚糖，其特征在于，所述白及甘露低聚糖的分子量为402-700 Da。
2.一种如权利要求1所述的白及甘露低聚糖的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
（1）称取白及块茎药材，干燥，粉碎，得到白及粉末；
（2）白及粉末与乙醇水溶液混合后进行提取，回收滤渣；
（3）将步骤（2）所得滤渣与水、水解酶混合后进行保温酶解，一次过滤，滤液浓缩得到浸膏；
（4）将步骤（3）所得浸膏进行二次过滤，冻干，得到白及甘露低聚糖。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述白及粉末粒径为20-40目。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述乙醇水溶液的质量分数为75-80%；
所述提取包括一次提取、二次提取。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述一次提取时白及粉末和乙醇水溶液的质量体积比为1 g:(10-12) mL，提取时间为1-2.5 h；
所述二次提取时白及粉末和乙醇水溶液的质量体积比为1 g:(6-9) mL，提取时间为1-2 h。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述水解酶为果胶酶和半纤维素酶的组合；
所述水解酶的用量为所述白及块茎药材质量的0.8-1.2%；
所述果胶酶与半纤维素酶的质量比为(2-3):(5-9)。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述酶解的温度为50-60℃，酶解的时间为2-3 h。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述滤渣与水的质量体积比为1 g:(10-12) mL。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述一次过滤和所述二次过滤均采用聚丙烯滤膜；
所述一次过滤采用0.8-1.2 μm聚丙烯滤膜；
所述二次过滤采用0.4-0.5 μm聚丙烯滤膜。
10.一种根据权利要求1所述的白及甘露低聚糖在化妆品中的应用。
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