CN110016084A - 一种桑椹蛋白多糖、其制备方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了从桑椹(Fructus Mori)中获得的一种含半乳糖醛酸聚糖的蛋白多糖FMP‑6‑S4，其制备方法，和所述的蛋白多糖FMP‑6‑S4在制备预防和/或治疗神经退行性疾病、抑制Aβ42生成或聚集或阿尔兹海默症的药物或保健品中的用途。所述的蛋白多糖FMP‑6‑S4包含重量百分含量为78％～82％的多糖和重量百分含量为18％～22％的蛋白；所述的多糖的组成为半乳糖醛酸，半乳糖，阿拉伯糖，鼠李糖和葡萄糖。所述蛋白多糖FMP‑6‑S4具有潜在的治疗阿尔兹海默症的作用，有望开发成为一种治疗阿尔兹海默症的药物。

Description

一种桑椹蛋白多糖、其制备方法及用途
技术领域
本发明涉及蛋白多糖类物质、其制备方法及其在制备药物中的用途，更具体地说，涉及一种从桑椹(Fructus Mori)中提取的含半乳糖醛酸聚糖的蛋白多糖FMP-6-S4，其制备方法，和所述的蛋白多糖FMP-6-S4在制备预防和/或治疗神经退行性疾病、抑制Aβ42生成或聚集以及阿尔兹海默症的药物或保健品中的用途。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)亦称为早老性痴呆，是一种渐进性的神经退行性疾病，AD的主要临床表现为记忆力逐渐减退、认知功能发生障碍、行为异常和社交障碍等。随着人口老龄化的不断加剧，AD的发病率也逐年升高，已成为最受公众关注的重要健康问题之一。
β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)在脑内的沉积和异常表达是目前认为引发AD的核心环节。AD的特征性病理变化之一是老年斑(Senile plaques，SPs)的形成，而Aβ是SPs的核心成分，包括Aβ40和Aβ42，其中Aβ42更易发生淀粉样变性。因此，Aβ的聚集和异常沉积是AD发病机制中的首要和中心环节。Aβ是机体的正常代谢产物，由β-淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein，APP)水解而来，在正常情况下它的产生和降解处于动态平衡，当某些原因导致APP代谢异常时，Aβ生成增多和(或)降解减少就会造成Aβ大量沉积。所以，以Aβ为作用靶点，通过干扰APP代谢，从源头上减少Aβ的产生，是目前治疗AD药物的研究热点。
桑椹为桑科植物桑MorasalbaL.的干燥果穗，又名桑果，桑枣，乌椹等，其味甘酸，性寒，归心，肝，肾经，史载于《唐新修本草》具有补血滋阴、生津润燥之功效，用于眩晕耳鸣，心悸失眠，须发早白，津伤口渴，内热消渴，血虚便秘之症等。早在1993年桑椹已成为享有“既是食品又是药品”这一美称的农产品，具有很高的食用和药用价值，是开发功能性食品的优质原料。
桑椹的栽培已经有几千年的历史，广泛分布于亚洲热带，亚热带和温带地区，还有欧洲、南美洲、北美洲和非洲均有不同面积的种植。在我国素有种桑的传统，因此桑椹资源十分丰富，主产于浙江、江苏、湖南、四川、河北、山东、安徽、辽宁、河南和山西。桑椹作为中医临床中传统的补益类中药材，药食兼用。现代研究表明，桑椹中含蛋白多糖、多糖、游离酸和多种氨基酸、鞣酸、维生素及人体缺少的锌、铁、钙、锰等矿物质和微量元素，以及胡萝卜素、果糖、葡萄糖等黄酮类物质和芦丁等药理成份。现代药理研究证明，桑椹有增强免疫、促进机体造血功能以及抗肿瘤、抗衰老、抗疲劳、降糖、降脂、降血压、护肝、增强记忆力等作用。而蛋白多糖作为桑椹中的主要活性物质，在其中起着重要作用。但桑椹蛋白多糖在治疗阿尔茨海默病的作用，尚无报道。所以本发明的桑椹蛋白多糖FMP-6-S4在阿尔茨海默病治疗候选药物方面具有巨大的应用前景。
发明内容
本发明采用一种简单有效的蛋白多糖提取工艺和方法，以干燥的桑椹为原料获得了一种含半乳糖醛酸聚糖的蛋白多糖FMP-6-S4。药理实验表明所述蛋白多糖可以剂量依赖性地抑制稳定转染APP和BACE1(β-site APP-cleaving enzyme 1,β位点APP剪切酶1)的CHO/APPBACE1细胞和稳定转染APP Switish突变的HEK293-APPsw细胞中Aβ42的生成，并且该蛋白多糖能浓度依赖性地抑制Aβ42的聚集。因此，所述的蛋白多糖具有潜在的治疗阿尔兹海默症的作用，有望开发成为一种治疗阿尔兹海默症的糖类药物。
本发明的一个目的是提供一种含半乳糖醛酸聚糖的蛋白多糖。
本发明的另一目的是提供一种从桑椹中提取所述的含半乳糖醛酸聚糖的蛋白多糖的方法。
本发明的另一目的是提供一种包含所述的含半乳糖醛酸聚糖的蛋白多糖的药物组合物。
本发明的另一目的是提供所述蛋白多糖或含有所述蛋白多糖的组合物在制备预防和/或治疗神经退行性疾病的药物或保健品中的用途。
本发明的另一目的是提供所述蛋白多糖或含有所述蛋白多糖的组合物在制备用于抑制Aβ42生成和聚集的药物或保健品中的用途。
本发明的另一目的是提供所述蛋白多糖或含有所述蛋白多糖的组合物在制备预防和/或治疗阿尔兹海默症的药物或保健品中的用途。
本发明的一个方面，提供了一种蛋白多糖FMP-6-S4，包含重量百分含量为78％～82％的多糖和重量百分含量为18％～22％的蛋白；所述的多糖的组成为半乳糖醛酸，半乳糖，阿拉伯糖，鼠李糖和葡萄糖；多糖的结构单元是以1→4连接的α-D-吡喃半乳糖醛酸(GalpA)、1→2连接的α-L-吡喃鼠李糖(Rhap)为主链，而在α-D-吡喃半乳糖醛酸的C-3位上被α-L-吡喃己烯糖醛酸(HexpA)和β-D-吡喃半乳糖醛酸取代，在α-L-吡喃鼠李糖的C-4位上被α-L-呋喃阿拉伯糖(Araf)、1,5-α-L-呋喃阿拉伯糖、β-D-吡喃半乳糖(Galp)或β-D-吡喃葡萄糖(Glcp)、1,6-β-D-吡喃葡萄糖残基取代。
优选地，所述的蛋白多糖FMP-6-S4含有62.13wt.％的半乳糖醛酸、4.50wt.％的阿拉伯糖、3.70wt.％的半乳糖、3.87wt.％的葡萄糖和5.80wt.％的鼠李糖，以及20wt.％的蛋白。
所示的蛋白多糖FMP-6-S4中的多糖具有如结构式I所示的结构单元：
所述蛋白多糖FMP-6-S4的重均分子量的范围为3-120kDa，优选为4-60kDa，更优选为5-30kDa。
在所述的蛋白多糖的红外图谱中，3391.35cm-1为O-H伸缩振动吸收峰，2932.60cm-1为C-H伸缩振动吸收峰，1420.17-1025.94cm-1附近为C-O和糖环振动信号，1721.89cm-1为羧基C＝O伸缩振动，表明该蛋白多糖含有糖醛酸；优选地，所述蛋白多糖FMP-6-S4的红外特征图谱的主要伸缩振动吸收峰与图2所示的红外特征图谱中的基本一致。
在所述蛋白多糖的13C NMR谱中，位于δ109.37处为α-末端己烯糖醛酸的C4信号；位于δ100.46-δ100.54的端基碳信号，分别为α-末端己烯糖醛酸、1,4-半乳糖醛酸和1,3,4-半乳糖醛酸的C1信号；位于δ93.54-δ97.52的端基碳信号，分别为4-α-末端半乳糖醛酸及β-末端的半乳糖醛酸的C1信号；在δ22.94处为鼠李糖的C6乙酰基的信号峰；优选地，所述蛋白多糖FMP-6-S4，其13C NMR谱的主要信号值与图3所示的13C NMR谱基本一致。
本发明另一个方面，提供了一种蛋白多糖FMP-6-S4的制备方法，包括以下步骤：
a.蛋白多糖提取：
干燥的桑椹，粉碎，酶联水提，灭酶，离心，将所得滤液浓缩，透析、浓缩、离心、醇沉、离心、洗涤、干燥，得酶联水提桑椹粗蛋白多糖；
优选地，所述步骤a包括：干燥的桑椹经粉碎机粉碎，加入约15～20倍重量的水，于50～55℃下，分别加入桑椹重量的2～3％纤维素酶、桑椹重量的1～3％淀粉酶及桑椹重量的0.5～2％木瓜蛋白酶提取1～3h后，将温度升至100℃以上使酶失活，离心，滤液浓缩，透析，再浓缩，离心后，加入约五倍～十倍于上清液体积的乙醇，离心得沉淀，沉淀经有机溶剂无水乙醇与丙酮洗涤三～六次，经真空干燥得酶联水提桑椹粗蛋白多糖，
进一步优选，所述步骤a包括：干燥的桑椹经粉碎机粉碎，加入约20倍重量的去离子水，于55℃下，分别加入桑椹重量的3％纤维素酶、桑椹重量的1％淀粉酶及桑椹重量的0.5％木瓜蛋白酶提取1h后，将温度升至100℃使酶失活，离心，滤液浓缩，透析，再浓缩，得浓缩液后，加入约五倍于浓缩液体积的乙醇，离心得沉淀，沉淀经无水乙醇与丙酮交替洗涤三次，经真空干燥得酶联水提桑椹粗蛋白多糖；
b.蛋白多糖纯化：
b1.取步骤a制备的桑椹粗蛋白多糖，水溶解，离心，上清液经阴离交换柱进行初步分级纯化，依次以水和0.05～0.3M的NaCl溶液洗脱，收集约0.2M NaCl溶液的洗脱组分，得蛋白多糖FMP-6，
优选地，所述步骤b包括：b1.取桑椹粗蛋白多糖，加入约10～20倍重量的水中溶解，离心，上清液经阴离交换柱分离，依次以去离子水、0.05M、0.1M、0.2M及0.3M NaCl溶液洗脱，硫酸-苯酚检测，收集合并约0.2M NaCl溶液的洗脱液，浓缩，离心，取上清液透析，冷冻干燥，得初步纯化的蛋白多糖FMP-6；
b2.将步骤b1制备的蛋白多糖FMP-6溶于约0.01～1倍重量的0.2M NaCl溶液中，离心，上清液经凝胶色谱柱分离，收集合并蛋白多糖FMP-6-S4这一组分，浓缩，透析，冷冻干燥，得所述蛋白多糖FMP-6-S4；
进一步优选地，所述步骤b包括：b1.取步骤a制备的桑椹粗蛋白多糖，加入约10倍重量的水中溶解，离心，上清液经DEAE Sepharose Fast Flow阴离交换柱分离，依次以去离子水、0.05M、0.1M、0.2M及0.3M NaCl溶液洗脱，硫酸-苯酚检测，收集合并0.2M NaCl溶液的洗脱液，浓缩，离心，取上清液透析，冷冻干燥，得初步纯化的蛋白多糖FMP-6；
b2.将步骤b1制备的蛋白多糖FMP-6溶于约0.01倍重量的约0.2M NaCl溶液中，离心，上清液经Sephacryl HR S-300凝胶色谱柱分离，硫酸-苯酚法检测，收集合并蛋白多糖FMP-6-S4这一组分，浓缩，透析，冷冻干燥，得所述蛋白多糖FMP-6-S4。
在上述步骤(a)或(b)中，
所述的乙醇可以为约70％v/v以上的乙醇水溶液，优选为约85％v/v以上的乙醇水溶液，更特别为约95％v/v以上的乙醇水溶液。
所述的提取可以进行一次或多次，例如1、2、3次或3次以上。
蛋白多糖结构鉴定：所述的蛋白多糖FMP-6-S4通过对其单糖组成、甲基化、红外及核磁等进行综合解析，确定其结构。
本发明的另一方面提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的上述的蛋白多糖FMP-6-S4作为活性成分，该组合物可以进一步包括药剂学上可接受的药物辅料，例如载体、赋形剂、佐剂和/或稀释剂等。
本发明的又一方面，提供了上述的蛋白多糖FMP-6-S4或含有其的药物组合物在制备用于治疗和/或预防神经退行性疾病药物或保健品中的用途。所述神经退行性疾病可以是由β淀粉样蛋白在脑内的异常表达和沉积所引起的疾病，例如，阿尔兹海默症。
本发明的又一方面，还提供了上述的蛋白多糖FMP-6-S4或含有其的药物组合物在制备用于抑制Aβ42生成和聚集的药物或保健品中的用途。
本发明的又一方面，还提供了一种抑制Aβ42生成和聚集的方法，以及预防和/或治疗阿尔兹海默症的方法，所述方法包括向需要该治疗的对象给药治疗有效量的选自上述蛋白多糖FMP-6-S4或含有其的药物组合物。
本发明中，所述的“酶联水提”是指选用合适的酶(例如，纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶或木瓜蛋白酶等)对原料进行预处理，从而破坏细胞壁的构成，产生局部的坍塌、溶解、疏松，再加水煮取汁的方法，该方法能减少溶剂提取时来自细胞壁和细胞间质的阻力，加快有效成分溶出细胞的速率，提高提取效率，缩短提取时间。在本发明的优选实施方式中，所述的酶联水提采用纤维素酶、淀粉酶及木瓜蛋白酶在55℃-60℃下提取1h后，将温度升至100℃灭酶，继续保持在100℃下水提取1小时。
附图说明
图1为桑椹蛋白多糖FMP-6-S4特征高效液相色谱图；
图2为桑椹蛋白多糖FMP-6-S4的特征红外光谱图；
图3为桑椹蛋白多糖FMP-6-S4的特征13C NMR图谱；
图4为桑椹蛋白多糖FMP-6-S4-01a的特征13C NMR图谱；
图5为桑椹蛋白多糖FMP-6-S4抑制CHO/APPBACE1细胞和HEK293-APPsw中Aβ42分泌量的柱状图；
图6为桑椹蛋白多糖FMP-6-S4对CHO/APPBACE1细胞活力影响的折线图；
图7为桑椹蛋白多糖FMP-6-S4抑制Aβ42聚集的折线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的阐述，以下实施方式只以举例的方式描述本发明。很明显，本领域普通技术人员可在本发明的范围和实质内，对本发明进行各种变通和修改。
高效凝胶渗透色谱采用Shodex SUGARKS-802(8.0mm×300mm，美国Agilent公司)和Shodex SUGARKS-804(8.0mm×300mm，美国Agilent公司)串联柱，以用不同分子量的T-系列标准葡聚糖(Dextran)制作标准曲线；
氨基酸自动分析仪采用ZoRBAX eclipse-AAA氨基酸分析柱(3.5μm,3.0×150mm美国Agilent公司)，利用Agilent 1100Seri高效液相系统测定(美国Agilent公司)；
高效液相色谱(HPLC)采用Agilent 1260Seri高效液相系统测定(美国Agilent公司)；
红外分析采用Perkin-Elmer 599B型红外分光光度计测定(美国Perkin-Elmer公司)；
核磁共振分析采用BruckerAM-500型核磁共振仪测定(德国Brucker公司)。
实施例1桑椹蛋白多糖FMP-6-S4的制备
a.蛋白多糖提取：
干燥的桑椹1kg经粉碎机粉碎，加入20L的去离子水，于55℃下，再分别加入30g纤维素酶、10g淀粉酶及5g木瓜蛋白酶提取1h后，将温度升至100℃灭酶，离心，滤液浓缩，对流动水透析3天。将透析内液加热浓缩至3L，离心弃去沉淀，将上清液在搅拌下加入五倍体积(15L)的95％v/v乙醇，静置醇沉过夜，离心分离，所得沉淀用无水乙醇与丙酮交替洗涤3次，离心取沉淀于50℃下真空干燥，得酶水联提桑椹粗蛋白多糖152g(收率15.2％)。
b.蛋白多糖纯化：
取上述制备的桑椹粗蛋白多糖6g，80mL的去离子水溶解，4000r/min离心10min除去不溶物，上清液经DEAE Sepharose Fast Flow阴离交换柱进行分离，依次以去离子水、0.05M、0.1M、0.2M及0.3M NaCl洗脱，硫酸-苯酚检测，并绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集合并0.2M NaCl洗脱液，浓缩，离心，取上清液透析，冷冻干燥，得初步纯化的蛋白多糖FMP-6约824mg(收率:13.7％)。取200mg FMP-6溶于4mL的0.2M NaCl溶液中，4000r/min离心10min，上清液经Sephacryl HR S-300凝胶色谱柱，以0.2M NaCl溶液洗脱并控制流速5mL/15min。硫酸-苯酚法检测并绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集合并蛋白多糖FMP-6-S4组分，浓缩，透析，冷冻干燥，得蛋白多糖FMP-6-S4约30mg(收率15％)。
蛋白多糖FMP-6-S4结构鉴定及解析：
①经高效凝胶渗透色谱(high performance gel permeation chromatography，HPGPC)测定蛋白多糖FMP-6-S4相对分子质量为11.23kDa，其纯度达89.78％(图1，图中的小尖峰为溶剂峰)。
将还原前后蛋白多糖FMP-6-S4的完全水解样品经PMP衍生法测其单糖组成，并用GC-MS进行甲基化分析。综合对原糖、还原的以及部分酸水解的次级蛋白多糖的糖组成，甲基化，确定蛋白多糖FMP-6-S4主要含有半乳糖醛酸，少量的半乳糖，阿拉伯糖，鼠李糖和葡萄糖，其中半乳糖醛酸，阿拉伯糖，半乳糖，葡萄糖和鼠李糖的质量比为62.13:4.50:3.70:3.87:5.80。除此外，经蛋白含量测定，蛋白多糖FMP-6-S4的蛋白含量为20wt.％。通过氨基酸自动分析仪测出蛋白主要含有天冬氨酸，谷氨酸，甘氨酸，精氨酸，亮氨酸和脯氨酸，其质量比为4.33：7.27：1.77：1.99：1.61：3.11。
②红外图谱(图2)，3391.35cm-1为O-H伸缩振动吸收峰，2932.60cm-1为C-H伸缩振动吸收峰，1417.98-1099.24cm-1附近为C-O和糖环振动信号，1720cm-1为羧基C＝O伸缩振动，表明该蛋白多糖FMP-6-S4含有糖醛酸。
③蛋白多糖FMP-6-S4的部分酸水解，
取蛋白多糖FMP-6-S4100mg溶解于10mL的0.1M三氟乙酸中，密封后于100℃水解1h。反应完毕后，用甲醇反复减压蒸干，后用去离子水透析(1L×4)，透析内液浓缩、冷冻干燥得到部分酸水解产物蛋白多糖FMP-6-S4-01a，经高效液相色谱法HPLC鉴定为均一多糖，其尖峰分子量为7.6kDa，其纯度达88.31％。蛋白多糖FMP-6-S4-01a完全水解后经1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生法测其单糖组成，分析主要由87.01wt.％半乳糖醛酸和12.99wt.％鼠李糖组成。
④NMR分析
取蛋白多糖35mg，加D2O 0.5mL溶解，加2.5μL丙酮为内标(δH＝2.29ppm，
δC＝31.5ppm)，于BrukerAVANCE III 500M核磁共振仪上，25℃分别测定一维和二维核磁共振谱，并参考核磁图谱对蛋白多糖FMP-6-S4中多糖进行结构确证，结果如图4和图5所示。
在蛋白多糖FMP-6-S4的13C NMR谱中(图3)，异头碳区域内，δ109.37、δ100.54、δ100.46、δ97.52、δ93.54、信号分别归属于α-L-吡喃己烯糖醛酸、1,4-α-D-半乳糖醛酸、1,3,4-α-D-半乳糖醛酸、末端连接的-β-D-吡喃半乳糖醛酸、4-α-D-吡喃半乳糖醛酸。δ175.70信号归属于1,4-α-D-吡喃半乳糖醛酸与1,3,4-α-D-吡喃半乳糖醛酸羧基碳的信号峰。δ169.20及δ145.39归属于α-末端己烯糖醛酸C6和C5的信号峰。
在蛋白多糖FMP-6-S4-01a的13C NMR谱中(图4),异头碳区域内，δ100.93和δ100.32信号分别归属于1,4-α-D-吡喃半乳糖醛酸和1,2-α-L-吡喃鼠李糖，δ174.85和δ17.79的信号峰分别为1,4-α-D-吡喃半乳糖醛酸的C-6位羧基与1,2-α-L-吡喃鼠李糖的甲基碳信号峰。
综合以上结果表明蛋白多糖FMP-6-S4以1,4-α-D-半乳糖醛酸及1,2-α-L-鼠李糖为主链结构，在半乳糖醛酸的C-3和鼠李糖的C-4位上有分支。1,4-α-D-半乳糖醛酸C-3的分支主要由末端连接的α-L-吡喃己烯糖醛酸和末端的β-D-吡喃半乳糖醛酸组成。1,2-α-L-鼠李糖的C-4的分支上含有痕量的α-L-呋喃阿拉伯糖，1,5-α-L-呋喃阿拉伯糖、末端的β-D-吡喃半乳糖或β-D-吡喃葡萄糖，1,6-β-D-葡萄糖残基组成；所述蛋白多糖FMP-6-S4中的多糖具有如结构式I所示的结构单元：
实施例2.蛋白多糖FMP-6-S4抑制Aβ42的生成
1.CHO/APPBACE1细胞及HEK 293-APPsw细胞中Aβ42的ELISA检测
CHO/APPBACE1细胞(来源于中国科学院上海药物研究所)培养于含10％胎牛血清(购自美国Gibco公司)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的Ham’s F12培养基中(购自美国Hyclone公司)，HEK293-APPsw细胞(受赠于中国科学院上海药物研究所章海燕课题组)培养于含10％胎牛血清，100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素及200μg/mL G418的DMEM高糖培养基中。待细胞长至80％-90％汇合度，以5×105个/孔的密度种于24孔板中，于5％CO2、37℃培养箱中培养24h后，加入配置成不同浓度(0μg/mL、31.25μg/mL、62.5μg/mL、125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL及1000μg/mL)的桑椹多糖FMP-6-S4(实施例1制备)，24h后，收集细胞上清液。
采用HumanAβ42ELISA试剂盒(购自美国Invitrogen公司)检测上清液中Aβ42的量，具体方法如下：
1)将用标准稀释液(试剂盒中自带)稀释的标准品(Aβ42标准品母液用55mM碳酸氢钠(pH 9.0)配制，分装保存于-80℃)或者待测样品加入到ELISA孔板中(已包被好捕获抗体，试剂盒自带)，每孔50μL；
2)每孔加入50μL的检测抗体，于摇床上室温孵育3h；
3)洗涤5次(洗涤液，由试剂盒中自带的洗涤液浓缩液按1:25稀释，用Milli QH2O稀释)，加入HRP-链亲和素(1:100稀释)，每孔100μL，室温孵育30min；
4)洗涤5次，加入3,3’,5,5’-四甲基联苯胺二盐酸显色底物(TMB)，每孔100μL，室温避光孵育30min，加入终止液(试剂盒自带)；
5)用酶标仪(购自德国BMG Labtech公司)在450nm波长下采集每孔OD读数。结果如图5所示，桑椹多糖FMP-6-S4可以浓度依赖性地抑制CHO/APPBACE1细胞(A)和HEK293-APPsw细胞(B)中Aβ42的生成，其中，*，p＜0.05，**，p＜0.01，***，p＜0.001，表示同对照组(0μg/mL)相比的显著性差异程度。
2.MTT实验检测桑椹蛋白多糖FMP-6-S4对CHO/APPBACE1细胞生长的影响对数生长期的CHO/APPBACE1细胞(5×103个/孔)种入96孔板中，设三复孔，于培养箱中培养24h；吸去细胞上清液，加入终浓度分别为7.8125μg/mL、15.625μg/mL、31.25μg/mL、62.5μg/mL、125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL及1000μg/mL的蛋白多糖FMP-6-S4溶液，继续培养24h，48h及72h后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液10μL(购自美国sigma公司，PBS配制，经0.22μm微孔滤膜过滤)，继续培养4h后吸去孔内的细胞培养液，每孔加入100μLDMSO(二甲基亚砜)溶解形成的紫色结晶物即甲瓚，用酶标仪在490nm下采集吸光度。细胞存活率按照以下公式进行计算：细胞存活率＝(实验组OD值－空白组OD值)/(对照组OD值－空白组OD值)×100％。结果如图6所示，不同浓度的蛋白多糖FMP-6-S4分别处理细胞24h、48h及72h后，细胞的存活率分别均超过90％，说明蛋白多糖FMP-6-S4基本无毒性。
3.硫磺素T结合实验检测蛋白多糖FMP-6-S4对Aβ42聚集的影响
1)将从-80℃冰箱新鲜取出的淀粉样蛋白42-Aβ42粉末(购自美国rpeptide公司)溶解于110μL无水DMSO(购自美国Fluka公司)中，制备成2mM的Aβ42储存液；
2)取1μLAβ42储存液溶于19μL纤维形成缓冲液fibril-formation buffer(50mM磷酸钠，pH 7.5；100mM NaCl溶液，超纯水配制，0.22μm滤膜过滤后使用)中，此组为Aβ42单独孵育组。取1μLAβ42储存液溶于9μL fibril-formation buffer，再加入10μL浓度分别为0.25mg/mL，0.5mg/mL，1mg/mL的蛋白多糖FMP-6-S4溶液(不同浓度的蛋白多糖FMP-6-S4溶液分别用fibril-formation buffer配制)，以上各组溶液充分混匀后放置37℃恒温培养箱中孵育30min；
3)向2)中各组中加入80μL 6.25μM的ThT溶液(50mM甘氨酸溶液，pH＝8.5)，使得Aβ42在各个组的终浓度为20μM，蛋白多糖FMP-6-S4在蛋白多糖与Aβ42孵育组各组中的浓度分别为25μg/mL，50μg/mL和100μg/mL，充分混匀后加入到黑色的荧光检测96孔板中(购自美国Greiner公司)放置37℃恒温培养箱中孵育；
4)每间隔一定时间取出孔板，用酶标仪检测各孔的读数，检测波长为Ex＝430nm,Em＝490nm。
结果如图7所示，随着检测时间点的推移，不同浓度的蛋白多糖FMP-6-S4能不同程度地降低ThT的荧光强度，且浓度越高抑制越明显，也就是说蛋白多糖FMP-6-S4可以浓度依赖性地抑制Aβ42的聚集。
综上，通过实施例可知，从桑椹中提取的含半乳糖醛酸聚糖的蛋白多糖FMP-6-S4，可以浓度依赖性地抑制CHO/APPBACE1细胞中和HEK293-APPsw细胞中Aβ42的生成，并且可以浓度依赖性地抑制Aβ42的聚集。因此，蛋白多糖FMP-6-S4有望成为治疗阿尔兹海默症的潜在蛋白多糖药物。
最后有必要说明的是，以上实施例仅用于进一步详细地说明本发明的技术方案，不能理解为对本发明保护范围的限制，任何根据本发明的上述内容作出的一些非本质的调整和改进均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种蛋白多糖FMP-6-S4，其特征在于，包含重量百分含量为78％～82％的多糖和重量百分含量为18％～22％的蛋白；所述的多糖的组成为半乳糖醛酸，半乳糖，阿拉伯糖，鼠李糖和葡萄糖。
2.根据权利要求1所述的蛋白多糖FMP-6-S4，其特征在于，所述的多糖的结构单元是以1→4连接的α-D-吡喃半乳糖醛酸、1→2连接的α-L-吡喃鼠李糖为主链，而在α-D-吡喃半乳糖醛酸的C-3位上被α-L-吡喃己烯糖醛酸和β-D-吡喃半乳糖醛酸取代，在α-L-吡喃鼠李糖的C-4位上被α-L-呋喃阿拉伯糖、1，5-α-L-呋喃阿拉伯糖、β-D-吡喃半乳糖或β-D-吡喃葡萄糖、1，6-β-D-吡喃葡萄糖残基取代。
3.根据权利要求1所述的蛋白多糖FMP-6-S4，其特征在于，所述的多糖具有如结构式I所示的结构单元：
4.根据权利要求1所述的蛋白多糖FMP-6-S4，其特征在于，所述的蛋白多糖FMP-6-S4的重均分子量的范围为3-120kDa。
5.一种制备蛋白多糖FMP-6-S4的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
a.蛋白多糖提取：
干燥的桑椹，粉碎，酶联水提，灭酶，离心，将所得滤液浓缩，透析、浓缩、离心、醇沉、离心、洗涤、干燥，得酶联水提桑椹粗蛋白多糖；
b.蛋白多糖纯化：
b1.取步骤a制备的桑椹粗蛋白多糖，水溶解，离心，上清液经阴离交换柱进行初步分级纯化，依次以水和0.05～0.3M的NaCl溶液洗脱，收集约0.2M NaCl溶液的洗脱组分，得蛋白多糖FMP-6；
b2.将步骤b1制备的蛋白多糖FMP-6溶于约0.01～1倍重量的0.2M NaCl溶液中，离心，上清液经凝胶色谱柱分离，收集合并蛋白多糖FMP-6-S4这一组分，浓缩，透析，冷冻干燥，得所述蛋白多糖FMP-6-S4。
6.根据权利要求5所述的制备蛋白多糖FMP-6-S4的方法，其特征在于，
所述步骤a包括：干燥的桑椹经粉碎机粉碎，加入约15～20倍重量的水，于50～55℃下，分别加入桑椹重量的2～3％纤维素酶、桑椹重量的1～3％淀粉酶及桑椹重量的0.5～2％木瓜蛋白酶提取1～3h后，将温度升至100℃以上使酶失活，离心，滤液浓缩，透析，再浓缩，离心后，加入约五倍～十倍于上清液体积的乙醇，离心得沉淀，沉淀经有机溶剂无水乙醇与丙酮洗涤三～六次，经真空干燥得酶联水提桑椹粗蛋白多糖，
所述步骤b包括：b1.取桑椹粗蛋白多糖，加入约10～20倍重量的水中溶解，离心，上清液经阴离交换柱分离，依次以去离子水、0.05M、0.1M、0.2M及0.3MNaCl溶液洗脱，硫酸-苯酚检测，收集合并约0.2M NaCl溶液的洗脱液，浓缩，离心，取上清液透析，冷冻干燥，得初步纯化的蛋白多糖FMP-6；
b2.将步骤b1制备的蛋白多糖FMP-6溶于约0.01～1倍重量的0.2M NaCl溶液中，离心，上清液经凝胶色谱柱分离，收集合并蛋白多糖FMP-6-S4这一组分，浓缩，透析，冷冻干燥，得所述蛋白多糖FMP-6-S4。
7.根据权利要求5所述的制备蛋白多糖FMP-6-S4的方法，其特征在于，
所述步骤a包括：干燥的桑椹经粉碎机粉碎，加入约20倍重量的去离子水，于55℃下，分别加入桑椹重量的3％纤维素酶、桑椹重量的1％淀粉酶及桑椹重量的0.5％木瓜蛋白酶提取1h后，将温度升至100℃使酶失活，离心，滤液浓缩，透析，再浓缩，得浓缩液后，加入约五倍于浓缩液体积的乙醇，离心得沉淀，沉淀经无水乙醇与丙酮交替洗涤三次，经真空干燥得酶联水提桑椹粗蛋白多糖；
所述步骤b包括：
b1.取步骤a制备的桑椹粗蛋白多糖，加入约10倍重量的水中溶解，离心，上清液经DEAESepharose Fast Flow阴离交换柱分离，依次以去离子水、0.05M、0.1M、0.2M及0.3M NaCl溶液洗脱，硫酸-苯酚检测，收集合并0.2M NaCl溶液的洗脱液，浓缩，离心，取上清液透析，冷冻干燥，得初步纯化的蛋白多糖FMP-6；
b2.将步骤b1制备的蛋白多糖FMP-6溶于约0.01倍重量的约0.2M NaCl溶液中，离心，上清液经Sephacryl HR S-300凝胶色谱柱分离，硫酸-苯酚法检测，收集合并蛋白多糖FMP-6-S4这一组分，浓缩，透析，冷冻干燥，得所述蛋白多糖FMP-6-S4。
8.一种药物组合物，其包含权利要求1-4中任一项所述的蛋白多糖FMP-6-S4作为活性成分。
9.如权利要求8所述的药物组合物，其进一步包括药剂学上可接受的药物辅料。
10.权利要求1所述的蛋白多糖FMP-6-S4或权利要求8或9所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防治疗神经退行性疾病、抑制Aβ42生成或聚集或阿尔兹海默症的药物或保健品中的用途。
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