CN110642962A - 一种杂豆类果胶多糖的分离纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种杂豆类果胶多糖的分离纯化方法。该方法以三种不同种属的杂豆，包括红小豆、白扁豆、红芸豆为原料，通过超微粉碎，热水提取，均孔强酸性苯乙烯系填料柱吸附结合乙醇醇沉，进而从杂豆中快速、高效地制备出果胶多糖含量高达约90％的杂豆精制多糖，杂豆精制多糖再经过凝胶柱分离纯化，最终制备获得均一性良好的杂豆类果胶多糖。本发明从提取到分离整体方法快速、稳定性好，所获得杂豆类果胶多糖纯度高、品质好。

Description

一种杂豆类果胶多糖的分离纯化方法
技术领域
本发明涉及植物多糖分离纯化的技术领域，具体涉及一种，杂豆类果胶多糖的分离纯化方法。
背景技术
杂豆(Pulses)是指除大豆之外的小宗淀粉质豆类的总称，主要包括豌豆、蚕豆、红小豆、扁豆、豇豆、芸豆、鹰嘴豆等，其具有高蛋白、低脂肪、低致敏性等特点，且价格低廉。《中国居民膳食指南(2016)》提倡把全谷物、杂豆和薯类作为膳食的重要组成部分，建议每天摄入全谷物和杂豆类50～150g。中国是杂豆的生产大国，杂豆资源丰富，然而较低的利用率却使杂豆资源浪费严重；另外，杂豆在产品端的单一性与低劣的品质使得相关产品的销售低迷，资源优势难以施展，制约了杂豆相关产业的发展。而杂豆中的水溶性多糖(可溶性膳食纤维)具有多种生物活性，如降血糖、抗氧化、预防结肠癌等，其既可被开发成多糖相关的高附加值产品，又能满足大众对营养、健康的需求。
因此，为提高杂豆的资源利用率及开发价值，应加大对杂豆多糖的研究。而杂豆多糖的提取与分离纯化作为研究前端的重要环节，在此过程中显得尤为重要。然而，对比当前有关杂豆多糖的研究不难发现：(1)杂豆多糖富含酸性多糖，其生物活性尤其是降血糖活性被广泛关注；(2)杂豆多糖的提取工艺研究较少，提取效率低；(3)杂豆多糖，如菜豆多糖、鹰嘴豆多糖及豌豆多糖等的分离纯化以阴填料DEAE Sepharose Fast Flow为主，该法洗脱步骤繁琐、成本较高且效率低下，不利于工业化生产；(4)发明人发现尚未有同时采用多种杂豆类多糖的提取及分离纯化技术进行专门的研究，建立针对杂豆这一类资源中多糖的分离纯化模式。综上，关于杂豆多糖提取及分离纯化的问题集中在分离效率低、分离方法杂，难工业化生产，更无适用于杂豆这一类多糖有效的分离纯化方法的相关研究。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种杂豆类果胶多糖的分离纯化方法，通过超微粉碎，热水提取，均孔强酸性苯乙烯系填料柱吸附结合乙醇醇沉，以及凝胶柱分离使得该工艺从提取到分离整体快速、高效、稳定且所得杂豆类果胶多糖纯度高、品质好。
为了实现上述目的，本发明提供一种杂豆类果胶多糖的分离纯化方法，包括如下步骤：
(1)杂豆多糖提取：
采用超微粉碎法处理杂豆原料，收集过250目筛的细微粉末，加入乙醇进行脱脂，干燥后的杂豆粉采用热水反复提取两次，合并提取液，依次加入α-淀粉酶、蛋白酶、糖化酶进行酶解除去提取液中的淀粉和蛋白质，然后灭酶10min，再用转速为8000r/min离心10min，取上清液进行真空浓缩，加入乙醇，静置，沉淀复溶，再经透析，冷冻干燥获得杂豆粗多糖；
(2)杂豆精制多糖制备：
将步骤(1)制得的杂豆粗多糖溶于去离子水，离心，取上清液至均孔强酸性苯乙烯系填料柱进行纯化，并反复水洗，水洗液浓缩后乙醇醇沉、冻干，获得杂豆精制多糖；
(3)杂豆果胶多糖制备：
将步骤(2)制得的杂豆精制多糖溶于NaCl溶液，离心去除不溶物，通过凝胶层析柱以NaCl溶液进行洗脱，制备得分子质量分布均一的杂豆类果胶多糖。
优选地，步骤(2)所述的均孔强酸性苯乙烯系填料纯化方法如下：将预活化好的均孔强酸性苯乙烯系填料装入内径26mm×长度600mm规格的玻璃层析柱，并用去离子水进行平衡，然后称取步骤(1)制得的杂豆粗多糖，用去离子水配制成浓度为30mg/mL～100mg/mL的杂豆粗多糖溶液，10000r/min离心10min，取上清液5mL～15mL滴加到所述的均孔强酸性苯乙烯系填料玻璃层析柱上端，待样品与填料充分吸附，然后采用流速为3BV/h进行水洗脱，收集水洗液，真空浓缩，按浓缩液体积比2～5加入乙醇醇沉，冷冻干燥。
优选地，步骤(3)所述的凝胶柱纯化方法如下：称取步骤(2)制得的杂豆精制多糖，用0.1mol/L～0.2mol/L NaCl溶液配制成浓度为30mg/mL～100mg/mL的杂豆精制多糖溶液，10000r/min离心10min，取上清液重复上样至内径26mm×长度600mm规格的Sephacryl S-400HR凝胶柱，再以0.1mol/L～0.2mol/L NaCl溶液以流速为1.0mL/min至2.0mL/min等梯度洗脱，按照峰形收集洗脱液，浓缩，而后用截留分子量为3.5kDa的透析袋透析48h，冷冻干燥。
优选地，步骤(1)中所用的杂豆原料为红小豆、白扁豆和红芸豆中的至少一种。
优选地，步骤(1)所述的加入乙醇进行脱脂，其乙醇的浓度为体积比浓度80％～100％。
优选地，步骤(1)所述的干燥后的杂豆粉进行热水反复提取两次，其提取条件的温度为80℃～100℃，提取时间为1.5h～3h。
优选地，步骤(1)所述的酶α-淀粉酶、蛋白酶、糖化酶，其酶解条件为：α-淀粉酶为温度95℃、时间1.5h；蛋白酶为温度60℃、时间0.5h、pH 4.5；糖化酶为温度60℃、时间0.5h。
优选地，步骤(1)所述的灭酶10min，其灭酶时的温度为95℃～100℃。
优选地，步骤(1)所述的取上清液进行真空浓缩，加入乙醇，静置，所用乙醇的体积为于浓缩液体积的3.5～5.5倍，浓度为体积浓度比90％～100％，静置的温度为0℃～4℃。
优选地，步骤(3)获得的所述杂豆果胶类多糖重均分子质量为300～800kDa，单糖组成阿拉伯糖为1％～20％、半乳糖为20％～40％、木糖为5％～30％、半乳糖醛酸为5％～30％、葡萄糖醛酸为0～10％。
本发明对使用本发明方法制备的杂豆类果胶多糖进行了基本理化性质测定，包括多糖得率、中性糖含量、糖醛酸含量、分子质量分布及单糖组成:
(1)粗多糖得率/％＝(W粗多糖/W原料)×100％，
精制多糖回收率/％＝(W精制后多糖/W精制前多糖)×100％
果胶多糖回收率/％＝(W果胶多糖/W纯化前多糖)×100％
(2)杂豆类多糖的中性糖含量、糖醛酸含量分别通过苯酚-硫酸法、咔唑-硫酸法测定，单糖组成通过完全酸水解结合离子色谱-脉冲安培法(HPAEC-PAD)测定。
(3)纯度鉴定：分子质量分布通过高效凝胶渗透色谱(HPGPC)测定。
红小豆、白扁豆、红芸豆多糖纯组分，经鉴定为分子质量分布均一的果胶类多糖，所述杂豆果胶多糖重均分子质量为300kDa～800kDa，单糖组成阿拉伯糖为1％～20％、半乳糖为20％～40％、木糖为5％～30％、半乳糖醛酸为5％～30％、半乳糖醛酸为0～10％。
本发明的积极效果如下：
(1)本发明采用化学方法、物理方法结合现代仪器分析技术发现：研究提取的杂豆类粗多糖存在共性，既含有酸性果胶多糖，又含有许多阳离子性质的杂质成分。该发现并不属于植物成分分离纯化领域的公知、常识。发明人据此杂豆类多糖的共性采用多种分离方法同时分离不同杂豆来源多糖，最终筛选并建立了“超微粉碎→热水提取→均孔强酸性苯乙烯系填料吸附→凝胶柱分离”这一适用于杂豆类酸性果胶多糖的分离模式。
(2)本发明对三种具有代表性的不同种属的杂豆(红小豆、白扁豆、红芸豆)的分离纯化工艺进行探索，发现仅通过均孔强酸性苯乙烯系填料吸附结合乙醇醇沉方法，即可从杂豆中快速、高效地制备出高纯度的精制杂豆果胶多糖，杂豆果胶多糖含量可提高至50％左右，同时该法可明显缩短纯化时间、简化纯化流程且易于大规模制备。
(3)本发明针对资源丰富的杂豆类原料，制备得到均一性良好的杂豆果胶多糖，本技术方案在该类原料及相关原料多糖的提取、分离工作中普适性强、推广性好，可为后续其功能活性的研究及工业化应用提供技术支撑与参考。
(4)本发明的技术方案安全，无污染，实用与经济价值高，具有良好的经济前景。
附图说明
图1为本发明实施例1至3的三种杂豆粗多糖分子质量分布图。
图2为本发明的实施例1至3的三种杂豆多糖均孔强酸性苯乙烯系填料纯化前后对比图。
图3为本发明的对比实施例2至4的三种对比例纯化方法组分VAP-D-F0.2、VAP-Q-F0.5、VAP-S-P2分子质量分布图。
图4为本发明的实施例1至3的三种杂豆果胶多糖分子质量分布图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
(1)红小豆多糖提取：
采用超微粉碎处理1000g红小豆原料，收集过250目筛的细微粉末，加入10L体积浓度比为95％乙醇浸泡24h脱脂，过滤干燥，干燥后的红小豆粉采用95℃热水提取2h两次，合并提取液，依次加入α-淀粉酶、蛋白酶、糖化酶进行酶解，酶解条件为α-淀粉酶温度为95℃、时间1.5h，蛋白酶为温度60℃、时间0.5h、pH4.5，糖化酶为60℃、时间0.5h，其中，淀粉酶将淀粉水解成糊精，糖化酶将糊精水解成葡萄糖，蛋白酶则是将蛋白质水解成多肽，在100℃条件下灭酶10min，再用转速为8000r/min离心10min，取上清液进行真空浓缩，然后加入5.33倍于浓缩液体积的95％乙醇，4℃静置，沉淀复溶，再经透析，冷冻干燥获得红小豆粗多糖(VAP)，计算所得红小豆粗多糖(VAP)的得率为0.63％，红小豆粗多糖(VAP)通过高效凝胶渗透色谱(HPGPC)进行纯度鉴定，其分子质量分布由图1所示。
(2)红小豆精制多糖制备：
将预活化好的均孔强酸性苯乙烯系填料装入内径26mm×长度600mm规格的玻璃层析柱，并用去离子水进行平衡，然后称取步骤(1)制得的红小豆粗多糖，用去离子水配制成浓度为80mg/mL的红小豆粗多糖溶液，10000r/min离心10min，取上清液10mL滴加到均孔强酸性苯乙烯系填料柱上端，待样品与填料充分吸附，然后采用流速为3BV/h进行水洗脱，收集水洗液，真空浓缩，按浓缩液体积比2.33加入乙醇醇沉，冷冻干燥获得红小豆精制多糖(VAP-Fw)，计算所得红小豆精制多糖(VAP-Fw)的回收率为21.67％，红小豆粗多糖(VAP)和红小豆精制多糖(VAP-Fw)经冷冻干燥后的中间品由图2所示。
(3)红小豆果胶多糖制备：
称取步骤(2)制得的红小豆精制多糖150mg，采用0.1mol/L NaCl溶液配制成浓度为50mg/mL的红小豆精制多糖溶液，10000r/min离心10min，取上清液重复上样至内径26mm×长度600mm规格的Sephacryl S-400HR凝胶柱，再以0.1mol/L NaCl溶液以流速1.5mL/min等梯度洗脱，按照峰形收集洗脱液，浓缩，而后用截留分子量为3.5kDa的透析袋透析48h，冷冻干燥制备得分子质量分布均一的红小豆果胶多糖(VAP-Fw-p)，计算所得回收率为23.64％。
红小豆多糖的中性糖含量、糖醛酸含量分别通过苯酚-硫酸法、咔唑-硫酸法测定，单糖组成通过酸水解结合离子色谱-脉冲安培法(HPAEC-PAD)测定，红小豆多糖理化性质见表1，由表1可知均孔强酸性苯乙烯系填料柱纯化后红小豆多糖的糖含量提高约62％，制备所得红小豆多糖为典型的果胶多糖；由图4所示，红小豆果胶多糖分子质量分布呈均匀对称峰，表明该多糖为均一多糖，分子质量为474kDa。
表1红小豆多糖理化性质
VAP：红小豆粗多糖，VAP-Fw：红小豆精制多糖，VAP-Fw-p：红小豆果胶多糖，Rha：鼠李糖，Ara：阿拉伯糖，Gal：半乳糖，Glc：葡萄糖，Xyl：木糖，Man：甘露糖，GalA：半乳糖醛酸，GlcA：葡萄糖醛酸，n.d.：未检测到，trace：痕量。
实施例2
(1)白扁豆多糖提取：
采用超微粉碎处理1000g白扁豆原料，收集过250目筛的细微粉末，加入10L体积浓度比为95％乙醇浸泡24h脱脂，过滤干燥，干燥后的白扁豆粉采用95℃热水提取2h两次，合并提取液，依次加入α-淀粉酶、蛋白酶、糖化酶进行酶解，酶解条件为α-淀粉酶温度为95℃、时间1.5h，蛋白酶为温度60℃、时间0.5h、pH4.5，糖化酶为60℃、时间0.5h，其中，淀粉酶将淀粉水解成糊精，糖化酶将糊精水解成葡萄糖，蛋白酶则是将蛋白质水解成多肽，在100℃条件下灭酶10min，再用转速为8000r/min离心10min，取上清液进行真空浓缩，然后加入5.33倍于浓缩液体积的95％乙醇，4℃静置，沉淀复溶，再经透析，冷冻干燥获得白扁豆粗多糖(DLP)，计算所得白扁豆粗多糖(DLP)的得率为1.49％，白扁豆粗多糖(DLP)通过高效凝胶渗透色谱(HPGPC)进行纯度鉴定，其分子质量分布由图1所示。
(2)白扁豆精制多糖制备：
将预活化好的均孔强酸性苯乙烯系填料装入内径26mm×长度600mm规格的玻璃层析柱，并用去离子水进行平衡，然后称取步骤(1)制得的白扁豆粗多糖溶于去离子水配制成浓度为80mg/mL的白扁豆粗多糖溶液，10000r/min离心10min，取上清液12mL滴加到均孔强酸性苯乙烯系填料柱上端，待样品与填料充分吸附，然后采用流速为3BV/h进行水洗脱，收集水洗液，真空浓缩，按浓缩液体积比2.33加入乙醇醇沉，冷冻干燥获得白扁豆精制多糖(DLP-Fw)，计算所得白扁豆精制多糖(DLP-Fw)的回收率为24.83％，白扁豆粗多糖(DLP)和白扁豆精制多糖(DLP-Fw)经冷冻干燥后的中间品由图2所示。
(3)白扁豆果胶多糖制备：
称取步骤(2)制得的白扁豆精制多糖150mg，采用0.1mol/L NaCl溶液配制成浓度为50mg/mL的白扁豆精制多糖溶液，10000r/min离心10min，取上清液重复上样至内径26mm×长度600mm规格的Sephacryl S-400HR凝胶柱，再以0.1mol/L NaCl溶液以流速1.5mL/min等梯度洗脱，按照峰形收集洗脱液，浓缩，而后用截留分子量为3.5kDa的透析袋透析48h，冷冻干燥制备得分子质量分布均一的白扁豆果胶多糖(DLP-Fw-p)，计算所得白扁豆果胶多糖(DLP-Fw-p)的回收率为28.85％。
白扁豆多糖的中性糖含量、糖醛酸含量分别通过苯酚-硫酸法、咔唑-硫酸法测定，单糖组成通过酸水解结合离子色谱-脉冲安培法(HPAEC-PAD)测定，白扁豆多糖理化性质见表2，由表2可知均孔强酸性苯乙烯系填料柱纯化后白扁豆多糖的糖含量提高约52％，制备所得白扁豆多糖为典型的果胶多糖；由图4所示，白扁豆果胶多糖分子质量分布呈均匀对称峰，表明该多糖为均一多糖，分子质量为319kDa。
表2白扁豆多糖理化性质
Figure BDA0002189464330000071
DLP：白扁豆粗多糖，DLP-Fw：白扁豆精制多糖，DLP-Fw-p：白扁豆果胶多糖，Rha：鼠李糖，Ara：阿拉伯糖，Gal：半乳糖，Glc：葡萄糖，Xyl：木糖，Man：甘露糖，GalA：半乳糖醛酸，GlcA：葡萄糖醛酸，n.d.：未检测到。
实施例3
(1)红芸豆多糖提取：
采用超微粉碎处理1000g红芸豆原料，收集过250目筛的细微粉末，加入10L体积浓度比为95％乙醇浸泡24h脱脂，过滤干燥，干燥后的红芸豆粉采用95℃热水提取2h两次，合并提取液，依次加入α-淀粉酶、蛋白酶、糖化酶进行酶解，酶解条件为α-淀粉酶温度为95℃、时间1.5h，蛋白酶为温度60℃、时间0.5h、pH4.5，糖化酶为60℃、时间0.5h，其中，淀粉酶将淀粉水解成糊精，糖化酶将糊精水解成葡萄糖，蛋白酶则是将蛋白质水解成多肽，在100℃条件下灭酶10min，再用转速为8000r/min离心10min，取上清液进行真空浓缩，然后加入5.33倍于浓缩液体积的95％乙醇，4℃静置，沉淀复溶，再经透析，冷冻干燥获得红芸豆粗多糖(RKB)，计算所得红芸豆粗多糖(RKB)的得率为6.40％，红芸豆粗多糖(RKB)通过高效凝胶渗透色谱(HPGPC)进行纯度鉴定，其分子质量分布由图1所示。
(2)红芸豆精制多糖制备：
将预活化好的均孔强酸性苯乙烯系填料装入内径26mm×长度600mm规格的玻璃层析柱，并用去离子水进行平衡，然后称取步骤(1)制得的红芸豆粗多糖溶于去离子水配制成浓度为80mg/mL的红芸豆粗多糖溶液，10000r/min离心10min，取上清液10mL滴加到均孔强酸性苯乙烯系填料柱上端，待样品与填料充分吸附，然后采用流速为3BV/h进行水洗脱，收集水洗液，真空浓缩，按浓缩液体积比2.33加入乙醇醇沉，冷冻干燥获得红芸豆精制多糖(RKB-Fw)，计算所得红芸豆精制多糖(RKB-Fw)的回收率为6.84％，红芸豆粗多糖(RKB)和红芸豆精制多糖(RKB-Fw)经冷冻干燥后的中间品由图2所示。
(3)红芸豆果胶多糖制备：
称取步骤(2)制得的红芸豆精制多糖100mg，采用0.1mol/L NaCl溶液配制成浓度为50mg/mL的红芸豆精制多糖溶液，10000r/min离心10min，取上清液重复上样至内径26mm×长度600mm规格的Sephacryl S-400HR凝胶柱，再以0.1mol/L NaCl溶液以流速1.5mL/min等梯度洗脱，按照峰形收集洗脱液，浓缩，而后用截留分子量为3.5kDa的透析袋透析48h，冷冻干燥制备得分子质量分布均一的红芸豆果胶多糖(RKB-Fw-p)，计算所得红芸豆果胶多糖(RKB-Fw-p)的回收率为12.20％。
红芸豆多糖的中性糖含量、糖醛酸含量分别通过苯酚-硫酸法、咔唑-硫酸法测定，单糖组成通过酸水解结合离子色谱-脉冲安培法(HPAEC-PAD)测定，红芸豆多糖理化性质见表3，由表3可知均孔强酸性苯乙烯系填料柱纯化后红芸豆多糖的糖含量提高约58％，制备所得红芸豆多糖为典型的果胶多糖；由图4所示，红芸豆果胶多糖分子质量分布呈均匀对称峰，表明该多糖为均一多糖，分子质量为705kDa。
表3红芸豆多糖理化性质
Figure BDA0002189464330000091
RKB：红芸豆粗多糖，RKB-Fw：红芸豆精制多糖，RKB-Fw-p：红芸豆果胶多糖，Rha：鼠李糖，Ara：阿拉伯糖，Gal：半乳糖，Glc：葡萄糖，Xyl：木糖，Man：甘露糖，GalA：半乳糖醛酸，GlcA：葡萄糖醛酸，n.d.：未检测到，trace：痕量。
对比实施例1之分级醇沉法
称取实施例1中步骤(1)制得的红小豆粗多糖1g，用去离子水配制成浓度为10mg/mL红小豆粗多糖溶液，10000r/min离心10min，向上清液中滴加无水乙醇至乙醇体积分数达到5％，于4℃醇沉过夜，4℃条件下8000r/min离心10min离心，收集沉淀获得10％醇沉组分，而后以乙醇体积分数5％为一个梯度加入乙醇，直至乙醇体积分数为90％，按照同样方法收集各醇沉组分以及90％上清组分共18个，所得各组分通过测定糖含量得知，糖含量最高的组分其糖含量仅有不到35％，由此可知分级醇沉法无法富集红小豆多糖。
与实施例1相比，实施例1中红小豆粗多糖经过均孔强酸性苯乙烯系填料柱吸附结合乙醇醇沉纯化方法后，所得的红小豆精制多糖的含糖量高达约90％，远高于分级醇沉法所得的含量糖35％，实施例1在红小豆多糖的富集效果方面更好。因此本发明与该纯化方法对比，对红小豆多糖的富集方面提高的效果显著。
对比实施例2之DEAESepharose Fast Flow弱阴离子纯化
称取实施例1中步骤(1)制得的红小豆粗多糖，用去离子水配制成浓度为50mg/mL的红小豆粗多糖溶液，10000r/min离心10min，取上清液10mL红小豆粗多糖溶液滴加在内径26mm×长度600mm规格的DEAESepharoseFast Flow阴离子交换柱上端，待样品与填料充分吸附，依次采用流速为3BV/h的0、0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L和2mol/L的NaCl溶液进行分段洗脱，流速为3mL/min，分别收集不同组分，再经透析，浓缩，冷冻干燥制备得到5个不同组分，分别记为VAP-D-Fw、VAP-D-F0.1、VAP-D-F0.2、VAP-D-F0.5和VAP-D-F2。其中，回收率及糖含量最高的组分为VAP-D-F0.2，其分子量分布由图3所示，该组分色素含量比红小豆粗多糖(VAP)更高，所述组分回收率为12.85％，中性糖含量为23.33％，酸性糖含量为26.14％，蛋白质含量为8.04％，其单糖组成为Ara(19.68％)、Gal(9.91％)、Xyl(0.88％)、GalA(9.82％)，此外，该纯化方法在富集多糖的同时对色素也有富集。
与实施例1相比，实施例1中红小豆粗多糖经过均孔强酸性苯乙烯系填料柱吸附结合乙醇醇沉纯化方法后，所得的红小豆精制多糖的回收率为21.67％且色素含量低，明显优于DEAESepharoseFast Flow弱阴离子纯化法的回收率为12.85％且有色素富集的结果。因此本发明与该纯化方法对比，回收率和色素减少方面提高的效果显著。
对比实施例3之QSepharoseFast Flow强阴离子纯化
称取实施例1中步骤(1)制得的红小豆粗多糖，用去离子水配制成浓度为50mg/mL的红小豆粗多糖溶液，10000r/min离心10min，取上清液6mL红小豆粗多糖溶液滴加在内径26mm×长度40mm规格的QSepharoseFast Flow阴离子交换柱上端，待样品与填料充分吸附，依次采用流速为3BV/h的0、0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L和2mol/L的NaCl溶液进行分段洗脱，流速为3mL/min，分别收集不同组分，再经透析，浓缩，冷冻干燥制备得到5个不同组分，分别记为VAP-Q-Fw、VAP-Q-F0.1、VAP-Q-F0.2、VAP-Q-F0.5和VAP-Q-F2。其中，回收率及糖含量最高的组分为VAP-Q-F0.5，其分子量分布由图3所示，该组分色素含量比红小豆粗多糖(VAP)更高，所述组分回收率为25.04％，中性糖含量为41.55％，酸性糖含量为45.69％，蛋白质含量为25.04％，其单糖组成为Ara(18.26％)、Gal(14.52％)、Glu(0.69％)、Xyl(6.84％)、GalA(17.92％)、Glca(0.54％)。
与实施例1相比，实施例1中红小豆粗多糖经过均孔强酸性苯乙烯系填料柱吸附结合乙醇醇沉纯化方法后，所得的红小豆精制多糖的回收率为21.67％，QSepharoseFastFlow强阴离子纯化法回收率为25.04％，该法与实施例1的回收率相当；而在糖含量方面，实施例1高达约为90％，而此法在富集多糖的同时也富集了蛋白质，实施例1在红小豆多糖的富集效果方面更好。因此本发明与该纯化方法对比，对红小豆多糖的富集方面提高的效果显著。
对比实施例4之Sephacryl S-400凝胶柱纯化
称取实施例1中步骤(1)制得的红小豆粗多糖溶于0.1mol/L NaCl溶液，配制成浓度为50mg/mL红小豆粗多糖溶液，10000r/min离心10min，取上清液重复上样至内径26mm×长度600mm规格的Sephacryl S-400HR凝胶柱，再以0.1mol/L NaCl溶液以流速1.5mL/min等梯度洗脱，按照峰形共收集4个组分，浓缩，而后用截留分子量为3.5kDa的透析袋透析48h，制得4个不同组分，分别记为VAP-S-P1、VAP-S-P2、VAP-S-P3和VAP-S-P4，其中VAP-S-P2为回收率及糖含量最高的组分，其分子量分布由图3所示，所述组分回收率为11.12％，中性糖含量为37.81％，酸性糖含量为34.91％，蛋白质含量为4.12％，脱色率为10.52％，其单糖组成为Ara(11.64％)、Gal(3.88％)、Xyl(3.11％)、GalA(17.66％)。与实施例1相比，实施例1中红小豆粗多糖经过均孔强酸性苯乙烯系填料柱吸附结合乙醇醇沉再经Sephacryl S-400凝胶柱纯化后，所得的红小豆果胶多糖的回收率为23.64％，高于直接经Sephacryl S-400凝胶柱纯化法的回收率11.12％；而在糖含量方面尤其是含酸性果胶类多糖实施例1为57.87％，而该法为37.81％。因此本发明与该纯化方法对比，回收率和酸性果胶类多糖含量方面提高的效果显著。
本发明的技术效果：
1、参见图1，图1为本发明实施例1至3的三种杂豆粗多糖分子质量分布图。从图1可以看出，实施例1制得的红小豆粗多糖(VAP)、实施例2制得的白扁豆粗多糖(DLP)、实施例3制得的红芸豆粗多糖(RKB)这三种杂豆粗多糖的分子质量分布均一性不高，成分较多且峰型对称性较差，表明三种杂豆粗多糖还需要进一步纯化。
2、参见表1-3，表1-3为本发明的实施例1至3的三种杂豆多糖理化性质表，同时参见图2，图2为本发明的实施例1至3的三种杂豆多糖均孔强酸性苯乙烯系填料纯化前后颜色对比。脱色率(D)计算公式如下：
D＝(A0-A)/A0×100％，
式中:A0—脱色前在450nm处吸光度；A—脱色后在450nm处吸光度
图2是实施例1制得的红小豆精粗多糖(VAP)和纯化后制得的红小豆精制多糖(VAP-Fw)，实施例2制得的白扁豆粗多糖(DLP)和纯化后制得的白扁豆精制多糖(DLP-Fw)，实施例3制得的红芸豆粗多糖(RKB)和纯化后制得的红芸豆精制多糖(RKB-Fw)的冻干品进行糖含量和脱色率对比，由表1至表3和图2可以得出：
(1)红小豆粗多糖a、与红小豆精制多糖b对比，糖含量提高约62％，颜色由黄色变成米白色，并测得脱色率为23.58％；
(2)白扁豆粗多糖c与白扁豆精制多糖d对比，糖含量提高约52％，颜色由浅棕色变成米白色，并测得脱色率为32.83％；
(3)红芸豆粗多糖e与红芸豆精制多糖f对比，糖含量提高约58％，颜色由淡黄色变成白色，并测得脱色率为22.45％；
因此，经采用均孔强酸性苯乙烯系填料纯化步骤前后，其冻干品从糖含量和脱色率两方面都有明显改善，说明本发明纯化效果良好。
3、参见图3，图3为本发明的对比实施例2至4的三种对比例纯化方法组分VAP-D-F0.2、VAP-Q-F0.5、VAP-S-P2分子质量分布图
即是对比实施例2之DEAE-Sepharose Fast Flow弱阴离子纯化的VAP-D-F0.2组分、对比实施例3之QSepharoseFast Flow强阴离子纯化VAP-Q-F0.5组分、对比实施例4之Sephacryl S-400凝胶柱纯化VAP-S-P2组分的分子质量分布图，由图3可知上述三种纯化方法制得的组分，除了VAP-S-P2呈均匀对称峰外，其余两种组分的峰型对称性都较差；另外正如对比实施例3之QSepharoseFast Flow强阴离子纯化中所述，由于QSepharoseFast Flow强阴离子纯化法回收率不高，酸性果胶类糖含量较实施例差，因此整体而言，本发明较对比例中的三种纯化方法的优越性还是更为显著。
4、参见图4，图4为本发明的实施例1至3的三种杂豆果胶多糖分子质量分布图
即是实施例1制得的红小豆果胶多糖(VAP-Fw-p)、实施例2制得的白扁豆果胶多糖(DLP-Fw-p)、实施例3制得的红芸豆果胶多糖(RKB-Fw-p)的分子质量分布图，由图4可知红小豆果胶多糖分子质量为474kDa、白扁豆果胶多糖为319kDa、红芸豆果胶多糖为705kDa，三种杂豆果胶多糖的分子质量分布图呈均匀对称峰，表明本发明制得的杂豆果胶类多糖为均一性良好。

Claims (10)

1.一种杂豆类果胶多糖的分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)杂豆多糖提取：
采用超微粉碎法处理杂豆原料，收集过250目筛的细微粉末，加入乙醇进行脱脂，干燥后的杂豆粉采用热水反复提取两次，合并提取液，依次加入α-淀粉酶、蛋白酶、糖化酶进行酶解除去提取液中的淀粉和蛋白质，然后灭酶10min，再用转速为8000r/min离心10min，取上清液进行真空浓缩，加入乙醇，静置，沉淀复溶，再经透析，冷冻干燥获得杂豆粗多糖；
(2)杂豆精制多糖制备：
将步骤(1)制得的杂豆粗多糖溶于去离子水，离心，取上清液至均孔强酸性苯乙烯系填料柱进行纯化，并反复水洗，水洗液浓缩后乙醇醇沉、冻干，获得杂豆精制多糖；
(3)杂豆果胶多糖制备：
将步骤(2)制得的杂豆精制多糖溶于NaCl溶液，离心去除不溶物，通过凝胶层析柱以NaCl溶液进行洗脱，制备得分子质量分布均一的杂豆类果胶多糖。
2.根据权利要求1所述的杂豆类果胶多糖的分离纯化方法，其特征在于：步骤(2)所述的均孔强酸性苯乙烯系填料纯化方法如下：将预活化好的均孔强酸性苯乙烯系填料装入内径26mm×长度600mm规格的玻璃层析柱，并用去离子水进行平衡，然后称取步骤(1)制得的杂豆粗多糖，用去离子水配制成浓度为30mg/mL～100mg/mL的杂豆粗多糖溶液，10000r/min离心10min，取上清液5mL～15mL滴加到所述的均孔强酸性苯乙烯系填料玻璃层析柱上端，待样品与填料充分吸附，然后采用流速为3BV/h进行水洗脱，收集水洗液，真空浓缩，按浓缩液体积比2～5加入乙醇醇沉，冷冻干燥。
3.根据权利要求1所述的杂豆类果胶多糖的分离纯化方法，其特征在于：步骤(3)所述的凝胶柱纯化方法如下：称取步骤(2)制得的杂豆精制多糖，用0.1mol/L～0.2mol/L NaCl溶液配制成浓度为30mg/mL～100mg/mL的杂豆精制多糖溶液，10000r/min离心10min，取上清液重复上样至内径26mm×长度600mm规格的Sephacryl S-400HR凝胶柱，再以0.1mol/L～0.2mol/L NaCl溶液以流速为1.0mL/min至2.0mL/min等梯度洗脱，按照峰形收集洗脱液，浓缩，而后用截留分子量为3.5kDa的透析袋透析48h，冷冻干燥。
4.根据权利要求1所述的杂豆类果胶多糖的分离纯化方法，其特征在于：步骤(1)中所用的杂豆原料为红小豆、白扁豆和红芸豆中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的杂豆类果胶多糖的分离纯化方法，其特征在于：步骤(1)所述的加入乙醇进行脱脂，其乙醇的浓度为体积比浓度80％～100％。
6.根据权利要求1所述的杂豆类果胶多糖的分离纯化方法，其特征在于：步骤(1)所述的干燥后的杂豆粉进行热水反复提取两次，其提取条件的温度为80℃～100℃，提取时间为1.5h～3h。
7.根据权利要求1所述的杂豆类果胶多糖的分离纯化方法，其特征在于：步骤(1)所述的酶α-淀粉酶、蛋白酶、糖化酶，其酶解条件为：α-淀粉酶为温度95℃、时间1.5h；蛋白酶为温度60℃、时间0.5h、pH 4.5；糖化酶为温度60℃、时间0.5h。
8.根据权利要求1所述的杂豆类果胶多糖的分离纯化方法，其特征在于：步骤(1)所述的灭酶10min，其灭酶时的温度为95℃～100℃。
9.根据权利要求1所述的杂豆类果胶多糖的分离纯化方法，其特征在于：步骤(1)所述的取上清液进行真空浓缩，加入乙醇，静置，所用乙醇的体积为于浓缩液体积的3.5～5.5倍，浓度为体积浓度比90％～100％，静置的温度为0℃～4℃。
10.根据权利要求1所述的杂豆类果胶多糖的分离纯化方法，其特征在于：步骤(3)获得的所述杂豆果胶类多糖重均分子质量为300～800kDa，单糖组成阿拉伯糖为1％～20％、半乳糖为20％～40％、木糖为5％～30％、半乳糖醛酸为5％～30％、葡萄糖醛酸为0～10％。
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