CN108530553A - 一种鹰嘴豆中性多糖的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鹰嘴豆中性多糖的制备方法，包括以下步骤：1)绿豆粉碎，浸泡除脂，离心收集残渣烘干，离心，收集上清液并浓缩；2)将浓缩上清液进行脱蛋白，透析脱盐，冻干得绿豆粗多糖；3)将绿豆粗多糖溶解离心，上清液进行阴离子交换层析，梯度洗脱后，紫外检测，合并收集洗脱液，得两个主峰；4)将目的洗脱液进行凝胶过滤层析，等度洗脱后，紫外检测，分别收集得两个目的洗脱峰，即纯化的绿豆多糖。本发明具有以下有益效果：水提取，水做溶剂，安全，污染，价格低廉；水提取粗多糖提取工艺简单，产物纯度高；对企业的技术要求低，可适应与大范围的推广。

Description

一种鹰嘴豆中性多糖的制备方法

技术领域

本发明涉及植物提取技术领域，特别涉及一种鹰嘴豆中性多糖的制备方法。

背景技术

鹰嘴豆(chickpea)是一年生或多年生豆科鹰嘴豆属植物，株高1-2米，花果期6-9月，嫩苗、嫩荚、种子均可供食用。种子幼时呈绿色，成熟后通体呈暗黄、微红或淡白色，质地较为坚硬，直径4-7mm，大小与黄豆相似，表面有尖状突起，因其与鹰嘴相似而得名鹰嘴豆。鹰嘴豆又名桃尔豆、鸡豆、鸡豌豆，是世界第三大豆类，在中国新疆地区已有两千多年种植历史，主产于地中海气候地区，具有耐热、耐干旱、耐贫瘠等特征，因而在非洲、亚洲、地中海沿岸、美洲以及中国青海、新疆、甘肃等地都有广泛种植，尤其在亚洲西部和中东地区，是当地居民重要食用蔬菜之一。

鹰嘴豆营养丰富，富含多种优质植物蛋白(球蛋白)，经研究发现，与其他豆类相比，鹰嘴豆蛋白在消化吸收、功效比值以及生物利用价值方面占绝对优势，因而鹰嘴豆也有“豆中之王”的美誉。此外，鹰嘴豆还是一种良好的植物氨基酸补充剂，鹰嘴豆中含有8种人体必需氨基酸以及10多种非必需氨基酸，且含量高出燕麦2倍以上，对少年儿童生长发育及中老年强身健体具有不可低估的作用。同时，鹰嘴豆中富含的维生素、碳水化合物、脂肪、叶酸、膳食纤维以及钙、镁、铁、锌、磷等多种微量元素，无论是从种类，还是数量上，都大大超过其他豆类，具有较高的食用和药用价值。

国内外关于多糖的提取方法有很多，包括：溶剂提取法、酸提法、碱提法、酶解法、超滤法、超声法，微波法等。分离纯化多糖方法包括：沉淀法、盐析法、超滤法等。

本发明在此基础上提出一种具有抗氧化活性和免疫调节活性的鹰嘴豆中性多糖的制备方法。该方法能够得到具有抗氧化活性和免疫调节活性的鹰嘴豆中性多糖，经过DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和凝胶过滤层析纯化得到的鹰嘴豆中性多糖。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种具有抗氧化活性和免疫调节活性的鹰嘴豆中性多糖的制备方法，该方法能够得到具有抗氧化活性和免疫调节活性的鹰嘴豆中性多糖，该多糖能够使DPPH和ABTS自由基清除活性增强，金属还原能力增强；而且该多糖能够刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞分泌产生NO、MCP-1、TNF-α和IL-6因子。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种鹰嘴豆中性多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取清洗干净的鹰嘴豆，粉碎过60目筛，95％乙醇浸泡3d除脂，离心，收集残渣烘干，加入蒸馏水，离心，收集上清液并浓缩；

2)将步骤1)得到的浓缩的上清液用α-淀粉酶法除淀粉，Sevag法进行脱蛋白处理，再装入透析袋4℃过夜透析脱盐，分级醇沉，冻干，得两种鹰嘴豆粗多糖；

3)将步骤2)得到的两种鹰嘴豆粗多糖用蒸馏水溶解，13000r/min离心20min，上清液进行阴离子交换层析，梯度洗脱后，490nm紫外检测，合并收集洗脱液，两种粗多糖均收集得到两个主峰；

4)将步骤3)得到的目的洗脱液分别进行凝胶过滤层析，等度洗脱后，在206nm紫外检测，分别收集得到两个目的洗脱峰，即纯化的鹰嘴豆中性多糖。

优选地，上述技术方案中，所述步骤1)具体为：

11)取清洗干净的鹰嘴豆，粉碎，过60目筛，按固液比1:6加入95％乙醇，浸泡3d除脂；

12)离心收集残渣，烘干，按料液比1:5-1:20，在温度为60-90℃条件下，持续搅拌2-5h，离心，收集上清液并浓缩。

优选地，上述技术方案中，所述步骤12)的按料液比1:15；提取温度为90℃；提取时间4h；离心条件：3500r、10min；烘干温度为60℃。

优选地，上述技术方案中，所述步骤2)采用的α-淀粉酶除淀粉处理具体为：将浓缩的上清液中加入一定量的α-淀粉酶，使酶浓度达到20U/mL，37℃水浴酶解至I₂-KI检测不变蓝，然后沸水浴中保持10min，使淀粉酶变性失活；

优选地，上述技术方案中，所述步骤2)中Sevag法进行脱蛋白处理具体为：将浓缩的上清液与Sevage试剂按5：1混合，振荡，离心，去蛋白。

优选地，上述技术方案中，所述Sevage试剂为氯仿和正丁醇按体积比5:1混合形成。

优选地，上述技术方案中，所述步骤2)的分级醇沉是根据不同种类多糖在乙醇溶液中溶解度不同，采用从低到高不同浓度的乙醇溶液将不同组分多糖按分子量从大到小分离出来。

优选地，上述技术方案中，所述步骤2)的分级醇沉的具体方法为：将多糖提取液中加入1倍体积无水乙醇，是多糖析出，4℃冰箱中静置过夜，离心，沉淀置冻干机中冻干得CWP1，在上清液中继续加入无水乙醇使其体积分数达80％，4℃冰箱中静置过夜，离心，沉淀冻干的CWP2。

优选地，上述技术方案中，所述步骤3)具体为：

将步骤2)得到的两种鹰嘴豆粗多糖用蒸馏水溶解，离心，上清液上DEAE-琼脂糖凝胶FF填料柱，用超纯水平衡过夜，梯度洗脱，洗脱液为0-2M NaCl溶液，洗脱流速4ml/min，以8ml/管速度自动收集，在490nm紫外检测，收集目的洗脱液，分别冻干。

优选地，上述技术方案中，所述步骤4)具体为：

将步骤3)得到的目的洗脱液分别上丙烯葡聚糖凝胶s-300填料柱，等度洗脱，洗脱液为0.15M NaCl溶液，洗脱流速为0.5ml/min，自动收集，在206nm紫外检测，两种多糖均收集得到两个目的洗脱峰，即纯化的鹰嘴豆中性多糖。。

优选地，上述技术方案中，透析过夜的时间为8-12h，所述透析袋4℃过夜透析脱盐需要进行流水透析。

本发明上述技术方案，具有如下有益效果：

本发明的方法能够得到具有抗氧化活性和免疫调节活性的鹰嘴豆中性多糖，该多糖能够使DPPH和ABTS自由基清除活性增强，金属还原能力增强；而且该多糖能够刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞分泌产生NO、MCP-1、TNF-α和IL-6因子，经过超声处理后鹰嘴豆中性多糖功效更强。

本方法具有鹰嘴豆中性多糖筛选、纯化等作用，最终得到鹰嘴豆中性多糖CWP1-1，CWP1-2，CWP2-1和CWP2-2。

同时，本发明还具有以下有益效果：水提取，水做溶剂，安全，污染，价格低廉；对鹰嘴豆中性多糖进行提取并进行纯化工艺；经过系统提取纯化研究，鹰嘴豆水提多糖CWP1-1，CWP1-2，CWP2-1和CWP2-2；水提取粗多糖提取工艺简单，对企业的技术要求低，可适应与大范围的推广。

本发明采用了除淀粉和脱蛋白处理，经过除淀粉和脱蛋白处理后，鹰嘴豆多糖纯度大大提高，由39％增加至82％，更有利于后续的纯化。纯化后的多个产品，其纯度均大于98％。

附图说明

图1：本发明的各组多糖的ABTS自由基清除活性。

图2：本发明的各组多糖的DPPH自由基清除活性。

图3：本发明的各组多糖的Fe³⁺还原能力。

图4：本发明的各组多糖NO含量。

图5：本发明的各组多糖MCP-1含量。

图6：本发明的各组多糖IL-6含量。

图7：本发明的各组多糖TNF-α含量。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施例进行详细描述，以便于进一步理解本发明。

以下实施例中所有使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

实施例1鹰嘴豆粗多糖的制备

分别研究提取温度、提取时间以及料液比对鹰嘴豆中性多糖得率的影响。

(1)提取温度、提取时间以及料液比对鹰嘴豆蛋白得率的影响。

准确称取100g的鹰嘴豆粉碎，过60目筛后，将样品与95％乙醇按固液比1:6浸泡3天除脂，离心收集残渣，烘干。将烘干后的残渣放入500mL三角瓶中，加入蒸馏水，按照一定的料液比、在一定提取温度下、搅拌提取一定时间后，离心收集上清液，将上清液浓缩，除淀粉，脱蛋白、脱盐，分级醇沉，冻干，得两种鹰嘴豆粗多糖(命名：CWP1和CWP2)。

分别考察料液比1：5、1：10、1：15、1:20，搅拌提取时间2h、3h、4h、5h；以及提取时间60℃、70℃、80℃、90℃，为考察因素和指标，建立起正交分析表。

单因素试验结果如下：

设定鹰嘴豆样品为100g。

其中，固液比设为1:10，搅拌时间为3h，实验分析提取温度对多糖得率的影响，结果如表1所示：

表1：固液比1:10，搅拌时间3h，提取温度对多糖得率的影响。

提取温度℃	CWP1得率％	CWP2得率％
			60	0.53	2.67
70	0.79	3.72
			80	1.15	4.93
90	1.27	5.19

其中，固液比设为1:10，提取温度为90℃，实验分析提取时间对多糖得率的影响，结果如表2所示：

表2：固液比1:10，提取温度90℃，提取时间对多糖得率的影响。

提取时间h	CWP1得率％	CWP2得率％
			2	0.64	3.07
3	0.93	4.63
			4	1.25	5.21
5	1.17	5.09

其中，提取温度为90℃，搅拌时间为3h，实验分析固液比对多糖得率的影响，结果如表3所示：

表3：提取温度90℃，搅拌时间3h，固液比对多糖得率的影响。

固液比	CWP1得率％	CWP2得率％
			1:5	0.95	4.21
1:10	0.17	4.65
			1:15	1.30	5.26
1:20	1.22	5.21

结果表明(如表1-表3所示)：在料液比1:15，提取时间4h，提取温度90℃效果较好。提取得到的上清浓缩液进行除淀粉和脱蛋白处理，分级醇沉，得到的粗多糖溶液，经过透析冻干后，多糖CWP1和CWP2得率分别为1.36％和5.34％。

经过除淀粉和脱蛋白处理后，鹰嘴豆多糖纯度由39％增加至82％。分级醇沉是根据不同种类多糖在乙醇溶液中溶解度不同，采用从低到高不同浓度的乙醇溶液将不同组分多糖按分子量从大到小分离出来，经过分级醇沉后，两种鹰嘴豆多糖纯度分别为78％和82％。

实施例2鹰嘴豆粗多糖的纯化

(1)第一次纯化处理：阴离子交换层析

使用KTA explore100仪器，将两种鹰嘴豆粗多糖样品用蒸馏水溶解，离心(转速13000r/min，20min)后，上清液装上DEAE-琼脂糖凝胶FF(GE公司生产，货号17-0709-01)柱，用超纯水平衡过夜，梯度洗脱，洗脱液为0-2MNaCl，洗脱流速4ml/min，以8ml/管速度自动收集，490nm紫外检测，分别收集目的洗脱液，冻干。

(2)第二次纯化处理：丙烯葡聚糖凝胶s-300凝胶过滤层析

将上述得到的目的洗脱液分别进一步的进行凝胶过滤层析，填料为丙烯葡聚糖凝胶s-300，等度洗脱。洗脱液为0.15M NaCl溶液，流速为0.5ml/min。

在206nm紫外检测总糖含量并结合苯酚-硫酸法进行糖含量的定量的分析，最终两种多糖在206nm均产生两个主要峰，将收集到的峰分别冻干，得纯化后的鹰嘴豆中性多糖(简称：CWP1-1，CWP1-2，CWP2-1和CWP2-2)。

实施例3各种多糖的抗氧化活性作用

测定上述各组多糖DPPH和ABTS自由基清除活性，以及Fe3+还原能力，从而证明鹰嘴豆中性多糖的抗氧化活性作用。结果如图1、图2和图3所示。

结果表明(如图1-3所示)：分离纯化后鹰嘴豆中性多糖均具有较高的抗氧化活性，且其中多糖CWP1-1抗氧化活性最高。

实施例4各种多糖的免疫活性作用

进行细胞实验，测定上述各组多糖的对RAW264.7小鼠巨噬细胞NO、MCP-1、TNF-α和IL-6因子含量变化，从而证明鹰嘴豆中性多糖的免疫活性作用。

结果表明(如图4-7所示)：CWP2-1和CWP2-2具有较强的免疫作用，能够显著促进小鼠RAW246.7巨噬细胞NO、IL-6、MCP-1和TNF-α等细胞因子的分泌，且随着浓度的增加，免疫活性增强。而CWP1-1和CWP1-2则无明显免疫活性。

本发明的方法能够得到具有抗氧化活性和免疫调节活性的鹰嘴豆中性多糖，而且该多糖能够刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞分泌产生NO、MCP-1、TNF-α和IL-6因子。

本方法具有鹰嘴豆中性多糖提取、纯化等作用，最终得到鹰嘴豆中性多糖CWP1-1，CWP1-2，CWP2-1和CWP2-2。

本发明的提取步骤中使用了α-淀粉酶法除淀粉和分级醇沉，经过除淀粉和脱蛋白处理后，鹰嘴豆多糖纯度由39％增加至72％。分级醇沉是根据不同种类多糖在乙醇溶液中溶解度不同，采用从低到高不同浓度的乙醇溶液将不同组分多糖按分子量从大到小分离出来，经过分级醇沉后，两种鹰嘴豆多糖纯度分别为78％和82％。这为后续的纯化奠定了基础。通过本发明的方法纯化得到的纯品，纯度均大于98％。

虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (10)

1.一种鹰嘴豆中性多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取清洗干净的鹰嘴豆，粉碎过60目筛，95％乙醇浸泡3d除脂，离心，收集残渣烘干，加入蒸馏水，离心，收集上清液并浓缩；

2)将步骤1)得到的浓缩的上清液用α-淀粉酶法除淀粉，Sevag法进行脱蛋白处理，再装入透析袋4℃过夜透析脱盐，分级醇沉，冻干，得两种鹰嘴豆粗多糖；

3)将步骤2)得到的两种鹰嘴豆粗多糖用蒸馏水溶解，13000r/min离心20min，上清液进行阴离子交换层析，梯度洗脱后，490nm紫外检测，合并收集洗脱液，两种粗多糖均收集得到两个主峰；

4)将步骤3)得到的目的洗脱液分别进行凝胶过滤层析，等度洗脱后，在206nm紫外检测，分别收集得到两个目的洗脱峰，即纯化的鹰嘴豆中性多糖。

2.根据权利要求1所述的鹰嘴豆中性多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤1)具体为：

11)取清洗干净的鹰嘴豆，粉碎，过60目筛，按固液比1:6加入95％乙醇，浸泡3d除脂；

12)离心收集残渣，烘干，按料液比1:5-1:20，在温度为60-90℃条件下，持续搅拌2-5h，离心，收集上清液并浓缩。

3.根据权利要求2所述的具有抗氧化活性和免疫调节活性的鹰嘴豆中性多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤12)的按料液比1:15；提取温度为90℃；提取时间4h；离心条件：3500r、10min；烘干温度为60℃。

4.根据权利要求1所述的鹰嘴豆中性多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤2)采用的α-淀粉酶除淀粉处理具体为：将浓缩的上清液中加入一定量的α-淀粉酶，使酶浓度达到20U/mL，37℃水浴酶解至I₂-KI检测不变蓝，然后沸水浴中保持10min，使淀粉酶变性失活；

5.根据权利要求1所述的鹰嘴豆中性多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中Sevag法进行脱蛋白处理具体为：将浓缩的上清液与Sevage试剂按5：1混合，振荡，离心，去蛋白。

6.根据权利要求5所述的鹰嘴豆中性多糖的制备方法，其特征在于，所述Sevage试剂为氯仿和正丁醇按体积比5:1混合形成。

7.根据权利要求1所述的鹰嘴豆中性多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤2)的分级醇沉是根据不同种类多糖在乙醇溶液中溶解度不同，采用从低到高不同浓度的乙醇溶液将不同组分多糖按分子量从大到小分离出来。

8.根据权利要求1所述的鹰嘴豆中性多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤2)的分级醇沉的具体方法为：将多糖提取液中加入1倍体积无水乙醇，是多糖析出，4℃冰箱中静置过夜，离心，沉淀置冻干机中冻干得CWP1，在上清液中继续加入无水乙醇使其体积分数达80％，4℃冰箱中静置过夜，离心，沉淀冻干的CWP2。

9.根据权利要求1所述的鹰嘴豆中性多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤3)具体为：

将步骤2)得到的两种鹰嘴豆粗多糖用蒸馏水溶解，离心，上清液上DEAE-琼脂糖凝胶FF填料柱，用超纯水平衡过夜，梯度洗脱，洗脱液为0-2M NaCl溶液，洗脱流速4ml/min，以8ml/管速度自动收集，在490nm紫外检测，收集目的洗脱液，分别冻干。

10.根据权利要求1所述的鹰嘴豆中性多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤4)具体为：

将步骤3)得到的目的洗脱液分别上丙烯葡聚糖凝胶s-300填料柱，等度洗脱，洗脱液为0.15M NaCl溶液，洗脱流速为0.5ml/min，自动收集，在206nm紫外检测，两种多糖均收集得到两个目的洗脱峰，即纯化的鹰嘴豆中性多糖。