CN106905410A

CN106905410A - 一种骨髓蛋白质和多肽的超滤膜制备方法及其应用

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Publication number: CN106905410A
Application number: CN201710130574.4A
Authority: CN
Inventors: 阿布力米提·伊力; 阿吉艾克拜尔·艾萨; 帕尔哈提·柔孜; 雅森·米吉提; 艾合米丁·外力
Original assignee: Xinjiang Technical Institute of Physics and Chemistry of CAS
Current assignee: Xinjiang Technical Institute of Physics and Chemistry of CAS
Priority date: 2017-03-07
Filing date: 2017-03-07
Publication date: 2017-06-30
Anticipated expiration: 2037-03-07
Also published as: CN106905410B

Abstract

本发明涉及一种骨髓蛋白质和多肽的超滤膜制备方法及其应用，该方法以牛、羊、马、骆驼或其它动物屠宰场的动物骨骼里面的新鲜骨髓为原料，采用骨髓与骨头分类，清水清理、液氮冷冻粉粹得到骨髓粉，利用温水溶液提取，油脂成分充分脱脂，再利用现代超滤膜技术制备了截留分子量为10KDa的蛋白质，再利用现代喷雾干燥技术或冷冻干燥精制而成。该骨髓蛋白质被验证其抗细菌和真菌活性，不但是具有广泛的抗微生物活性，同时具有增强体液免疫及全身免疫的功能，富含人体易消化和吸收的纯天然植物来源多肽和蛋白质。该蛋白质的特点是既保留了骨髓原有的蛋白质的同时还实现变废为宝和资源充分利用的目的；该蛋白质作为天然抗菌剂、食品添剂或药物，可用于食品和医药行业。

Description

一种骨髓蛋白质和多肽的超滤膜制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种骨髓蛋白质和多肽的超滤膜制备方法及其应用，是利用新疆资源丰富的骨骼为原料制备的具有抗菌活性的蛋白质，具有抗细菌、抗真菌等生物活性，在医药、食品领域具有很好的应用前景。

背景技术

我国是个畜禽消费大国，但多集中于畜禽肉类的消费"大量的畜禽骨骼得不到利用"既浪费了这种营养成分丰富且比例合理的资源"又在骨处理的问题上污染了环境"造成一定的环境压力。

畜禽骨骼中蛋白质的利用，骨蛋白，骨中的蛋白质含量很高"且属较为全价的可溶性蛋白质"生物价高我国的蛋白质资源一直比较紧张"这种资源的开发利用对缓解我，

畜禽骨骼由骨膜，骨质，骨髓构成，是蛋白质和钙质组成的网状结构"再构成管状"管内充满了含多种营养物质的骨髓，如构成脑组织的磷脂及防止老化的骨胶原，软骨素等，鲜骨中含有蛋白质，脂肪，矿物质，如钙，磷，铁等，骨胶原，软骨素以及维生素等，尤其是的钙磷比非常接近人体钙吸收的最佳比例"是理想的天然钙源，

骨髓是动物器官中十分重要的一个部分，造血干细胞就由骨髓供应，俗话说骨髓补血，骨髓不仅味道好，营养价值确实不错。尤其是骨髓化到汤里后变白的汤最有营养，最香,是动物当中最有营养的动物的骨头中含有多种对人体有营养、滋补和保健功能的物质，具有添骨髓、增血液、减缓衰老、延年益寿的保健功效。

动物骨髓中富含有利于智力发育的磷脂质、磷蛋白等，骨头中含有丰富的钙质，都是很有营养的食物，一般人都可以食用，骨髓中脂肪含量较高，肥胖、高脂血症等病人不宜过多食用。骨头中的钙需要长时间的熬制，使钙质充分溶出，才容易被人体利用；

化学成份：牛髓每100g含水3g，蛋白质0.5g，脂肪95.8g，灰分0.3g，硫胺素(thiamine)微量，核黄素(riboflavine)0.01mg，烟酸(nicotinic acid)0.05mg。其脂肪酸含率如次：月桂酸(lauricacid)0.1％，肉豆蔻酸(myristicacid)2.6％，棕榈酸(cetylicacid)32.3％，硬脂酸(stearic acid)15.5％，十四(碳)烯酸(tetradecenicacid)0.7％，十六(碳)烯酸(hexadecenicacid)3.0％，油酸(oleic acid)43.2％，亚油酸(linoleic acid)2.6％，不皂化物0.5-0.6％。

目前，我国还没有利用超滤膜回收骨髓中蛋白质资源中有效方法，因此建立高效，低成本，绿色的回收蛋白质的方法很必要；

本发明通过研究发现，骨髓中含有丰富的蛋白质和多肽类成分，根据来源蛋白质含量有差异，平均含量可以达到2-5％。我区畜牧业总产值达到318.37亿元，占农业产值的24.5％，低于全国平均水平。主要畜产品产量快速增长，2009年畜产品总量达到305.15万t。肉类总产量达到115.4万t，占到畜产品总量的43.7％，肉类人均占有量居全国第17位，其中羊肉人均占有量居全国第3位，牛肉人均占有量居全国第3位。奶类产量125.24万t，占到畜产品总量的47.5％，人均占有量居全国第6位。蛋类产量23.2万t，占到畜产品总量的8.8％。禽肉产量8.1万t，占到畜产品总量的3.0％。反应出新疆羊肉、牛肉和奶业依然是畜产品中竞争力比较强的主要产品。

将新疆、内蒙古、西藏、青海、甘肃五大牧业省区主要畜产品产量数据经过计算取得相关比较参数，即可得到各省区主要畜产品竞争力的比较值。新疆主要畜产品竞争力(参数)由强到弱的排序为：羊肉(5.93176)—牛肉(2.12851)—奶类(1.76865)—禽肉(0.26783)—猪肉(0.23718)—禽蛋(0.12540)。我国是个畜禽消费大国，但多集中于畜禽肉类的消费"大量的畜禽骨骼得不到利用"既浪费了这种营养成分丰富且比例合理的资源"又在骨处理的问题上污染了环境"造成一定的环境压力。

因此，提取回收骨髓中的蛋白质和多肽，结合这个特色丰富的营养成分开发具有抗微生物功能的多肽粉是很有现实意义。

膜分离技术是一门建立在高分子材料学基础上的新兴边缘学科。由于分离过程中不受热，无相态和化学变化，兼有过程简单、易于自动化控制等特性，已广泛应用于金属、纺织、制革、造纸、化工、食品、生化、医药、保健、水处理和国防等工业，成为当今分离科学中最重要的手段之一。膜分离是一种利用天然或人工合成的，具有选择透过性的高分子薄膜，借助不同的推动力，在膜相际之间进行传质，以达到不同组分的分离、分级、提纯和浓缩的技术。膜分离过程根据推动力的不同，大体可分为两类。一类是以压力为推动力的膜进程，如超滤；另一类是以电力为推动力的膜进程，在乳品工业领域，主要应用的是以压力为推动力的膜分离过程。以压力为推动力的膜分离过程，根据膜对不同组分的截留能力可以分为：反渗透(RO)、纳米过滤(NF)、超滤(UF)、微滤(MF)。根据分离物的大小可选用不同孔径或截留分子量的膜。

本发明建立利用现代绿色膜分离工艺技术分离纯化，并通过喷雾干燥实现产业化生产和应用；该骨髓蛋白质是由肉类加工企业生产中产生的骨头废料为原料，利用绿色环保膜分离和喷雾干燥技术相结合，经过独特的工艺精制而成的天然蛋白质。

发明内容

本发明目的在于，提供一种骨髓蛋白质和多肽的超滤膜制备方法及其应用，该方法以牛、羊、马、骆驼或其它动物屠宰场的动物骨骼里面的新鲜骨髓为原料，采用骨髓与骨头分类，清水清理、液氮冷冻粉粹得到骨髓粉，利用温水溶液提取，油脂成分充分脱脂，再利用现代超滤膜技术制备了截留分子量为10KDa的蛋白质，再利用现代喷雾干燥技术或冷冻干燥精制而成。该骨髓蛋白质被验证其抗细菌和真菌活性，不但是具有广泛的抗微生物活性，同时具有增强体液免疫及全身免疫的功能，富含人体易消化和吸收的纯天然植物来源多肽和蛋白质。该蛋白质的特点是既保留了骨髓原有的蛋白质的同时还实现变废为宝和资源充分利用的目的；该蛋白质作为天然抗菌剂、食品添剂或药物，可用于食品和医药行业。

本发明所述的一种骨髓蛋白质和多肽的超滤膜制备方法，该方法以牛、羊、马、骆驼或其它动物屠宰场的动物骨骼里面的新鲜骨髓为原料，具体操作按下列步骤进行：

a、取新鲜骨髓100g，清洗3次，去掉骨头砸碎和血迹，切碎小分块，按重量比为1:5加入液氮粉碎，反复粉碎3-4次，得到骨髓粉碎粉，低温冰箱保存备用；

b、将步骤a中清洗好的骨髓粉碎粉中加入重量比1:10的蒸馏水，置磁力搅拌器上提取3-4小时，温度30-40℃，每次提取2-3次，减压抽滤，合并提取液，分离杂物，得到提取液备用；

c、将步骤b得到的提取液，置温度4℃过夜，使油水层分离，取出上层油层，将下层提取层置分液漏斗，按料液体积比为1:5加入石油醚或正己烷，不停摇进行脱脂，静止3-5h至上层未见无油状物，得到脱脂的粗提液；

d、将步骤c得到的粗提液，浓缩，并在12000转/分下，温度4℃离心10min，取上清液，得到骨髓蛋白提取液；

e、将步骤d得到的骨髓蛋白粗提取液，采用截留分子量为10KDa的再生纤维素平板膜，在压力0.10MPa，温度25℃，流速35m/s，进行大分子和小分子成分的分离和浓缩，将骨髓蛋白质滞留和渗透液分别收集，得到10KD载留蛋白质液和10KD滤过液；

f、将步骤e得到10KD载留蛋白质液和10KD滤过液，分别利用旋转蒸发仪浓缩至3-5倍，依次离心，上清液喷雾干燥或冷冻干燥，过筛，紫外灭菌，包装，即可得到分别为10KD载留蛋白部分骨髓蛋白质和10KD滤过多肽部分。

所述方法获得的骨髓蛋白质在制备抗细菌生物活性的药物中的用途。

所述方法获得的骨髓蛋白质在制备抗真菌生物活性的食品中的用途。

所述方法获得的骨髓蛋白质在制备食品添加剂中的用途。

本发明所述的一种骨髓蛋白质和多肽的超滤膜制备方法及其应用，该方法中的原料为肉类加工企业或畜牧屠宰场产生的骨头废料，采用水清洗前处理之后的新鲜骨髓利用蒸馏水水浴水搅拌提取，其中的脂质成分利用石油醚或正己烷萃取其没有脂质成分在水溶部分，适当浓缩、离心，其上清液用采用截留分子量为10KDa的再生纤维素平板膜分离，其滞留和渗透溶液分别浓缩，并利用现代喷雾干燥技术或冷冻干燥精制而成的骨髓蛋白质与多肽粉；骨髓蛋白质与多肽粉的成分利用液质联用(LC/MS)仪器验证证实，其含有分10KDa截留蛋白部分分子量为11382.83、11448.82、12664.58、15063.90、15064.11、18997.11；10KDa滤过多肽部分分子量为1718.20、2037.50、2066.45、2108.59、2140.07 2454.12、2570.24、2586.26、2673.65、3110.94、3111.95、3118.87、4222.14、4223.14、4289.27、6290.66、6504.00、6589.84、7787.93、8685.97、9285.85；该骨髓蛋白质被验证其抗细菌和真菌活性，具有广泛的抗微生物活性，同时具有增强体液免疫及全身免疫的功能，富含人体易消化和吸收的纯天然来源多肽和蛋白质。其蛋白质和多肽纯度高、生物活性强，而且提取方法简单可行，提取全程在低温环境下操作，更好的保留了骨髓提取物的活性成分，该蛋白粉部位的特点是既保留了骨髓蛋白质营养的同时还实现变废为宝和资源充分利用的目的；该骨髓蛋白质与多肽粉作为天然抗菌剂，可应用于作为治疗或预防各种骨科病相关的药物或保健品的制备原料，可用于食品和医药行业。

附图说明

图1为本发明BCA法测定蛋白质浓度的标准曲线，其中方程式为：y＝247.22x²+427.9x-91.604，相关系数为0.9989。

图2为本发明蛋白质浓度测定结果对比图，其中1为水作为提取液的骨髓蛋白、2为骨髓液氮冷冻研磨水提的蛋白、3为液氮研磨水提超滤膜分离10KD以上部分、4为液氮研磨水提超滤膜分离10KDa以下部分。

图3为本发明聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)-考马斯亮蓝染色图，其中1为水作为提取液的骨髓蛋白、2为骨髓液氮研磨水提的骨髓蛋白。

图4为本发明聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)-考马斯亮蓝染色图，其中1为液氮研磨水提超滤膜10KDa载留部分、2为液氮研磨水提超滤膜分离10KDa滤过部分。

图5为本发明提取的四种蛋白质与多肽抑菌活性对比图，其中—◆—系列1中，1为水作为提取液的骨髓蛋白、2为骨髓液氮研磨水提的骨髓蛋白、3为液氮研磨水提超滤膜10KDa载留部分、4为液氮研磨水提超滤膜分离10KDa滤过部分对白色念球菌的抑止活性；—■—系列2中，1为水作为提取液的骨髓蛋白、2为骨髓液氮研磨水提的骨髓蛋白、3为液氮研磨水提超滤膜10KDa载留部分、4为液氮研磨水提超滤膜分离10KDa滤过部分对大肠杆菌的抑止活性。

图6为本发明10KDa载留部分液质联用(LC/MS)图谱。

图7为本发明10KDa滤过部分液质联用(LC/MS)图谱。

具体实施方式

实施例1

a、取新鲜骨髓100g，清洗3次，去掉骨头砸碎和血迹，预冷，切碎小分块，按重量比为1:5加入液氮粉碎，反复粉碎3-4次，得到骨髓粉碎粉，低温冰箱保存备用；

b、将步骤a粉碎好好的骨髓样品中加入重量比1:10的蒸馏水，置磁力搅拌器上提取2小时，温度30℃，每次提取2次，减压抽滤，合并提取液，分离杂物，得到提取液备用；

c、将步骤b得到的提取液，置温度4℃过夜，使油水层分离，取出上层油层，将下层提取层置分液漏斗，按料液体积比为1∶5加入石油醚，不停摇进行脱脂，静止3h至上层未见油状物，得到脱脂的粗提取液；

d、将步骤c得到的粗提取液，在12000转/分下,温度4℃离心10min，取上清液，得到骨髓蛋白粗提取液；

f、将步骤e得到的10KD载留蛋白质液和10KD滤过液，分别利用旋转蒸发仪浓缩至3-5倍，依次离心，上清液喷雾干燥，过筛，紫外灭菌，包装，得到10KD载留骨髓蛋白粉(0.96g)和10KD滤过多肽部分(0.28g)，骨髓活性蛋白提取率为48％，多肽提取率14％。

实施例2

a、取新鲜骨髓100g，清洗3次，使去掉骨头砸碎和血迹，切碎小分块，按重量比为1:5加入液氮粉碎，反复粉碎3-4次，得到骨髓粉碎粉，低温冰箱保存备用；

b、将步骤a骨髓粉碎粉中加入重量比1:10的蒸馏水，置磁力搅拌器上提取4小时，温度40℃，每次提取3次，减压抽滤，合并提取液，分离杂物，得到提取液备用；

c、将步骤b得到的提取液，置温度4℃过夜，使油水层分离，取出上层油层，将下层提取层置分液漏斗，按料液体积比为1∶5加入正己烷，不停摇进行脱脂，静止5h至上层未见无油状物，得到脱脂的粗提取液；

d、将步骤c得到的粗提取液，在12000转/分下，温度4℃离心10min，取上清液，得到骨髓蛋白粗提取液；

f、将步骤e得到骨髓蛋白质滞留和渗透液两种10KD载留和10KD滤过部分，分别利用旋转蒸发仪浓缩至3-5倍，依次离心，上清液喷雾干燥或冷冻干燥，过筛，紫外灭菌，包装，分别得到10KD载留骨髓蛋白粉(1.14g)和10KD滤过多肽部分(0.40g)，骨髓活性蛋白提取率为57％，多肽提取率为20％。

实施例3

a、取新鲜骨髓100g，清洗3次，使去掉骨头砸碎和血迹，切碎小分块，按重量比为1∶5加入液氮粉碎，反复粉碎3次，得到骨髓碎粉，低温冰箱保存备用；

b、将步骤a骨髓粉碎粉中加入重量比1:10的蒸馏水，置磁力搅拌器上提取4小时，温度35℃，每次提取2次，减压抽滤，合并提取液，分离杂物，得到提取液备用；

c、将步骤b得到的提取液，置温度4℃过夜，使油水层分离，取出上层油层，将下层提取层置分液漏斗，按料液体积比为1∶5加入正己烷，不停摇进行脱脂，静止4h至上层未见油状物，得到脱脂的粗提取液；

d、将步骤c得到的粗提取液，在12000转/分下,温度4℃离心10min，取上清液，得到骨髓蛋白提取液；

e、将步骤d得到的骨髓蛋白提取液，采用截留分子量为10KDa的再生纤维素平板膜，在压力0.10MPa，温度25℃，流速30m/s下，进行大分子和小分子成分的分离和浓缩，将骨髓蛋白质滞留和渗透液分别收集，得到10KD载留蛋白质液和10KD滤过液；

f、将步骤e得到10KD载留蛋白质液和10KD滤过液，分别利用旋转蒸发仪浓缩至3-5倍，依次离心，上清液喷雾干燥或冷冻干燥，过筛，紫外灭菌，包装，分别得到10KD载留骨髓蛋白粉(1.09g)和10KD滤过多肽部分(0.30g)，骨髓活性蛋白质提取率54.5％，多肽提取率15％。

实施例4

a、取新鲜骨髓100g，清洗3次，使去掉骨头砸碎和血迹，切碎小分块，按重量比为1∶5加入液氮粉碎，反复粉碎3次，得到骨髓粉碎粉，低温冰箱保存备用；

b、将步骤a骨髓粉碎粉中加入重量比1:10的蒸馏水，置磁力搅拌器上提取3小时，温度40℃，每次提取3次，减压抽滤，合并提取液，分离杂物，得到提取液备用；

c、将步骤b得到的提取液，置温度4℃过夜，使油水层分离，取出上层油层，将下层提取层置分液漏斗，按料液体积比为1∶5加入石油醚，不停摇进行脱脂，静止5h至上层未见无油状物，得到脱脂的粗提取液；

d、将步骤c得到的粗提取液，在12000转/分下，温度4℃离心10min，取上清液，得到骨髓蛋白提取液；

e、将步骤d得到的骨髓蛋白提取液，采用截留分子量为10KDa的再生纤维素平板膜，在压力0.06MPa，温度20℃，流速25m/s，进行大分子和小分子成分的分离和浓缩，将骨髓蛋白质滞留和渗透液分别收集，得到10KD载留蛋白质液和10KD滤过液；

f、将步骤e得到10KD载留蛋白质液和10KD滤过液，分别利用旋转蒸发仪浓缩至3-5倍，依次离心，上清液喷雾干燥或冷冻干燥，过筛，紫外灭菌，包装，分别得到10KD载留骨髓蛋白粉(0.85g)和10KD滤过多肽部分(0.33g)，骨髓活性蛋白质提取率42.5％，多肽提取率16.5％。

实施例5

a、取新鲜骨髓100g，清洗3次，使去掉骨头砸碎和血迹，切碎小分块，按重量比为1∶5加入液氮粉碎，反复粉碎4次，得到骨髓粉碎粉，低温冰箱保存备用；

b、将步骤a骨髓粉碎粉中加入重量比1:10的蒸馏水，置磁力搅拌器上提取4小时，温度30℃，每次提取3次，减压抽滤，合并提取液，分离杂物，得到提取液备用；

c、将步骤b得到的提取液，置温度4℃过夜，使油水层分离，取出上层油层，将下层提取层置分液漏斗，按料液体积比为1∶5加入正己烷，不停摇进行脱脂，静止3h至上层未见无油状物，得到脱脂的粗提取液；

e、将步骤d得到的骨髓蛋白提取液，采用截留分子量为10KDa的再生纤维素平板膜，在压力0.15MPa，温度25℃，流速30m/s，进行大分子和小分子成分的分离和浓缩，将骨髓蛋白质滞留和渗透液分别收集，得到10KD载留蛋白质液和10KD滤过液；

f、将步骤e得到10KD载留蛋白质液和10KD滤过液，分别利用旋转蒸发仪浓缩至3-5倍，依次离心，上清液喷雾干燥或冷冻干燥，过筛，紫外灭菌，包装，分别得到10KD载留骨髓蛋白粉(0.80g)和10KD滤过多肽部分(0.46g)，骨髓活性蛋白质提取率40％，多肽提取率23％。

实施例6

a、取新鲜骨髓100g，清洗3次，使去掉骨头砸碎和血迹，切碎小分块，按重量比为1:5加入液氮粉碎，反复粉碎4次，得到骨髓粉碎粉，低温冰箱保存备用；

b、将步骤a骨髓粉碎粉中加入重量比1:10的蒸馏水，置磁力搅拌器上提取4小时，温度35℃，每次提取3次，减压抽滤，合并提取液，分离杂物，得到提取液备用；

c、将步骤b得到的提取液，置温度4℃过夜，使油水层分离，取出上层油层，将下层提取层置分液漏斗，按料液体积比为1∶5加入正己烷，不停震摇进行脱脂，然后静止5h至上层未见油状物，得到脱脂的蛋白粗提取液；

d、将步骤c得到的粗提取液，在12000转/分下，温度4℃下离心10min，取上清液得到骨髓蛋白粗提取液；

e、将步骤c得到的骨髓蛋白粗提取液，采用截留分子量为10KDa的再生纤维素平板膜，在压力0.10MPa，温度25℃，流速35m/s，进行大分子和小分子成分的分离和浓缩，将骨髓蛋白质滞留和渗透液分别收集，得到10KD载留蛋白质液和10KD滤过液；

f、将步骤e得到10KD载留蛋白质液和10KD滤过液，分别利用旋转蒸发仪浓缩至3-5倍，依次离心，上清液喷雾干燥或冷冻干燥，过筛，紫外灭菌，包装，分别得到10KD载留骨髓蛋白粉(1.16g)和10KD滤过多肽部分(0.34g)，骨髓活性蛋白提取率58％，多肽提取率17％。

实施例7(对比)

a、取新鲜骨髓100g，清洗3次，使去掉骨头砸碎和血迹，预冷，切碎小分块，低温冰箱保存备用；

c、将步骤b得到的提取液，置温度4℃过夜，使油水层分离，取出上层油层，将下层提取层置分液漏斗，按料液体积比为1∶5加入正己烷，不停摇进行脱脂，静止5h至上层未见油状物，得到脱脂的蛋白粗提取液；

d、将步骤c得到的粗提取液，在12000转/分下，温度4℃下离心10min，取上清液，

提取液浓缩至5-7倍，透析48小时，上清液喷雾干燥或冷冻干燥，过筛，紫外灭菌，包装，即得到骨髓蛋白粉1.2g，骨髓活性蛋白提取率为60％。

e、将步骤c得到的骨髓蛋白粗提取液，采用截留分子量为10KDa的再生纤维素平板膜，在压力0.10MPa，温度25℃，流速35m/s，进行大分子和小分子成分的分离和浓缩，将滞留和渗透液分别收集，得到骨髓蛋白质提取溶液；

f、将步骤e得到两种10KD载留和10KD滤过部分，即骨髓蛋白质滞留和渗透液，分别利用旋转蒸发仪浓缩至3-5倍，依次离心，上清液喷雾干燥或冷冻干燥，过筛，紫外灭菌，包装，即可得到分别为10KD载留骨髓蛋白粉(0.64g)和10KD滤过多肽部分(0.16g)，骨髓活性蛋白提取率32％，多肽提取率8％。

实施例8

蛋白质浓度的测定：

利用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法测定实施1-6所得骨髓蛋白质浓度：

标准曲线的绘制根据二喹啉甲酸(BCA)蛋白测量试剂盒说明书操作配制工作液，每50倍体积的二喹啉甲酸(BCA)试剂A溶液加1倍体积的二喹啉甲酸(BCA)试剂B溶液，充分混匀备用；根据表1吸取试剂盒中蛋白标准品牛血清蛋白，用水稀释，摇匀；各管分别取25μL于96孔板中，各加入175μL BCA工作液，轻微振荡，混匀，于温度37℃恒温箱中温育30min；取出96孔板，用酶标仪测定吸光度，测定波长为562nm；每个做三组平行，以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标进行回归运算。

表1系列稀释牛血清白蛋白(BSA)标准品

样品的测定：

精确称取2.5mg样品，加入1mL蒸馏水溶解，10000转/分离心2min，按照标准曲线操作方法，取25μL样品溶液于96孔板中，各加入175μL BCA工作液，轻微振荡，混匀，于温度37℃恒温箱中温育30min，取出96孔板，用酶标仪测定吸光度，测定波长为562nm，每个样品做三组平行，按照标准曲线计算蛋白质的含量；

实验结果：

由图2及表2可知，不管何种溶液提取，利用液氮研磨对原料处理的提取物蛋白质含量高于其他方法处理原料所得提取物；采用直接水提方法提取的蛋白提取率与含量均低于骨髓液氮粉碎处理和超滤膜处理的方法，故本发明采用的超滤膜用液氮冷冻粉碎水提的骨髓提取也分离成两个分子量段，为了便于直观分析和比较本表只列入其直接水提，液氮冷粉碎水提，液氮冷粉碎水提10KD载留液和10KD滤过液干燥部分。其中液氮研磨处理水提方法蛋白含量最高，可达1745μg/mL,占提取物的52.3％。超滤膜分离中10KD载留液部分蛋白含量高，可达1411μg/mL，占提取物的38.1％。

表2有效成分及蛋白质提取率

实施例9

蛋白质种类的确定：

试剂配制及样品处理：

样品缓冲液：0.5mL的0.5moL/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液(pH＝6.8)、2mL的10％十二烷基硫酸钠、1mL甘油、0.5mL的β-巯基乙醇、1mL的水、微量的溴酚蓝；

样品的处理：精密称取样品3mg溶于1mL蒸馏水中，摇匀，与样品缓冲液等体积混合，隔水煮沸10min，10000转/分，离心5min；

电极缓冲液：将15.1g三羟甲基氨基甲烷94g甘氨酸、50mL的10％十二烷基硫酸钠溶解并定容至4L；

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳储存液：30％(W/V)超纯级丙烯酰胺、0.8％(W/V)N,N-亚甲双丙烯酰胺；

10％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离胶配制：2.3mL的H₂O、5mL的30％(V/V)SDS-PAGE储存液、2.5mL的1.5moL/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶(pH＝8.8)、0.1mL的10％(W/V)十二烷基硫酸钠、0.1mL的10％(W/V)过硫酸铵、0.004mL的四甲基乙二胺；5％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离胶配制：3.4mL的H₂O、0.83mL的30％(V/V)

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳储存液、0.63mL的1.5moL/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液(pH＝8.8)、0.05mL的10％(W/V)十二烷基硫酸钠、0.05mL的10％(W/V)过硫酸铵、0.005mL的四甲基乙二胺；

电泳条件：恒压75伏，30min，然后恒压150伏，90min；

考马斯亮蓝固定液：25％异丙醇、10％的冰醋酸、65％水；

考马斯亮蓝染色液：将0.6g的考马斯亮蓝R-250溶解在300mL的固定液中，过滤，棕色瓶储存；

考马斯亮蓝脱色液：5％甲醇、7％的冰醋酸、88％水；

电泳结束后将凝胶片置于固定液中固定2h，然后放入考马斯亮蓝染色液中，置于摇床上染色2h，再用脱色液浸泡至背景色褪色完全为止。

棕色瓶储存；

考马斯亮蓝脱色液：5％甲醇、7％的冰醋酸、88％水；

电泳结束后将凝胶片置于固定液中固定2h，然后放入考马斯亮蓝染色液中，置于摇床上染色2h，再用脱色液浸泡至背景色褪色完全为止；

实验结果：

由图3中可以看出，骨髓样品水提部分(1)只能看出分子量为66KD得蛋白条带，未显示出分子量10或者1以下的多肽条带；后经过骨髓样品切碎，液氮进行冷冻粉碎水提(2)部分在6.5KD-9.5KD之间，出现多肽条带，说明低温下液氮冷冻粉碎能够充分粉碎，有效得提高产率，减少损耗，是一种骨髓前处理首选方的法之一；

由图4中可以看出，超滤膜浓缩中，10KD载留部分(1)在66KD处显示明显的条带，10KD滤过部分在9.5KD左右的分子量段电泳条带显示，表明在这位置出现多肽；这说明超滤膜10KD的平板膜能够有效的分离蛋白质和多肽部分，是一种简易而快速分离骨髓蛋白和多肽的有效方法之一。

实施例10

融化琼脂培养基，待其温度降至46±0.5℃，加入已培养好的菌液，使试验菌悬液浓度为5×105cfu/ml-5×106cfu/ml，倒平皿，15-20ml/皿，放置20mine使其凝固；

用琼脂打孔器打孔，直径为5-6mm，4-5孔/皿，均匀分布，各样片中心之间相距25mm以上，与平板的周缘相距15mm以上；

样品浓度为100mg/ml(100mM)；每孔加样品溶液20μl，盖好平皿，置于温度37℃培养箱30-60min，使溶液完全被吸收，倒置培养16h-18h，用游标卡尺测量抑菌环的直径并记录；

评价：

(1)抑菌作用的判断:

抑菌环直径大于7mm者，判为有抑菌作用；

抑菌环直径小于或等于7mm者，判为无抑菌作用；

试验结果：

由表3和图4、图5中可以看出骨髓经粉碎直接水提没有任何抗菌活性，可能骨髓组织没有完全破碎，从而有效成未过提取液中；液氮冷冻研磨水提法提取的蛋白质只对白色念球菌有抑菌活性，超滤膜分离两种浓缩部分对白色念球菌和大肠杆菌均有抑制活性，其中10KD载留部分活性较强，这与蛋白含量高低也有一定的剂量关系。

表3、骨髓蛋白质与多肽抗菌效果对比图

当抑制区直径≤7mm时，认为样品没有效果抗菌(水肿)：白色念珠菌ATCC10231；大肠杆菌ATCC11229；

实施例11

用安捷伦科技系列6520b chip-q-tof进行蛋白与肽质谱分析：

安捷伦1260紫外-可见光检测器、安捷伦1260自动进样器、安捷伦380型ELSD检测器，正离子质谱条件(ESI+/MS)条件：毛细管电压：65V，干燥气温度：温度350℃；锥孔电压175V，在液质模式300–3000m/z采用正离子模式质量范围；色谱柱：C₁₈柱子(150×75mm,5um)，乙腈，甲酸等均为色谱纯；

1流动相的配制：A：0.1％甲酸+5％乙腈，B：90％甲酸+0.1％乙腈；

2样品的制备：梯度洗脱(3mim,20％，30min，80％,35min,20％)，流速0.6μL/min，进样体积为10uL；

试验结果：

由图6可看出，10KDa载留部分，即蛋白质类成分在10mim-11.5mim中间出现一个大峰，分子量为15064.11(10.1815min)；其他峰分子量分别为11448.82(8.916mim)11382.83(9.491mim)、14553.73(9.491min)、12664.58(10.476min),15063.73(10.476min)、15064.11(10.476min)、18997.11(10.476min)；从这些分子量可以推断为10KDa纤维素平板膜可以有效的分离蛋白质成分；

由图7可看出，10KDa滤液部分，即多肽类成分在4.5mim-8mim中间出现一个大峰，分子量为4222.1428(5.129min)。其他峰分子量分别为4223.1485(5.129min)、2066.4531(5.954min)、4289.2793(6.410min)、2037.5016(6.1410min)、2454.125(6.1410min)、4450.4712(6.1410min)、1718.2039(6.660min)、3118.8771(6.915min)、2570.2401(7.396min)、3111.9524(7.396min)、3110.9421(7.396min)、6290.66(7.396min)、6504.0044(7.396min)、2439.0747(6.595min)、2586.2619(7.260min)；从这些分子量可以推断为10KDa纤维素平板膜可以有效的分离多肽类成分，而且骨髓中多肽成分数量较多。

Claims

1.一种骨髓蛋白质和多肽的超滤膜制备方法，其特征在于该方法以牛、羊、马、骆驼或其它动物屠宰场的动物骨骼里面的新鲜骨髓为原料，具体操作按下列步骤进行：

c、将步骤b得到的提取液，置温度4℃过夜，使油水层分离，取出上层油层，将下层提取层置分液漏斗，按料液体积比为1:5加入石油醚或正己烷，不停摇进行脱脂，静止3-5h至上层未见无油状物，得到脱脂的粗提液；d、将步骤c得到的粗提液，浓缩，并在12000转/分下，温度4℃离心10min，取上清液，得到骨髓蛋白提取液；

f、将步骤e得到10KD载留蛋白质液和10KD滤过液，分别利用旋转蒸发仪浓缩至3-5倍，依次离心，上清液喷雾干燥或冷冻干燥，过筛，紫外灭菌，包装，分别得到10KD载留蛋白部分骨髓蛋白质和10KD滤过多肽部分。

2.如权利要求1所述方法获得的骨髓蛋白质在制备抗细菌生物活性的药物中的用途。

3.如权利要求1所述方法获得的骨髓蛋白质在制备抗真菌生物活性的食品中的用途。

4.如权利要求1所述方法获得的骨髓蛋白质在制备食品添加剂中的用途。