CN103804480A - 一种虾原肌球蛋白过敏原基准物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种虾原肌球蛋白基准物的制备方法，属于生物技术领域。本发明涉及从虾肉中将原肌球蛋白这种主要的过敏原蛋白进行高效稳定的提取和分离纯化的方法，所述原肌球蛋白的纯化采用浸提、热沉淀、亲和层析等多种技术相结合的手段，将高过敏原性的原肌球蛋白从虾肉中分离出来，并保持原有活性。本发明方法获得的原肌球蛋白有助于对虾过敏的针对，并可用于免疫技术检测食品中的虾过敏原。
Description
技术领域
一种虾原肌球蛋白过敏原基准物的制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
随着世界经济的全球化和食品贸易的国际化，食物过敏已日益成为人们关注的食品安全问题。作为八大类食物过敏原之一，虾蟹等甲壳类海产品的过敏原成为大家关注的焦点。目前对于激发过敏反应的阈值还没有定论，而且存在很大的个体差异，但微量过敏原可以使大多数过敏患者产生过敏症状已经形成共识。为了对虾类过敏原进行有效的控制，必须建立灵敏可靠的检测方法，虽然目前很多单位和研究者根据自己的研究建立了不同的检测方法，但目前过敏原的研究基本处于各自为战的状态，不同研究机构的结果无法重复，造成巨大的浪费。而解决这一问题的关键在于获得合适的过敏原基准物。因此，制备虾类过敏原基准物对于规范过敏原的研究，尽快实现对过敏原的控制和利用具有重要的意义。
发明内容
要解决的技术问题
本发明所要解决的技术问题是提供一种虾类原肌球蛋白基准物的制备方法，同时保持原有的过敏原性。
技术方案
一种虾类原肌球蛋白基准物的制备方法，该指标方法采取低盐缓冲液浸提，热沉淀，离心和亲和层析等多种手段相结合的方式，将高活性的原肌球蛋白从虾肉中分离出来，最大程度的保持原有的过敏原性。制备步骤为：
(1)提取
将虾肉打碎并溶解与0.01mol/L、pH7.4，含0.01mg/mL酶抑制剂的磷酸盐缓冲液中，虾肉质量∶磷酸盐缓冲液体积比为1∶20，在4℃条件下磁力搅拌10h，并5000r/min离心20min，收集上清得到虾蛋白的抽提液。
(2)热沉淀
将虾蛋白抽提液加热至70℃，并保持20min后，在4℃条件下5000r/min离心20min，收集上清液，去除不耐热的杂蛋白，得到对热有一定耐受度的虾类抽提液，并进行冷冻干燥，得到热耐受虾蛋白粉末。
(3)饱和硫酸铵分级沉淀
按照硫酸铵浓度分配表，配制饱和度为30％的硫酸铵溶液，向其中加入热耐受虾蛋白粉末20g，4℃磁力搅拌2h、静置4h，并在4℃条件下5000r/min离心20min后，取上清液。向上清液中加入硫酸铵至饱和度达到45％，在4℃条件下磁力搅拌2h、静置4h，并在4℃条件下5000r/min离心20min，收集沉淀，用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液复溶。
(4)原肌球蛋白特异性IgG抗体亲和层析
将收集的蛋白组分装入透过分子量为2000的透析袋，用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液于4℃透析48h，然后用固定有原肌球蛋白特异性IgG的Sephrose亲和层析柱进行纯化，条件为：将柱体积10％的虾蛋白溶液加入柱子，在4℃条件下平衡2h，然后采用含有1M NaCl的0.01mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液进行洗脱，流速为0.2mL/min，每2min对洗脱液进行分部收集，在280nm和260nm进行紫外吸收检测，收集所需的样品，合并后在4℃条件下用去离子水透析24h，样品经冷冻干燥后即为虾原肌球蛋白的基准物质。
所述的鱼过敏原标准物的制备方法，第(1)步中得到的虾蛋白抽提液、第(2)步只能够得到的热耐受虾蛋白粉末、第(3)步得到的30％和45％饱和度的硫酸铵沉淀的蛋白组分和第(4)步得到的亲和纯化的各蛋白组分都进行变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，电泳条件为：12％分离胶，5％浓缩胶，恒压120V，步骤(4)得到的冷冻干燥蛋白粉条带单一，相对分子质量为36kDa的蛋白质组分即为虾原肌球蛋白基准物。
本发明的有益效果在于：所制备的虾原肌球蛋白基准物保持了其过敏原性，可以用于食品中虾过敏原的检测，同时还有助于在医学上对虾过敏进行准确的诊断。
附图说明
图1所制备的虾原肌球蛋白过敏原基准物的SDS-PAGE鉴定图。
具体实施方式
实施例1：虾类原肌球蛋白过敏原基准物的制备，步骤如下：
(1)提取
将虾肉打碎并溶解与0.01mol/L、pH7.4，含0.01mg/mL酶抑制剂的磷酸盐缓冲液中，虾肉质量∶磷酸盐缓冲液体积比为1∶20，在4℃条件下磁力搅拌10h，并5000r/min离心20min，收集上清得到虾蛋白的抽提液。
(2)热沉淀
将虾蛋白抽提液加热至70℃，并保持20min后，在4℃条件下5000r/min离心20min，收集上清液，去除不耐热的杂蛋白，得到对热有一定耐受度的虾类抽提液，并进行冷冻干燥，得到热耐受虾蛋白粉末。
(3)饱和硫酸铵分级沉淀
按照硫酸铵浓度分配表，配制饱和度为30％的硫酸铵溶液，向其中加入热耐受虾蛋白粉末20g，4℃磁力搅拌2h、静置4h，并在4℃条件下5000r/min离心20min后，取上清液。向上清液中加入硫酸铵至饱和度达到45％，在4℃条件下磁力搅拌2h、静置4h，并在4℃条件下5000r/min离心20min，收集沉淀，用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液复溶。
(4)原肌球蛋白特异性IgG抗体亲和层析
将收集的蛋白组分装入透过分子量为2000的透析袋，用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液于4℃透析48h，然后用固定有原肌球蛋白特异性IgG的Sephrose亲和层析柱进行纯化，条件为：将柱体积10％的虾蛋白溶液加入柱子，在4℃条件下平衡2h，然后采用含有1M NaCl的0.01mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液进行洗脱，流速为0.2mL/min，每2min对洗脱液进行分部收集，在280nm和260nm进行紫外吸收检测，收集所需的样品，合并后在4℃条件下用去离子水透析24h，样品经冷冻干燥后即为虾原肌球蛋白的基准物质。
实施例2：鱼过敏原蛋白的SDS-PAGE鉴定
对实施例1中第(1)、(2)、(3)、(4)步所获得的虾蛋白抽提液、热耐受虾蛋白粉末、饱和硫酸铵分级沉淀组分、亲和层析各峰组分进行SDS-PAGE鉴定。电泳条件为：12％分离胶，5％浓缩胶，恒压120V。图1中所制备的标准物质条带单一，相对分子量36kDa，与文献报道相一致。
Claims (2)
1.一种虾类原肌球蛋白过敏原基准物的制备方法。
制备步骤：
(1)提取
将虾肉打碎并溶解与0.01mol/L、pH7.4，含0.01mg/mL酶抑制剂的磷酸盐缓冲液中，虾肉质量∶磷酸盐缓冲液体积比为1∶20，在4℃条件下磁力搅拌10h，并5000r/min离心20min，收集上清得到虾蛋白的抽提液。
(2)热沉淀
将虾蛋白抽提液加热至70℃，并保持20min后，在4℃条件下5000r/min离心20min，收集上清液，去除不耐热的杂蛋白，得到对热有一定耐受度的虾类抽提液，并进行冷冻干燥，得到热耐受虾蛋白粉末。
(3)饱和硫酸铵分级沉淀
按照硫酸铵浓度分配表，配制饱和度为30％的硫酸铵溶液，向其中加入热耐受虾蛋白粉末20g，4℃磁力搅拌2h、静置4h，并在4℃条件下5000r/min离心20min后，取上清液。向上清液中加入硫酸铵至饱和度达到45％，在4℃条件下磁力搅拌2h、静置4h，并在4℃条件下5000r/min离心20min，收集沉淀，用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液复溶。
(4)原肌球蛋白特异性IgG抗体亲和层析
将收集的蛋白组分装入透过分子量为2000的透析袋，用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液于4℃透析48h，然后用固定有原肌球蛋白特异性IgG的Sephrose亲和层析柱进行纯化，条件为：将柱体积10％的虾蛋白溶液加入柱子，在4℃条件下平衡2h，然后采用含有1M NaCl的0.01mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液进行洗脱，流速为0.2mL/min，每2min对洗脱液进行分部收集，在280nm和260nm进行紫外吸收检测，收集所需的样品，合并后在4℃条件下用去离子水透析24h，样品经冷冻干燥后即为虾原肌球蛋白的基准物质。
2.根据权利要求1所述的虾类原肌球蛋白过敏原基准物的制备方法，其特征在于，第(1)步中得到的虾蛋白抽提液、第(2)步只能够得到的热耐受虾蛋白粉末、第(3)步得到的30％和45％饱和度的硫酸铵沉淀的蛋白组分和第(4)步得到的亲和纯化的各蛋白组分都进行变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，电泳条件为：12％分离胶，5％浓缩胶，恒压120V，步骤(4)得到的冷冻干燥蛋白粉条带单一，相对分子质量为36kDa的蛋白质组分即为虾类原肌球蛋白过敏原基准物。
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2012
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