CN102078605B - Vero细胞流感病毒疫苗制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种Vero细胞流感病毒疫苗制备方法，对疫苗纯化工艺进行改进，采用疏水层析和离子交换相结合的方法，再辅以其它纯化方法，可以制备成质量合格季节性三价流感疫苗和大流感储备疫苗。
Description
技术领域
本发明提供一种Vero细胞流感病毒疫苗制备方法，涉及多种流感病毒疫苗株在Vero细胞上的制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
传统的制备流感疫苗的方法是使用鸡胚制备的,国内使用鸡胚培养疫苗已经有50多年历史。目前使用的流感疫苗主要是鸡胚制备的灭活的流感三价裂解疫苗，包括甲型流感病毒株、H3N2和乙型流感病毒株以及大流感疫苗（包括H5N1等）。疫苗株的来源主要是由WHO根据每年全球流感病毒的变化规律推荐的用于下一年度流感疫苗生产用流感病毒流行株的表面抗原来确定的，将WHO推荐的流行野毒株与鸡胚高产株（A/PR/8/34（H1N1））双重感染产生重配或反遗传学重配，得到的新的疫苗株，在鸡胚上具有高产的特性，但鸡胚存在有潜在污染可能,以及潜在的鸡胚蛋白引起的变态反应，而且培养周期过长,不易于控制产量,不利于应对大规模的流感爆发；如使用SPF级鸡胚成本过高；再者流感病毒在鸡胚上传代易引起变异，而以Vero细胞和MDCK细胞传代的流感病毒其抗原性和HA1区氨基酸顺序几乎没有变化。流感病毒在鸡胚内容易发生变异，可能是造成禽流感流行的一个重要原因。为此世界卫生组织、美国政府等都鼓励发展细胞培养技术替代目前的鸡胚培养技术来生产流感疫苗。
在流感疫苗制备领域内许多厂家都进行了不屑努力，利用常规的组织培养技术，用已经建立MCDCK和Vero细胞等流感病毒敏感细胞种子库，进行流感疫苗的研究与生产。非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）是世界卫生组织推荐的疫苗生产细胞，属贴壁依赖和规定代次以内非致瘤性，现在采用Vero细胞生产的疫苗主要有狂犬病疫苗、乙型脑炎疫苗、出血热疫苗等。Vero细胞流感疫苗研发的关键技术难题是疫苗病毒株在Vero细胞上快速适应，建立能够快速培育流感病毒Vero细胞高产适应株，解决这一关键技术，为Vero细胞流感疫苗的制备打下坚实基础。
病毒纯化，即应用各种物理、化学方法，以不使病毒受损伤和失活为前提，去除宿主细胞组分等非病毒杂质，提纯出高纯度浓缩的病毒样品。一种好的病毒抗原纯化工艺可以有效去除病毒培养过程中的所带来的杂蛋白、宿主细胞DNA、内毒素、及其它杂质，并且具有很好的病毒抗原回收率及纯度。
传统的病毒类疫苗纯化采用蔗糖密度梯度超速离心纯化工艺，该工艺需要大型离心设备，价格高，上样量少，花费时间长，去除宿主细胞DNA效果也不理想，不适合疫苗产业化的要求；亲和层析方法虽然分离蛋白纯度高，但其对分离条件较严格，相对处理能力低，特别是由于易在表层形成蛋白胶质层，阻碍后期样品渗透，同样不适合大规模生产需要。采用常规的凝胶过滤层析虽然其条件温和、重复性好、便于产业化，在疫苗纯化工艺中被广泛采用，但去除杂蛋白和DNA效果并不明显，所以在疫苗制备纯化工艺中只能作为辅助手段。
目前国内对于Vero细胞等传代细胞的宿主细胞残余DNA，严格限制在每剂小于100pg，远远小于WHO和欧盟药典标准即小于10ng水平，因此应用传统的疫苗工艺很难达到我们国家药典标准，因此，需要对疫苗纯化工艺进行创新研究。
疫苗收获液经连续流离心后经0.45-1μm柱芯过滤，100KD-500KD膜包超滤浓缩至适宜血凝滴度。
疏水层析：疏水柱层析主要是利用病毒在一定硫酸铵浓度下，充分暴露其疏水性，从而使其能够结合在层析柱上，而部分杂蛋白由于疏水性弱，残余宿主细胞DNA不具有疏水性，不能结合，所以流穿出来，这样就可以达到去除杂蛋白及宿主细胞DNA目的，然后用凝胶层析或超滤除盐，减少高盐对病毒活性的影响
超滤及除盐：通过超滤去除硫酸铵，更换离子交换所使用缓冲液，并进行适当浓缩。
离子交换柱层析：利用病毒、杂蛋白和DNA的等电点不同，通过改变缓冲液浓度的办法，收集病毒，其操作简单，对病毒作用温和，可反复上样，上样量大，适合疫苗产业化的要求。
超滤浓缩及灭活：通过超滤浓缩，再加入β-丙内酯灭活。
再次离子交换层析：进一步去除宿主细胞残余DNA。
超滤及除盐：通过超滤去除盐类，并进行适当浓缩，即为疫苗原液。
目前尚无文献报道使用疏水层析方法纯化传统病毒性疫苗。
发明内容
本发明的目的之一是流感病毒疫苗株利用Vero细胞生产流感疫苗，通过一系列纯化，制备成季节性三价流感疫苗和大流感储备疫苗。
本发明利用流感病毒疫苗株感染Vero细胞生产流感疫苗。
本发明所述的Vero细胞流感病毒疫苗，其特征是：所述病毒抗原为季节性流感疫苗病毒，含有甲1、甲3、乙型流感病毒的当年流行株三价抗原，或H5N1型病毒流行株抗原。
本发明所述流感疫苗的生产方法，包括下面步骤：
1）（Vero）细胞为培养的单层细胞，规定代次以内无致瘤性，所述培养液为含小牛血清的普通细胞培养基；
2）疫苗病毒液的制备
用非洲绿猴肾Vero单层细胞经洗液冲洗后，加入0.005-1.0复合感染量的MOI病毒稀释液，（或35-37℃吸附1-4小时），弃吸附液，补加维持液置32-36℃培养，所述维持液为普通细胞培养基或含生长因子的无血清培养基，添加1-6μg/ml胰酶；所述洗液或含1-6μg/ml胰酶，不超过96小时收获病毒上清悬液；
3）疫苗病毒液的纯化
a）采用杯式或连续流离心（离心力5000-18000g），0.45-2.5μm柱芯过滤，100-500KD膜包超滤浓缩；
b）采用Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(Low Sub)进行疏水柱层析：超滤浓缩液加入至终浓度为10-40%硫酸铵后，用10-40%硫酸铵，0.01-0.05MPB缓冲液平衡层析柱1-4个柱体积后上样，上样体积以流穿峰达到一定高度时结束，然后用10-40%硫酸铵，0.01-0.05MPB缓冲液冲洗至基线，用0.01-0.05MPB缓冲液洗脱收集洗脱峰；
c）用超滤除盐后进行及阴离子交换层析，在一定盐浓度(0.2-1.0M NaCL)下，并经该盐浓度缓冲液平衡后上样，收集流穿峰，用高盐(1-4M NaCL)和高浓度NaOH(0.1-1M)处理再生；
d）100-500KD膜包超滤浓缩后β-丙内酯灭活24-48小时，37℃水解2小时（或2-8℃灭活及水解7-14天）；
e）阴离子交换层析，在(0.2-1.0M NaCL)浓度下缓冲液平衡后，调样品盐浓度(终浓度0.2-1.0 M NaCL)，进行离子交换层析，收集流穿峰；
f）100-500KD膜包超滤浓缩，经0.22-0.80μm滤膜澄清过滤即为疫苗原液，或超滤后裂解，并经分子筛及10KD超滤去除裂解剂后即为疫苗原液。
本发明的积极效果在于：对疫苗纯化工艺进行改进，采用疏水层析和离子交换相结合的方法，再辅以其它纯化方法，可以制备成质量合格的病毒性疫苗。
附图说明
图1为甲1型流感病毒疫苗宿主细胞残余DNA含量图谱；
图2为甲3型流感病毒疫苗宿主细胞残余DNA含量图谱；
图3为乙型流感病毒疫苗宿主细胞残余DNA含量图谱；
图4为流感病毒裂解疫苗（Vero细胞）宿主细胞残余DNA含量图谱；
图5为H5N1型禽流感全病毒疫苗（Vero细胞）宿主残余DNA含量图谱。
具体实施方式：
实施例1
甲1型毒种，Who批准的，所罗门株，A/Solomon/3/06 (H1N1)-,IVR-145,来源于英国NIBSC，批号：Ivr-145，06/234，代次E7 （鸡胚代次用E和数字表示，细胞用C和数字表示）Vero单层细胞，140-145代。
将A/Solomon/3/06 (H1N1)E7C0来源于NIBSC毒种感染Vero细胞和鸡胚进行传代，鸡胚传代后毒种代次为E8C0，血凝滴度为640，而Vero细胞传代代次为E7C1，血凝滴度为20-40。将鸡胚传代的E8C0代毒种感染Vero细胞继续传代，细胞病变达+++-++++时收获，并建立主代种子批（血凝滴度320）和工作种子批（血凝滴度480），并用于单价疫苗的制备。
225瓶单层Vero细胞3立升转瓶，细胞代次145，5日龄，用洗液冲洗细胞三遍，加0.005-0.1MOI，A/Solomon/3/06 (H1N1)E8C3工作种子批毒种37℃吸附1-4小时，弃吸附液，加含1-6微克/ml的普通培养基的维持液，33-36℃继续孵育，不超过96小时收获。收获病毒液量约90立升。
1）澄清浓缩：
病毒收获液经5000-18000g离心；0.45μm柱芯澄清过滤、100-500kd膜包超滤浓缩，并
经0.02MPBS洗滤后体积为16立升，即为待纯化的甲1型流感病毒抗原。
2）疏水层析：
取Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(Low Sub)疏水层析介质，按与水比例为
4：1混匀，充分搅拌后装填于层析柱中，柱体积为2000ml。
用0.5M NaOH溶液，以一定流速冲洗层析柱，至液体流出为PH8-14.0为止，保存2-24小时，用注射用水冲洗层析柱至中性为止，用10-40%硫酸铵，0.02MPB缓冲液平衡层析柱1-4个体积，将疫苗加入一定浓度硫酸铵并最终含10-40%硫酸铵的浓度，与平衡液硫酸铵浓度一致，上样体积以流穿峰达到一定高度时结束，以含有10-40%硫酸铵，0.02MPB缓冲液平衡层析柱1-4个体积，上样后继续用平衡液冲洗至基线，然后用PB缓冲液洗脱收集疫苗抗原，共上样两次，收集洗脱峰合计6500ml，收集样品经100-500KD超滤除盐后(收集体积为3000ml)进行离子交换层析。
将超滤纯化样品进行 Q Sepharose Fast Flow 离子交换层析，全程用紫外监测。
样品盐浓度为0.1-1.0M NaCL，层析时用0.02M PB，0.1-1.0MNaCL的缓冲液平衡和洗脱，收集流穿峰体积为3700ml，用0.5-4M NaCL和0.1-1M NaOH处理再生。
4）100-500KD膜包超滤浓缩体积为2000ml，按1：2000-1：4000β-丙内酯4℃灭活，48小时后37℃水解2小时（或4℃灭活7天-14天）。
5）Q Sepharose Fast Flow 离子交换层析，全程用紫外监测。将样品盐浓度调为0.1-1.0MNaCL层析时用0.02M PB，0.1-1.0MNaCL的缓冲液平衡和洗脱，收集流穿峰体积为2500ml，用0.5-4M NaCL和0.1-1M NaOH处理再生。
6）采用100-500KD膜包适当超滤浓缩及除盐，用0.06-0.2%Triton-101裂解病毒，并经分子筛Sepharose 4 Fast Flow去除裂解剂后即为疫苗原液。
收集分子筛第一峰即为病毒峰，并经10KD膜包超滤适当浓缩后体积为500ml，并经0.22-0.45微米滤膜澄清后即为单价的疫苗原液。
7）进行血凝素含量、内毒素、蛋白质含量、宿主残余DNA含量测定。
血凝素含量测定：
采用单向免疫扩散试验检测血凝素含量：
将抗原参考品和供试品分别加入到含有抗体参考品的1.5%琼脂糖凝胶板上，孔径为3mm，每孔为10μL，20-25℃放置至少18小时左右。用PBS浸泡1小时后，干燥、染色、脱色。准确测量抗原参考品和供试品形成的沉淀环直径，以抗原参考品形成的沉淀环直径对其相应抗原浓度作直线回归，求得直线回归方程，代入样品的沉淀环直径，即可得到样品的血凝素含量。
宿主细胞残余DNA测定：采用地高辛标记检测法，利用与标准参考DNA比较确定残余DNA含量。
蛋白含量测定采用Lowrry法，进行测定。
实验结果：
甲1型抗原回收率 72.6%
蛋白去除率 98.5%
内毒素含量 原倍合格
血凝素含量： 92.5μg/ml
宿主细胞残余DNA含量 小于100pg/ml
宿主细胞残余DNA含量图谱见图1。
结论：经此工艺纯化后，甲1型抗原回收率在70%以上，宿主细胞残余DNA含量在100pg以下。
实施例2
甲3型毒种，A/wisconsin/67/2005 (H3N2)-,NYMC-161,来源于NIBSC，批号：06/112，代次E9
SPF 种蛋：北京梅里亚维通实验动物技术有限公司
37℃生化培养箱中孵育，10日龄。
Vero单层细胞，140-145代；
将A/wisconsin/67/2005 (H3N2)E9C0来源于NIBSC毒种感染鸡胚进行传代，鸡胚传代后毒种代次为E10C0，血凝滴度为480，此毒种感染Vero细胞继续传代，细胞病变达+++-++++时收获，并建立主代种子批（血凝滴度240）和工作种子批（血凝滴度480），并用于单价疫苗的制备。
225瓶单层Vero细胞3立升转瓶，细胞代次145，5日龄，用洗液冲洗细胞三遍，加0.01-0.1MOI，A/wisconsin/67/2005 (H3N2)E10C3工作种子批毒种37℃吸附1-4小时，弃吸附液，加含1-6微克/ml的普通培养基的维持液，33-36℃继续孵育，不超过96小时收获。收获病毒液量约90立升。
3）澄清浓缩：
病毒收获液经5000-18000g离心；0.45μm柱芯澄清过滤、100-500kd膜包超滤浓缩，并
经0.02MPBS洗滤后体积为16立升，即为待纯化的甲3型流感病毒抗原。
4）疏水层析：
采用Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(Low Sub)疏水层析介质，按与水比例
为4：1混匀，充分搅拌后装填于层析柱中，柱体积为2000ml。
用0.5M NaOH溶液，以一定流速冲洗层析柱，至液体流出为PH8-14.0为止，保存2-24小时，用注射用水冲洗层析柱至中性为止，用10-40%硫酸铵，0.02MPB缓冲液平衡层析柱1-4个体积，将疫苗加入一定浓度硫酸铵并最终含10-40%硫酸铵的浓度，与平衡液硫酸铵浓度一致，上样体积以流穿峰达到一定高度时结束，以含有10-40%硫酸铵，0.02MPB缓冲液平衡层析柱1-4个体积，上样后继续用平衡液冲洗至基线，然后用PB缓冲液洗脱收集疫苗抗原，共上样两次，收集洗脱峰合计6300ml，收集样品经100-500KD超滤除盐后(收集体积为3500ml)进行离子交换层析。
将超滤纯化样品进行 Q Sepharose Fast Flow 离子交换层析，全程用紫外监测。
样品盐浓度为0.1-1.0M NaCL，层析时用0.02M PB，0.1-1.0MNaCL的缓冲液平衡和洗脱，收集流穿峰体积为4300ml，用0.5-4M NaCL和0.1-1M NaOH处理再生。
4）100-500KD膜包超滤浓缩体积为1900ml，按1：2000-1：4000β-丙内酯4℃灭活，48小时后37℃水解2小时（或4℃灭活7天-14天）。
5）Q Sepharose Fast Flow 离子交换层析，全程用紫外监测。将样品盐浓度调为0.1-1.0MNaCL层析时用0.02M PB，0.1-1.0MNaCL的缓冲液平衡和洗脱，收集流穿峰体积为2400ml，用0.5-4M NaCL和0.1-1M NaOH处理再生。
6）采用100-500KD膜包适当超滤浓缩及除盐，用0.06-0.2%TritonN-101裂解病毒，并经分子筛Sepharose 4 Fast Flow或10KD超滤去除裂解剂后即为疫苗原液。
收集分子筛第一峰即为病毒峰，并经10KD超滤适当浓缩后体积为500ml，并经0.22-0.45微米滤膜澄清后即为单价的疫苗原液。
7）进行血凝素含量、内毒素、蛋白质含量、宿主残余DNA含量测定。
血凝素含量测定：采用单向免疫扩散试验检测血凝素含量：
将抗原参考品和供试品分别加入到含有抗体参考品的1.5%琼脂糖凝胶板上，孔径为3mm，每孔为10μL，20-25℃放置至少18小时左右。用PBS浸泡1小时后，干燥、染色、脱色。准确测量抗原参考品和供试品形成的沉淀环直径，以抗原参考品形成的沉淀环直径对其相应抗原浓度作直线回归，求得直线回归方程，代入样品的沉淀环直径，即可得到样品的血凝素含量。
宿主细胞残余DNA测定：采用地高辛标记检测法，利用与标准参考DNA比较确定残余DNA含量。
蛋白含量测定采用Lowrry法，进行测定。
实验结果：
甲3型抗原回收率 73.2%
蛋白去除率 96.5%
内毒素含量 原倍合格
血凝素含量 93.2μg/ml
宿主细胞残余DNA含量 小于100pg/ml
甲3型流感疫苗宿主细胞残余DNA含量图谱见图2。
结论：经此工艺纯化后，甲3型抗原回收率在70%以上，宿主细胞残余DNA含量在100pg以下。
实施例3
乙型毒种，B/Malaysia/2506/2004,来源于英国NIBSC，批号：06/104，代次E4
SPF 种蛋：北京梅里亚维通实验动物技术有限公司
37℃生化培养箱中孵育，10日龄。
Vero单层细胞，140-145代；
将B/Malaysia/2506/2004E4C0来源于NIBSC毒种感染鸡胚和Vero细胞，血凝滴度，达240，传代后病毒代次为E5C0，而Vero细胞传代后代次为E4C1，血凝滴度达10。将B/Malaysia/2506/2004E4C1毒种回传鸡胚，血凝滴度可达480，再继续在Vero细胞上传代建立主代种子批（血凝滴度160）和工作种子批（血凝滴度240），并用于单价疫苗制备。
225瓶单层Vero细胞3立升转瓶，细胞代次145，5日龄，用洗液冲洗细胞三遍，加0.1-1.0MOI，B/Malaysia/2506/2004E5C3工作种子批毒种37℃吸附1-4小时，弃吸附液，加含1-6微克/ml的普通培养基的维持液，33-36℃继续孵育，不超过96小时收获。收获病毒液量约110立升。
5）澄清浓缩：
病毒收获液经5000-18000g离心；0.45μm柱芯澄清过滤、100-500kd膜包超滤浓缩，并
经0.02MPBS洗滤后体积为16立升，即为待纯化的乙型流感病毒抗原。
6）疏水层析：
取Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(Low Sub)疏水层析介质，按与水比例为
4：1混匀，充分搅拌后装填于层析柱中，柱体积为2000ml。
用0.5M NaOH溶液，以一定流速冲洗层析柱，至液体流出为PH8-14.0为止，保存2-24小时，用注射用水冲洗层析柱至中性为止，用10-40%硫酸铵，0.02MPB缓冲液平衡层析柱1-4个体积，将疫苗加入一定浓度硫酸铵并最终含10-40%硫酸铵的浓度，与平衡液硫酸铵浓度一致，上样体积以流穿峰达到一定高度时结束，以含有10-40%硫酸铵，0.02MPB缓冲液平衡层析柱1-4个体积，上样后继续用平衡液冲洗至基线，然后用PB缓冲液洗脱收集疫苗抗原，共上样两次，收集洗脱峰合计6600ml，收集样品经100-500KD超滤除盐后(收集体积为3500ml)进行离子交换层析。
将超滤纯化样品进行 Q Sepharose Fast Flow 离子交换层析，全程用紫外监测。
样品盐浓度为0.1-1.0M NaCL，层析时用0.02M PB，0.1-1.0MNaCL的缓冲液平衡和洗脱，收集流穿峰体积为4200ml，用0.5-4M NaCL和0.1-1M NaOH处理再生。
4）100-500KD膜包超滤浓缩体积为2000ml，按1：2000-1：4000β-丙内酯4℃灭活，48
小时后37℃水解2小时（或4℃灭活7天-14天）。
5）Q Sepharose Fast Flow 离子交换层析，全程用紫外监测。将样品盐浓度调为0.1-1.0MNaCL层析时用0.02M PB，0.1-1.0MNaCL的缓冲液平衡和洗脱，收集流穿峰体积为2600ml，用0.5-4M NaCL和0.1-1M NaOH处理再生。
6）采用100-500KD膜包适当超滤浓缩及除盐，用0.06-0.2%Triton N-101裂解病毒，并经分子筛Sepharose 4 Fast Flow或10KD超滤去除裂解剂后即为疫苗原液。
收集分子筛第一峰即为病毒峰，并经10KD 适当浓缩体积为400ml，并经0.22-0.45微米滤膜澄清后即为单价的疫苗原液。
7）进行血凝素含量、内毒素、蛋白质含量、宿主残余DNA含量测定。
血凝素含量测定：采用单向免疫扩散试验检测血凝素含量：
将抗原参考品和供试品分别加入到含有抗体参考品的1.5%琼脂糖凝胶板上，孔径为3mm，每孔为10μL，20-25℃放置至少18小时左右。用PBS浸泡1小时后，干燥、染色、脱色。准确测量抗原参考品和供试品形成的沉淀环直径，以抗原参考品形成的沉淀环直径对其相应抗原浓度作直线回归，求得直线回归方程，代入样品的沉淀环直径，即可得到样品的血凝素含量。
宿主细胞残余DNA测定：采用地高辛标记检测法，利用与标准参考DNA比较确定残余DNA含量。
蛋白含量测定采用Lowrry法，进行测定。
实验结果：
乙型抗原回收率 70.4%
蛋白去除率 96.2%
内毒素含量 原倍合格
血凝素含量 90.6μg/ml
宿主残余DNA含量 小于100pg/ml
乙型流感疫苗宿主残余DNA含量图谱见图3。
结论：经此工艺纯化后，乙型抗原回收率在70%以上，宿主残余DNA含量在100pg以下。
实施例4
经上述3个实施例制备的实验性裂解疫苗单价原液试验结果如下：
甲1型A/Solomon/3/06 (H1N1)血凝素含量： 92.5μg/ml 原液体积为500ml
甲3型A/wisconsin/67/2005 (H3N2) 血凝素含量 93.2μg/ml原液体积为500ml
乙型B/Malaysia/2506/2004血凝素含量 90.6μg/ml原液体积为400ml
为了制备季节性流感病毒裂解三价疫苗，需将三型裂解病毒液按1：1:1配比合并，各取三型病毒裂解原液300ml，配制成三价的流感裂解疫苗半成品，并进行全面检测。
实验结果如下：
内毒素含量 小于30EU/0.5ml
血凝素含量 甲1型30.84μg/ml ，甲3型30.60μg/ml ，乙型30.02μg/ml
宿主细胞残余DNA含量 小于100pg/0.5ml
流感裂解疫苗（Vero细胞）宿主细胞残余DNA含量图谱见图4。
结论：经此工艺制备的流感裂解疫苗（Vero细胞）经实验室检测血凝素含量合格，宿主细胞残余DNA含量符合《中华人民共和国药典》2010版三部标准。
实施例5
H5N1型毒种，A/Vietnam/1194/2004（NIBRG-14）来源于英国NIBSC，批号：09/184，代次E3
SPF 种蛋：北京梅里亚维通实验动物技术有限公司
37℃生化培养箱中孵育，11日龄。
Vero单层细胞，140-146代。
将A/Vietnam/1194/2004（NIBRG-14）来源于NIBSC毒种感染鸡胚，一代鸡胚血凝滴度，达320，传代后病毒代次为E4C0，再传Vero细胞后代次为E4C1，血凝滴度达160。再继续在Vero细胞上传代建立主代种子批（血凝滴度240）和工作种子批（血凝滴度320），并用于人用禽流感疫苗制备。
225瓶单层Vero细胞3立升转瓶，细胞代次145，5日龄，用洗液冲洗细胞三遍，加0.01-0.1MOI，A/Vietnam/1194/2004（NIBRG-14）工作种子批毒种37℃吸附1-4小时，弃吸附液，加含1-6μg/ml的普通培养基的维持液，33-36℃继续孵育，不超过96小时收获。收获病毒液量约90立升。
7）澄清浓缩：
病毒收获液经5000-18000g离心；0.45μm柱芯澄清过滤、100-500kd膜包超滤浓缩，并
经0.02MPBS洗滤后体积约为16立升，即为待纯化的H5N1型流感病毒抗原。
8）疏水层析：
取Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(Low Sub)疏水层析介质，按与水比例为
4：1混匀，充分搅拌后装填于层析柱中，柱体积为2000ml。
用0.5M NaOH溶液，以一定流速冲洗层析柱，至液体流出为PH8-14.0为止，保存2-24小时，用注射用水冲洗层析柱至中性为止，用10-40%硫酸铵，0.02MPB缓冲液平衡层析柱1-4个体积，将疫苗加入一定浓度硫酸铵并最终含10-40%硫酸铵的浓度，与平衡液硫酸铵浓度一致，上样体积以流穿峰达到一定高度时结束，以含有10-40%硫酸铵，0.02MPB缓冲液平衡层析柱1-4个体积，上样后继续用平衡液冲洗至基线，然后用PB缓冲液洗脱收集疫苗抗原，共上样两次，收集洗脱峰合计6400ml，收集样品经100-500KD超滤除盐后(收集体积为3900ml)进行离子交换层析。
将超滤纯化样品进行 Q Sepharose Fast Flow 离子交换层析，全程用紫外监测。
样品盐浓度为0.1-1.0M NaCL，层析时用0.02M PB，0.1-1.0MNaCL的缓冲液平衡和洗脱，收集流穿峰体积为4600ml，用0.5-4M NaCL和0.1-1M NaOH处理再生。
4）100-500KD膜包超滤浓缩体积为2000ml，按1：2000-1：4000β-丙内酯4℃灭活，48
小时后37℃水解2小时（或4℃灭活7天-14天）。
5）Q Sepharose Fast Flow 离子交换层析，全程用紫外监测。将样品盐浓度调为0.1-1.0MNaCL层析时用0.02M PB，0.1-1.0MNaCL的缓冲液平衡和洗脱，收集流穿峰体积为1500ml，用0.5-4M NaCL和0.1-1M NaOH处理再生。
6）采用100-500KD膜包适当超滤浓缩及除盐，收集膜上液体积为2100ml，并经0.22-0.45微米滤膜澄清后即为疫苗原液。
7）进行血凝素含量、内毒素、蛋白质含量、宿主残余DNA含量测定。
血凝素含量测定：采用单向免疫扩散试验检测血凝素含量：
将抗原参考品和供试品分别加入到含有抗体参考品的1.5%琼脂糖凝胶板上，孔径为3mm，每孔为10μL，20-25℃放置至少18小时左右。用PBS浸泡1小时后，干燥、染色、脱色。准确测量抗原参考品和供试品形成的沉淀环直径，以抗原参考品形成的沉淀环直径对其相应抗原浓度作直线回归，求得直线回归方程，代入样品的沉淀环直径，即可得到样品的血凝素含量。
宿主细胞残余DNA测定：采用地高辛标记检测法，利用与标准参考DNA比较确定残余DNA含量。
蛋白含量测定采用Lowrry法，进行测定。
实验结果：
H5N1型抗原回收率 71.8%
蛋白去除率 98.7%
内毒素含量 原倍合格
血凝素含量 26.52μg/ml
宿主残余DNA含量 小于100pg/ml
H5N1型禽流感全病毒疫苗（Vero细胞）宿主细胞残余DNA含量图谱见图5。
结论：经此工艺纯化后，H5N1型抗原回收率在70%以上，宿主细胞残余DNA含量小于100pg。
Claims (1)
1.一种利用甲1、甲3、乙型流感病毒的当年流行株或H5N1型病毒流行株感染Vero细胞生产流感疫苗的生产方法，包括下面步骤：
1)Vero细胞为培养的单层细胞，规定代次以内无致瘤性，所述培养液为含小牛血清的普通细胞培养基：
2）疫苗病毒液的制备
用非洲绿猴肾Vero单层细胞经洗液冲洗后，加入0.005-1.0 MOI对应的工作种子批毒种，37℃吸附1-4小时，弃吸附液，补加维持液置32-36℃培养；所述维持液为普通细胞培养基，添加1-6μg/ml胰酶；不超过96小时收获病毒上清悬液；
3）疫苗病毒液的纯化
a）采用离心力5000-18000g杯式或连续流离心，0.45μm柱芯过滤，300-500KD膜包超滤浓缩；
b）采用 Low Sub Phenyl Sepharose 6 Fast Flow进行疏水柱层析：用10-40%硫酸铵，0.02M PB缓冲液平衡层析柱1-4个体积，将疫苗加入一定浓度硫酸铵并最终含10-40%硫酸铵的浓度，与平衡液硫酸铵浓度一致，上样体积以流穿峰达到一定高度时结束，然后用10-40%硫酸铵，0.02M PB缓冲液冲洗至基线，用PB缓冲液收集洗脱峰；
c）用分子筛或超滤除盐后进行阴离子交换层析，在0.2-1.0M NaCL浓度下，并经该盐浓度缓冲液平衡后上样，收集流穿峰，用1-4M NaCL和0.1-1M NaOH处理再生；
d）300-500KD膜包超滤浓缩后β-丙内酯，4℃灭活7天-14天；
e）阴离子交换层析，在0.2-1.0M NaCL浓度下缓冲液平衡后，调样品盐浓度为0.2-1.0 M NaCL，进行离子交换层析，收集流穿峰；
f）对H5N1型病毒流行株用100-500KD膜包超滤浓缩，经0.22-0.45μm滤膜澄清过滤即为疫苗原液；对甲1、甲3、乙型流感病毒的当年流行株超滤后裂解，并经分子筛或10KD超滤去除裂解剂后即为疫苗原液。
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