CN103937754B

CN103937754B - 一种猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒纯化方法

Info

Publication number: CN103937754B
Application number: CN201410145400.1A
Authority: CN
Inventors: 米娜; 吴全忠; 李倬; 丁旭娜; 吕茂杰; 杨保收; 梁武; 李守军
Original assignee: Tianjin Ringpu Bio Technology Co Ltd
Current assignee: Tianjin Ringpu Bio Technology Co Ltd
Priority date: 2014-04-11
Filing date: 2014-04-11
Publication date: 2017-01-11
Anticipated expiration: 2034-04-11
Also published as: CN103937754A

Abstract

本发明提供了一种猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒纯化方法，该方法综合采用了微滤澄清纯化法，超滤浓缩纯化法，重复洗滤法等一系列工艺，最大限度的增大了PRRSV的回收效率，降低了纯化成本。以本发明制备的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒浓缩液成品尤其适用于制备疫苗，以本发明制备的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒浓缩液成品制备的疫苗相对于现有技术的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒疫苗而言安全性高、纯净度高、均一性好、免疫效果好。同时，本发明工艺简便、成本较低，具有突出的推广前景。

Description

一种猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒纯化方法

技术领域

本发明涉及一种病毒纯化方法，尤其涉及一种猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒纯化方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸障碍综合征又称猪蓝耳病，是一种危害养猪业的病毒性传染病。2006年夏秋季，我国南方部分省份发生猪“高热病”疫情，农业部积极组织科研人员联合攻关，确定猪蓝耳病变异病毒为主要病原，定名为“高致病性猪蓝耳病”。直至今日，疫病形势依然严峻，同其他病毒性疾病一样，目前尚无有效的治疗性药物用于蓝耳病的治疗，免疫接种是防制该病的最有效方法，目前商品化的蓝耳病疫苗主要是由经典株制备的弱毒活疫苗和由变异株制备的灭活苗，其安全性和有效性主要受病毒滴度，抗原纯净性，灭活工艺及佐剂等因素的影响。商品化疫苗如果直接以细胞繁殖的病毒液进行成品苗的生产，会受到细胞破碎产物，培养基成分，细胞代谢产物等杂质的影响，致使疫苗免疫动物后易发生过敏反应，发热反应等副作用。所以，提高病毒滴度和抗原纯净性是提升疫苗质量基本途径。

中空纤维膜过滤技术属于切向流过滤技术（Tangential Flow Filtration,TFF）的范畴，又称错流过滤（Cross-Flow Filtration，CFF）：料液以一定的流速在膜的上表面循环，小于膜孔径的物质可以透过膜到透过端，而大于膜孔径的物质会被膜截留，从而实现目标物质的浓缩以及不同物质的分级分离。

和传统的平板膜包相比，中空纤维柱具有纤维管状的开放式流道结构，无筛网的管状流道结构避免了料液的无规则剧烈湍流，因此具有更低的剪切力，温和的操作可以有效防止病毒表面糖蛋白的脱落和蛋白的聚集，有利于保护病毒的完整性，防止病毒颗粒聚集的同时有助于杂蛋白的透过和去除。

目前，对于猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PPRSV)的中空纤维澄清纯化及浓缩工艺尚无报道。

发明内容

本发明旨在解决现有猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒疫苗均一性差、免疫效果差等技术问题，提供一种使用微滤澄清纯化系统和超滤浓缩纯化系统实现的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒纯化方法。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒纯化方法，该方法通过微滤澄清纯化系统和超滤浓缩纯化系统来实现，过程如下：

1系统的组装

无菌条件下，将微滤澄清纯化系统和超滤浓缩纯化系统按照组装要求进行组装。在微滤澄清纯化系统中可安装无菌0.45μm或0.65μm、完整无损的中空纤维微滤膜，在超滤浓缩纯化系统中可安装无菌100KD或300KD、完整无损的中空纤维超滤膜。

2系统完整性检测

压力保持法检测系统的完整性。

3系统的处理

3.1清洗及灭菌

将0.5M NaOH溶液注满纯化系统的进料罐，浸泡处理20min，开启循环泵300rpm，进行纯化系统的清洗及灭菌处理30min。

3.2水洗及通量检测

灭菌结束后，排尽系统内的NaOH溶液。将无菌超纯水注满系统的进料罐，开启循环泵，300rpm循环30min，弃尽系统内的液体，如此反复水洗，直至纯化系统内PH为7.0左右。

3.3PBS处理

水洗结束后，弃尽最后一次超纯水。将0.1M PBS溶液注满进料罐，开启循环泵300rpm循环冲洗20min。

上述所述技术方案中，步骤3.1和3.2中用到的NaOH溶液起到清洗、灭菌作用，也可选用50%～80%的酒精溶液，或采用蒸汽灭菌的方式进行系统灭菌。

一种猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒纯化方法，该方法通过微滤澄清纯化系统和超滤浓缩纯化系统来实现，该方法包括以下步骤：

1）将无菌的吐温20按0.5%～10%(v/v)的比例加入猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）病毒液中，振荡处理；

2）将步骤1）振荡处理后的病毒液注入微滤澄清纯化系统的进料罐中，开启循环泵，循环一定时间后经0.45或0.65μm中空纤维微滤柱微滤，收集透过液待用；

3）以1:1(v/v)的比例将无菌的0.1M PBS缓冲液加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵循环一定时间，收集透过液，得到第一洗滤液待用；

4）以1:1(v/v)的比例将无菌的0.1M PBS缓冲液加入到步骤3）处理完毕的进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵循环一定时间，收集透过液，得到第二洗滤液待用；

5）以1:1(v/v)的比例将无菌的0.1M PBS缓冲液加入到步骤4）处理完毕的进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵循环一定时间，收集透过液，得到第三洗滤液待用；

6）将上述透过液、第一洗滤液、第二洗滤液、第三洗滤液混合均匀，得到混合液；

7）将步骤6）得到的混合液注入超滤浓缩纯化系统的进料罐，开启循环泵循环一定时间，经100KD或300KD中空纤维超滤柱进行过滤处理，弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为初级浓缩病毒液；

8）以1:1(v/v)的比例将0.1M PBS注入进料罐中的初级浓缩病毒液中，重悬，开启循环泵循环一定时间，弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为二级浓缩病毒液；

9）以1:1(v/v)的比例将0.1M PBS注入进料罐中的二级浓缩病毒液中，重悬，开启循环泵，循环一定时间，弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为三级浓缩病毒液；

10）以1:1(v/v)的比例将0.1M PBS注入进料罐中的三级浓缩病毒液中，重悬，开启循环泵，循环一定时间，弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为病毒浓缩液成品。

将上述制备的病毒浓缩液成品保存于-20℃。

上述猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒纯化方法，采用的是二步纯化法，第一步通过较大孔径的澄清纯化滤膜过滤病毒液，除去毒液中的细胞碎片；第二步通过较小孔径的澄清纯化滤膜洗滤第一步的滤过液，达到除去病毒液中的吐温20、小分子蛋白，细胞代谢产物的小分子物质等杂质及实现浓缩病毒等目的。

上述猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒纯化方法中，步骤1）所述的振荡处理时间优选为10min；步骤1）所述的比例优选为5%；步骤2）所述的微滤的滤膜孔径优选为0.65μm；步骤7）所述的超滤滤膜孔径优选为300KD；步骤2、3、4、5、7、8、9、10中所述的开启循环泵循环一定时间的操作条件均优选为500rpm循环30min；利用该方法制备的病毒浓缩液成品用于制备疫苗；上述所述病毒澄清纯化及浓缩方法，步骤2）中透过液的体积可以根据需要进行调整，优选为透过液体积达到原液的90%；步骤7）中的浓缩倍数可以根据实际需要进行调整，优选为浓缩10倍以上。

上述技术方案中，步骤1）所述的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒液是指制备得到的病毒原液，未经稀释处理；步骤1）加入吐温20起到乳化作用，能够有效避免病毒粒子聚集成团，从而提升后续过滤效率。

所述微滤澄清纯化系统是指GE公司制造的FlexStand中空纤维澄清纯化系统；所述微滤膜可以选自GE公司制造的、型号为CFP-6-D-9A，CFP-4-E-9A的Xample微滤柱膜；所述超滤膜可以选自GE公司制造的、型号为UFP-300-C-9A，UFP-100-C-9AXample的超滤柱膜。

上述制备的病毒浓缩液检测方法如下：

对纯化浓缩工艺过程中的病毒样品进行病毒滴度及蛋白浓度进行检测，以分析浓缩工艺的有效性。其中病毒滴度的检测方法为：

以TCID₅₀法对各样品的病毒滴度进行检测，纯化有效的判定标准为：浓缩纯化及重复洗滤的洗滤液检测不出存活病毒；浓缩液的病毒回收率在80%以上。

蛋白含量的测定方法为：

以蛋白浓度测定试剂盒对浓缩病毒液的蛋白残存量进行测定，可溶性蛋白的残存量应低于原液可溶性蛋白的10%，表明工艺有效。

以上对本发明的发明内容进行了详细说明。本发明的纯化方法综合采用了微滤澄清纯化法，超滤浓缩纯化法，重复洗滤法等一系列工艺，最大限度的增大了PPRSV的回收效率，降低了纯化成本。以本发明制备的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒浓缩液生产的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒疫苗相比于现有生产方式生产的疫苗，具有纯净度高，安全性高，均一性好、免疫效果好等优点，同时，本发明工艺简便、成本较低，具有突出的规模化应用前景。

具体实施方式

实施例所用仪器型号如下：

FlexStand中空纤维澄清纯化系统；

Xample微滤柱：CFP-6-D-9A(0.65μm)，CFP-4-E-9A(0.45μm)；

Xample超滤柱：UFP-300-C-9A(300KD)，UFP-100-C-9A(100KD)；

上述仪器均购自GE公司。

实施例所用试剂如下：

100L猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒液，10^7.3TCID₅₀/ml，由本公司生产；

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒抗体检测试剂盒，购自爱德士公司；

0.5M NaOH100L；

无菌0.1M PBS100L；

无菌高纯水100L。

吐温20，分析纯。

实施例1

1操作流程

1.1前处理

1.1.1系统的组装

无菌条件下，将澄清纯化系统和浓缩系统按照组装要求进行组装。在澄清系统中可安装无菌0.65μm、完整无损的中空纤维微滤膜，在浓缩系统中安装孔径为300KD的无菌中空纤维超滤膜。

1.1.2系统完整性检测

压力保持法检测纯化系统的完整性。

1.1.3系统的处理

清洗及灭菌：

将0.5M NaOH溶液注满系统的进料罐，浸泡处理20min，开启循环泵300rpm，进行系统的清洗及灭菌处理30min。

水洗及通量检测：

灭菌结束后，排尽系统内的NaOH溶液。将无菌超纯水注满系统的进料罐，开启循环泵，300rpm循环30min，弃尽系统内的液体，如此反复水洗，直至系统内PH为7.0左右。

PBS处理：

1.2病毒的澄清纯化

1.2.1病毒液的处理

将5L无菌吐温20加入100L猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PPRSV）病毒液中，振荡处理10min。

1.2.2病毒液的澄清

澄清纯化系统处理完毕后，弃尽系统内的PBS溶液，将振荡处理后的病毒液，注入澄清纯化系统的进料罐中，开启循环泵，500rpm循环30min，经0.65μm中空纤维微滤柱进行过滤纯化处理，收集透过液90L，进料罐内存留截留液10L。

1.2.3截留液的洗滤

第一次洗滤：

将10L无菌的0.1M PBS加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵500rpm循环30min，收集透过液10L，记为洗滤液1。

第二次洗滤：

将10L无菌的0.1M PBS加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵500rpm循环30min，收集透过液10L，记为洗滤液2。

第三次洗滤：

将10L无菌的0.1M PBS加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵500rpm循环30min，收集透过液10L，记为洗滤液3。

1.2.4病毒液的收集

将上述澄清纯化过程所收集的透过液及三次洗滤液混合均匀，得到混合液120L。

1.2.5初级浓缩

浓缩系统处理完毕后，将混合液注入浓缩系统的进料罐，开启循环泵，500rpm循环30min，经300KD中空纤维超滤柱进行纯化处理，弃去透过液，进料罐中剩余截留液10L，记为初级浓缩病毒液。

1.2.6浓缩液的洗滤

第一次洗滤：

将10L0.1M PBS注入进料罐中的初级浓缩液中，重悬，开启循环泵，500rpm循环30min，弃去透过液10L，进料罐中剩余截留液10L，记为二级浓缩病毒液。

第二次洗滤：

将10L0.1M PBS注入进料罐中的二级浓缩液，重悬，开启循环泵，500rpm循环30min，弃去洗滤液10L，进料罐中剩余截留液10L，记为三级浓缩病毒液。

第三次洗滤：

将10L0.1M PBS注入进料罐中的三级浓缩液，重悬，开启循环泵，500rpm循环30min，弃去洗滤液10L，进料罐中剩余截留液10L，即为病毒浓缩液成品。

1.2.7病毒液的收集

将经过上述处理后的得到的病毒浓缩液成品进行收集，保存于-20℃。

2有效性检测

对纯化浓缩工艺过程中的病毒样品进行病毒滴度及蛋白浓度进行检测，以分析浓缩工艺的有效性。

其中病毒滴度的检测方法为：

将浓缩后病毒用细胞维持液做10倍系列稀释，取10^-1～10^-1010个稀释度接种96孔培养板Marc-145细胞单层，每个稀释度重复8孔，每孔0.1ml，5%CO₂、37℃培养120小时，观察细胞病变（CPE），计算TCID₅₀。检测结果证实，浓缩液每0.1ml病毒含量10^7.0TCID₅₀，浓缩阶段的洗滤液无效价，病毒回收率接近100%。

蛋白含量的测定方法为：

取各样品以BCA蛋白浓度试剂盒进行测定，结果显示，可溶性蛋白残存率为9.3%。

3疫苗制备

以上述工艺制备的病毒浓缩液作为原料，进一步制备疫苗，其工艺步骤如下：

将纯化浓缩的PRRSV病毒液以0.01M的PBS按照浓缩倍数进行稀释。将稀释后的病毒液与纯化前的病毒液分别以体积比1:1与5%蔗糖脱脂乳稳定剂进行混合并分装冻干，20头份/瓶，分别记为PRRSV活疫苗1、PRRSV活疫苗2。

4疫苗安全检验

以上述工艺制备的PPRSV灭活疫苗1，PPRSV灭活疫苗2，无菌0.1M PBS溶液作为实验材料；取20日龄PPRSV抗体阴性健康易感仔猪15头作为实验动物。具体操作步骤如下：

4.1动物分组

将15头仔猪随机分为3组，每组5头。

4.2疫苗免疫

以0.01M PBS将疫苗进行溶解，1ml/头份。

颈部注射两种疫苗及PBS于实验用仔猪，如下操作：

第一组，每头仔猪颈部肌肉注射4ml PPRSV活疫苗1，共5头；

第二组，每头仔猪颈部肌肉注射4ml PPRSV活疫苗2，共5头；

第三组，每头仔猪颈部肌肉注射4ml PBS，共5头。

疫苗免疫后连续观察28天。

4.3实验结果

免疫后，各组仔猪均无不良反应，注射部位吸收良好。

5疫苗效力检验

5.1仔猪免疫试验

以PPRSV活疫苗1，PPRSV活疫苗2，无菌0.1M PBS溶液作为实验试剂，取30日龄PPRSV抗体阴性健康易感仔猪15头作为实验动物。具体实验步骤如下：

5.1.1试验动物分组

将15头仔猪随机分为3组，每组5头。

5.1.2疫苗免疫

颈部肌肉注射两种疫苗及PBS于试验用仔猪，如下操作：

第一组，每头仔猪颈部肌肉注射1ml PPRSV活疫苗1，共5头；

第二组，每头仔猪颈部肌肉注射1ml PPRSV活疫苗2，共5头；

第三组，每头仔猪颈部肌肉注射1ml PBS，共5头。

5.1.3采血及抗体检测

免疫之前及免疫后每周采血一次，共6次，分离血清，用于血清抗体检测；每周测量体重。

5.1.4实验结果

1）三组动物免疫攻毒后增重无明显差异。

2）免疫后1个月内，PRRSV活疫苗1组仔猪抗体转阳时间明显早于PRRSV活疫苗2组；免疫后期抗体水平差异不明显。

综上所述，利用本发明纯化得到的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒浓缩纯化液成品适用于制备猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒疫苗，其安全性良好、免疫效力显著。

实施例2

1）将无菌吐温20按10%(v/v)的比例加入猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PPRSV）病毒液中，振荡处理；

2）将步骤1）振荡处理后的病毒液注入微滤澄清纯化系统的进料罐中，开启循环泵，循环一定时间后经0.45μm中空纤维微滤柱微滤，收集透过液待用；

7）将步骤6）得到的混合液注入超滤浓缩纯化系统的进料罐，开启循环泵循环一定时间，经100KD中空纤维超滤柱进行过滤处理，弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为初级浓缩病毒液；

实施例3

1）将无菌吐温20按0.5%(v/v)的比例加入猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PPRSV）病毒液中，1000rpm振荡处理10min；

2）将步骤1）振荡处理后的病毒液注入微滤澄清纯化系统的进料罐中，开启循环泵以500rpm的条件循环30min，而后经0.65μm中空纤维微滤柱微滤，收集透过液待用；

3）以1:1(v/v)的比例将无菌的0.1M PBS缓冲液加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵以500rpm的条件循环30min，收集透过液，得到第一洗滤液待用；

7）将步骤6）得到的混合液注入超滤浓缩系统的进料罐，开启循环泵以500rpm的条件循环30min，经100KD中空纤维超滤柱进行超滤处理，弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为初级浓缩病毒液；

8）以1:1(v/v)的比例将0.1M PBS注入进料罐中的初级浓缩病毒液中，重悬，开启循环泵以500rpm的条件循环30min，弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为二级浓缩病毒液；

9）以1:1(v/v)的比例将0.1M PBS注入进料罐中的二级浓缩病毒液中，重悬，开启循环泵以500rpm的条件循环30min，弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为三级浓缩病毒液；

10）以1:1(v/v)的比例将0.1M PBS注入进料罐中的三级浓缩病毒液中，重悬，开启循环泵以500rpm的条件循环30min，弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为病毒浓缩液成品。

以上对本发明实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒纯化方法，其特征在于使用微滤澄清纯化系统和超滤浓缩纯化系统，并包括以下步骤：

1)将无菌的吐温20按0.5％～10％v/v的比例加入猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)病毒液中，振荡处理；

2)将步骤1)振荡处理后的病毒液注入微滤澄清纯化系统的进料罐中，开启循环泵以500rpm的转速循环30min，而后经0.45或0.65μm中空纤维微滤柱微滤，收集透过液待用；

3)以1:1v/v的比例将无菌的0.1M PBS缓冲液加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵以500rpm的转速循环30min，而后收集透过液，得到第一洗滤液待用；

4)以1:1v/v的比例将无菌的0.1M PBS缓冲液加入到步骤3)处理完毕的进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵以500rpm的转速循环30min，而后收集透过液，得到第二洗滤液待用；

5)以1:1v/v的比例将无菌的0.1M PBS缓冲液加入到步骤4)处理完毕的进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵以500rpm的转速循环30min，而后收集透过液，得到第三洗滤液待用；

6)将上述透过液、第一洗滤液、第二洗滤液、第三洗滤液混合均匀，得到混合液；

7)将步骤6)得到的混合液注入超滤浓缩纯化系统的进料罐，开启循环泵以500rpm的转速循环30min，而后经100KD或300KD中空纤维超滤柱进行过滤处理，弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为初级浓缩病毒液；

8)以1:1v/v的比例将0.1M PBS注入进料罐中的初级浓缩病毒液中，重悬，开启循环泵以500rpm的转速循环30min，而后弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为二级浓缩病毒液；

9)以1:1v/v的比例将0.1M PBS注入进料罐中的二级浓缩病毒液中，重悬，开启循环泵以500rpm的转速循环30min，而后弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为三级浓缩病毒液；

10)以1:1v/v的比例将0.1M PBS注入进料罐中的三级浓缩病毒液中，重悬，开启循环泵以500rpm的转速循环30min，而后弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为病毒浓缩液成品。

2.根据权利要求1所述的一种猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒纯化方法，其特征在于步骤1)所述的振荡处理时间为10min。

3.根据权利要求1所述的一种猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒纯化方法，其特征在于步骤1)所述的比例为5％。

4.根据权利要求1所述的一种猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒纯化方法，其特征在于步骤2)所述的微滤的滤膜孔径为0.45或0.65μm。

5.根据权利要求1所述的一种猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒纯化方法，其特征在于步骤7)所述的超滤滤膜孔径为300KD。

6.根据权利要求1～5所述的一种猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒纯化方法，其特征在于利用该方法制备的病毒浓缩液用于制备疫苗。