CN104673761B - 一种蓝耳病疫苗抗原纯化的方法 - Google Patents

一种蓝耳病疫苗抗原纯化的方法 Download PDF

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本发明涉及一种蓝耳病疫苗抗原纯化的方法，属于生物制品制备技术领域。该纯化方法包括如下步骤：(1)将收获的蓝耳病疫苗抗原离心澄清；(2)将步骤(1)得到的澄清抗原泵入超滤系统中进行纯化；(3)用缓冲液将步骤(2)中纯化得到的抗原液稀释至原体积继续纯化；(4)用缓冲液将步骤(3)中纯化得到的抗原液稀释至原体积继续纯化一段时间后，收获纯化的蓝耳病疫苗抗原。该方法对于降低蓝耳病疫苗的免疫副反应以及提高疫苗产品质量具有积极的意义。

Description

一种蓝耳病疫苗抗原纯化的方法
技术领域
本发明涉及生物制品技术领域，具体地涉及一种蓝耳病疫苗抗原纯化的方法。
背景技术
在我国，蓝耳病(猪繁殖与呼吸综合征病)疫苗的抗原由病毒接种细胞直接培养得到，没有后续的抗原下游处理工艺，该生产工艺生产的抗原杂质较多，导致疫苗的免疫副反应大，产品质量不稳定，影响疫苗免疫效果。近年来也有企业、学者在蓝耳病疫苗抗原下游加工处理方面进行了研究。唐艳玲等在2013年采用分子筛层析柱对蓝耳病灭活疫苗抗原进行纯化，蛋白去除率达到96％，病毒回收率在76.7％～82.4％之间。该方法可有效的去除抗原杂蛋白，但填充介质需要人工进行，受操作者的因素影响较大，工艺的可重复性较差，且该方法成本较高，不适用于当前的疫苗生产。
蓝耳病疫苗抗原通常来自于蓝耳病病毒感染细胞后进行细胞培养、获得的细胞培养的裂解产物，其中含有大量大小不等的细胞裂解碎片，成分较为复杂，因此纯化蓝耳病疫苗抗原的条件和方法较利用鸡胚生产的疫苗抗原的纯化方法更为复杂，需要对其纯化方法进行更进一步的研究和优化，以获得更高的抗原回收率。
发明内容
为克服上述缺陷，本发明的目的是提供一种工序简单、利于操作、成本低廉的蓝耳病疫苗抗原纯化的方法。
为实现上述目的，本发明利用分子量切割的超滤技术对蓝耳病疫苗抗原进行纯化，该方法包括如下步骤：
(1)将收获的蓝耳病疫苗抗原经离心机离心澄清，收取澄清的抗原液；
(2)将步骤(1)得到的澄清抗原液泵入超滤系统进行纯化；
(3)用缓冲液将步骤(2)中纯化得到的抗原液稀释至原体积继续纯化；
(4)用缓冲液将步骤(3)中纯化得到的抗原液稀释至原体积继续纯化后，收获纯化的蓝耳病疫苗抗原。
本发明提供的对蓝耳病疫苗抗原进行纯化的方法中，步骤(1)所述的蓝耳病疫苗抗原为经灭活剂灭活后的蓝耳病灭活疫苗抗原或蓝耳病活疫苗抗原。
其中，步骤(1)采用差速离心的方法。
所述差速离心为先采用4000-7000rpm离心20-40min，取上清弃沉淀，然后将上清液以8000-12000rpm离心50-70min，取上清备用。
优选地，所述差速离心为先采用6000rpm离心30min，取上清弃沉淀，然后将上清液以10000rpm离心60min，取上清备用。
本发明提供的对蓝耳病疫苗抗原进行纯化的方法中，步骤(2)中超滤系统为切向流超滤系统。
所述切向流超滤系统为平板式切向流超滤系统。
进一步地，切向流超滤系统膜包的分子量大小为100-500KD。
优选地，切向流超滤系统膜包的分子量大小为300KD。
其中，步骤(2)和步骤(3)中抗原液在超滤系统中进行纯化的同时需要将抗原液浓缩至原体积1/10以上，收取回流液，弃去透过液。
本发明方法中，所述的缓冲液为0.01M pH值7.2-7.4的PBS缓冲液。
抗原液泵入超滤系统进行纯化时，抗原液进入超滤膜包的流速不超过0.8ml/min/cm2。
本发明的有益效果：本发明提供了蓝耳病疫苗抗原纯化的方法，为提高我国蓝耳病疫苗质量提供新技术。该技术操作简单，可操作性强，工艺稳定，受人为因素影响较小，可重复性强。纯化的疫苗抗原蛋白去除率达到90％以上，抗原回收率达到100％。在蓝耳病疫苗生产中具有明显的优势和巨大的应用价值，对于降低蓝耳病疫苗的免疫副反应以及提高疫苗产品质量具有积极的意义。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1蓝耳病活疫苗抗原纯化
(1)将收获的蓝耳病活疫苗抗原先采用6000rpm离心30min，取上清弃沉淀，然后将上清液以10000rpm离心60min，取上清备用；
(2)将离心澄清后的抗原泵入分子量大小为300KD的切向流超滤系统进行纯化，进液速率为0.4ml/min/cm2，同时浓缩至原体积的1/10，弃去透过液，保留回流液；
(3)用无菌的PBS缓冲溶液将抗原浓缩液稀释至原体积，继续泵入超滤膜包进行纯化并将抗原液浓缩至原体积的1/10，进液速率为0.4ml/min/cm2；所述PBS溶液pH值为7.2，浓度为0.01mol/L；
(4)用无菌的PBS缓冲溶液(pH值为7.2，浓度为0.01mol/L)将抗原浓缩液稀释至原体积，继续泵入超滤膜包进行纯化并浓缩至原体积1/10，进液速率为0.4ml/min/cm2，用PBS缓冲溶液稀释至原体积，即可收获纯化后的蓝耳病活疫苗抗原。
(5)将纯化前后的蓝耳病活疫苗抗原进行10倍系列稀释后，接种96孔培养的单层Marc145细胞，每孔100μl，培养96小时，测定TCID50。根据纯化前后抗原TCID50的大小计算抗原回收率，结果见表1。
(6)用Lowry法测定纯化前后总蛋白浓度，计算蛋白去除率，结果见表1。
表1 蓝耳病活疫苗抗原纯化结果
注：a病毒效价表示方式为TCID50/0.1ml；b蛋白去除率＝1-(纯化后体积×纯化后蛋白浓度)/(纯化前体积×纯化前蛋白浓度)；c抗原回收率＝纯化后病毒效价/纯化前病毒效价。
实施例2蓝耳病灭活疫苗抗原纯化
(1)将收获的蓝耳病灭活疫苗抗原先采用7000rpm离心25min，取上清弃沉淀，然后将上清液以11000rpm离心60min，取上清备用；
(2)将离心澄清后的抗原泵入分子量大小为300KD的切向流超滤系统进行纯化，进液速率为0.4ml/min/cm2，并浓缩至原体积的1/15，弃去透过液，保留回流液；
(3)用无菌的PBS缓冲溶液将抗原浓缩液稀释至原体积，继续泵入超滤膜包进行纯化并将抗原液浓缩至原体积的1/10，进液速率为0.4ml/min/cm2；所述PBS溶液pH值为7.3，浓度为0.01mol/L；
(4)用无菌的PBS缓冲溶液将抗原浓缩液稀释至原体积，继续泵入超滤膜包进行纯化并浓缩至原体积1/10，进液速率为0.5ml/min/cm2，用PBS缓冲溶液稀释至原体积，即可收获纯化后的蓝耳病灭活疫苗抗原。
(5)用抗蓝耳病病毒N蛋白抗体为一抗进行Western Blot检测试验，扫描显色条带后用Gel-Pro analyzer等软件对纯化前后抗原N蛋白特异性条带的灰度值进行分析，根据纯化前后抗原体积的大小计算抗原回收率(抗原比活性)，结果见表2。
(6)用Lowry法测定纯化前后总蛋白含量，计算蛋白去除率，结果见表2。
表2 蓝耳病灭活疫苗抗原纯化结果
注：a蛋白去除率＝1-(纯化后蛋白浓度/浓缩倍数)/纯化前蛋白浓度；b抗原回收率(抗原比活性)＝(纯化后灰度值/浓度倍数)/(纯化前灰度值)。
实施例3稀释液对蓝耳病疫苗抗原纯化的效果影响
本实施例用以验证本发明采用0.01M pH值7.2-7.4的PBS缓冲液作为抗原稀释液取得的效果。
共设7个试验组，每个试验组对应的抗原稀释液分别为：0.01M pH值7.0、7.2、7.4的PBS缓冲液、0.1M pH值7.0、7.2、7.4的PBS缓冲液和无菌水，前述不同稀释液按照顺序分别编号为试验组1-7。纯化蓝耳病疫苗抗原的步骤均参见实施例2。将7个试验组纯化获得的抗原按照常规方法检测不同保存期下的抗原效价。结果见表3。由表3可见，当抗原稀释液采用0.01M pH值7.2、7.4的PBS缓冲液时，纯化的抗原能够保持12个月效价稳定性，而其他抗原稀释液在6个月左右即出现抗原效价的下降。
表3 不同抗原稀释液纯化蓝耳病抗原的保存期试验(灰度值)
1 2 3 4 5 6 7
0个月 1.43E+07 1.58E+07 1.45E+07 1.23E+07 1.54E+07 1.24E+07 1.19E+07
1个月 1.38E+07 1.61E+07 1.43E+07 1.08E+07 1.47E+07 1.13E+07 0.47E+07
2个月 1.17E+07 1.44E+07 1.51E+07 0.93E+07 1.18E+07 0.94E+07 1.20E+06
3个月 1.01E+07 1.51E+07 1.42E+07 0.72E+07 0.84E+07 0.74E+07 0.63E+06
6个月 0.86E+07 1.15E+07 1.27E+07 0.34E+07 0.59E+07 0.49E+07 0.85E+05
12个月 0.32E+07 0.93E+07 1.06E+07 1.03E+06 2.81E+06 1.29E+06 2.71E+03
实施例4离心方法对蓝耳病疫苗抗原纯化的效果影响
本实施例用以验证本发明采用差速离心法离心蓝耳病疫苗抗原液对于纯化抗原能够取得最佳效果。
共设3个试验组，纯化蓝耳病疫苗抗原的主要步骤均参见实施例2，不同的是，步骤(1)中的离心方法分别选择：
试验组1：差速离心方法(参见实施例2的离心参数)
试验组2：差速离心方法(先采用3000rpm离心30min，取上清弃沉淀，然后将上清液以6000rpm离心60min，取上清备用)、
试验组3：10000r/min，离心时间为60min。
其他步骤参见实施例2。
用抗蓝耳病病毒N蛋白抗体为一抗进行Western Blot检测试验，扫描显色条带后用Gel-Pro analyzer等软件对纯化前后抗原N蛋白特异性条带的灰度值进行分析，根据纯化前后抗原体积的大小计算抗原回收率(抗原比活性)，结果见表4。用Lowry法测定纯化前后总蛋白含量，计算蛋白去除率，结果见表4。表4结果显示，采用本发明的差速离心方法(先采用7000rpm离心25min，取上清弃沉淀，然后将上清液以11000rpm离心60min)能够获得最佳的纯化效果，杂蛋白去除率最高、抗原回收率最高。
表4 蓝耳病灭活疫苗抗原纯化结果
实施例5膜包对蓝耳病疫苗抗原纯化的效果影响
本实施例用以验证本发明采用100-500KD的膜包对于纯化抗原能够取得最佳效果。
共设5个试验组，纯化蓝耳病疫苗抗原的主要步骤均参见实施例2，不同的是步骤(2)的切向流超滤系统膜包的分子量大小依次为100、300、500、1000KD。进行Western Blot检测试验，检测纯化前后的抗原灰度值，计算抗原回收率，结果见表5。用Lowry法测定纯化前后总蛋白浓度，计算蛋白去除率，结果见表5。表5结果显示，切向流超滤系统膜包的分子量为300、500、1000KD时，杂蛋白去除率均达到97％以上，但500、1000KD时的抗原回收率显著低于膜包的分子量为300KD的抗原回收率，因此本申请以切向流超滤系统膜包的分子量为300KD为最优选择。
表5 蓝耳病灭活疫苗抗原纯化结果
实施例6抗原液进入膜包的流速对蓝耳病疫苗抗原纯化的效果影响
本实施例用以验证本发明流速不超过0.8ml/min/cm2对于纯化抗原能够取得最佳效果。
共设5个试验组，纯化蓝耳病疫苗抗原的主要步骤均参见实施例2，不同的是步骤(2)的纯化是抗原液泵入超滤膜包的流速分别为0.2ml/min/cm2、0.4ml/min/cm2、0.6ml/min/cm2、0.8ml/min/cm2、1ml/min/cm2，对应试验组1-5，同时计算纯化试验所用的时间。进行Western Blot检测试验，检测纯化前后的抗原灰度值，计算抗原回收率，结果见表6。用Lowry法测定纯化前后总蛋白浓度，计算蛋白去除率，结果见表6。表6结果显示，抗原液泵入超滤膜包的流速在0.8ml/min/cm2以内在保证杂蛋白去除率的同时能够获得更大的抗原回收率，在0.4～0.8ml/min/cm2时效率最高，超过0.8以上时流速过大，膜包承受的压力较大，抗原损失相对较多。
表6 蓝耳病灭活疫苗抗原纯化结果
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (1)

1.一种蓝耳病疫苗抗原纯化的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将收获的蓝耳病疫苗抗原经离心机离心澄清，收取澄清的抗原液；所述的蓝耳病疫苗抗原为经灭活剂灭活后的蓝耳病灭活疫苗抗原或蓝耳病活疫苗抗原；
其中，步骤(1)采用差速离心的方法，所述差速离心为先采用4000-7000rpm离心20-40min，取上清弃沉淀，然后将上清液以8000-12000rpm离心50-70min，取上清备用；
(2)将步骤(1)得到的澄清抗原液泵入超滤系统进行纯化；
其中，步骤(2)中超滤系统为切向流超滤系统，所述切向流超滤系统膜包的分子量大小为300KD；抗原液泵入超滤系统进行纯化时，抗原液循环进入超滤膜包的流速不超过0.8ml/min/cm2，纯化的同时需要将抗原液浓缩至原体积1/10以上，收取回流液，弃去透过液；
(3)用0.01M pH值7.2-7.4的PBS缓冲液将步骤(2)中纯化得到的抗原液稀释至原体积继续纯化，纯化方法同步骤(2)；
(4)用0.01M pH值7.2-7.4的PBS缓冲液将步骤(3)中纯化得到的抗原液稀释至原体积继续纯化后，收获纯化的蓝耳病疫苗抗原。
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