CN103601793A - 一种禽用疫苗抗原纯化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种禽用疫苗抗原纯化的方法，属于生物制品制备技术领域。该纯化方法包括如下步骤：（1）将收获的动物疫苗抗原离心澄清；（2）将步骤（1）得到的澄清抗原泵入分子量切割过滤系统进行纯化，并浓缩至原体积的1/2～1/10；（3）用无菌PBS缓冲液将步骤（2）的抗原浓缩液稀释至原体积；（4）重复所述步骤（2）和步骤（3）2～5次后，收获纯化后的动物疫苗抗原。该方法对于降低禽用疫苗的免疫副反应以及提高疫苗免疫效果具有积极的意义。

Description

一种禽用疫苗抗原纯化的方法
技术领域
本发明涉及生物制品技术领域，具体地涉及一种禽用疫苗抗原纯化的方法。
背景技术
目前，我国绝大多数企业的禽用疫苗抗原经组织培养、细胞培养以及鸡胚培养等生产方式得到后，直接用以疫苗的配制。这种生产工艺技术操作简单，成本低廉，但也使生产的抗原杂质较多，导致疫苗的免疫副反应大，产品稳定性差，影响疫苗免疫效果。近年来也有企业在禽用疫苗抗原下游加工处理方面进行了研究。专利CN102171334A公开了一种纯化流感病毒的制备方法，该方法用表面活性剂处理流感病毒后用羟磷灰石进行吸附，该方法操作复杂，工艺成本较高，不适用于兽用禽流感疫苗的生产。余祖华在2010年对红细胞吸附释放法、PEG-6000沉淀法和超速离心法三种纯化新城疫病毒的方法进行了简单的比较，结果表明这三种方法均不适合实际生产的应用。目前，尚无鸡传染性法氏囊疫苗抗原、鸡传染性支气管炎疫苗抗原以及减蛋综合症疫苗抗原在纯化技术方面的报道。
发明内容
为克服上述缺陷，本发明的目的是提供禽用疫苗抗原纯化的方法。
为实现上述目的，本发明利用分子量切割的过滤技术对禽用疫苗抗原进行纯化，该方法包括如下步骤：
（1）将收获的禽用疫苗抗原经离心机离心澄清，收取澄清的抗原液；
（2）将步骤（1）得到的澄清抗原泵入分子量切割过滤系统进行纯化，并浓缩至原体积的1/2～1/10；
（3）用无菌的PBS缓冲液将步骤（2）得到的抗原浓缩液稀释至原体积；
（4）重复步骤（2）和步骤（3）2～5次后，收获纯化后的禽用疫苗抗原。
所述的禽用疫苗抗原为禽流感疫苗抗原、新城疫疫苗抗原、鸡传染性法氏囊疫苗抗原、鸡传染性支气管炎疫苗抗原和减蛋综合症疫苗抗原。
优选的，步骤（1）所述的离心机包括筒式离心机和管式离心机。
优选的，步骤（2）中分子量切割的过滤系统为切向流超滤系统，具体为密理博、波尔或赛多利斯三者中任选其一均可，膜包的分子量大小为30KD～1000KD。
优选的，步骤（3）所述PBS溶液为pH值为7.2～7.4，浓度为0.01mol/L。
优选的，步骤（1）中的筒式离心机离心速率为8000～20000r/min，离心时间为5～30min；管式离心机离心速率为10000r/min～30000r/min，进液速率为100ml/min～5000ml/min。
优选的，步骤（1）中收取澄清的抗原的方法为：筒式离心机为收取上清；管式离心机为收取流出的澄清的抗原。优选的，所述步骤（2）中动物疫苗抗原浓缩至原体积的1/2～1/10后，弃去透过液，保留回流液。
本发明的有益效果：本发明提供了禽用疫苗抗原纯化的方法，为提高我国禽用疫苗质量提供新技术。该技术操作简单，仅需1套简单的分子量切割过滤设备即可完成抗原纯化，纯化的疫苗抗原蛋白去除率达到90%以上，抗原回收率在85%以上。在禽用疫苗生产中具有明显的优势和巨大的应用价值，对于降低禽用疫苗的免疫副反应以及提高疫苗免疫效果具有积极的意义。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1禽流感疫苗抗原纯化
（1）将收获的禽流感疫苗抗原（乾元浩生物股份有限公司生产）使用筒式离心机收取上清，离心速率为15000r/min，离心时间为10min；使用管式离心机（GQLB-N75，辽阳阳光制药机械有限公司）收取流出的澄清的抗原，离心速率为20000r/min进液速率为500ml/min，收集离心澄清的抗原；
（2）将离心澄清后的抗原泵入分子量大小为1000KD的切向流过滤系统进行纯化，并浓缩至原体积的1/10，弃去透过液，保留回流液；
（3）用无菌的PBS缓冲溶液将抗原浓缩液稀释至原体积；所述PBS溶液pH值为7.2，浓度为0.01mol/L；
（4）重复步骤（2）和步骤（3）4次，最后1次将抗原浓缩至原体积的1/2，即可收获纯化后的禽流感疫苗抗原。
（5）用1%的鸡红细胞检测纯化前后疫苗抗原HA的大小。纯化后的抗原用PBS逐渐稀释至HA效价与纯化前保持一致，记下稀释后的纯化抗原体积，根据纯化前后抗原体积的大小计算抗原回收率，结果见表1。
（6）用分光光度计测定纯化前后总蛋白含量，计算蛋白去除率，结果见表1。
实施例2新城疫疫苗抗原纯化
（1）将收获的新城疫疫苗抗原（乾元浩生物股份有限公司生产）使用筒式离心机收取上清，离心速率为20000r/min，离心时间为8min；使用管式离心机（GQLB-N75，辽阳阳光制药机械有限公司）收取流出的澄清的抗原，离心速率为15000r/min，进液速率为500ml/min，收集离心澄清的抗原；
（2）将离心澄清后的抗原泵入分子量大小为1000KD的切向流过滤系统进行纯化，并浓缩至原体积的1/10，弃去透过液，保留回流液；
（3）用无菌的PBS缓冲溶液将抗原浓缩液稀释至原体积；所述PBS溶液pH值为7.2，浓度为0.01mol/L；
（4）重复步骤（2）和步骤（3）4次，最后1次将抗原浓缩至原体积的1/2，即可收获纯化后的禽流感疫苗抗原。
（5）用1%的鸡红细胞检测纯化前后疫苗抗原HA的大小。纯化后的抗原用PBS逐渐稀释至HA效价与纯化前保持一致，记下稀释后的纯化抗原体积，根据纯化前后抗原体积的大小计算抗原回收率，结果见表1。
（6）用分光光度计测定纯化前后总蛋白含量，计算蛋白去除率，结果见表1。
实施例3鸡传染性法氏囊疫苗抗原纯化
（1）将收获的鸡传染性法氏囊疫苗抗原（乾元浩生物股份有限公司生产）使用筒式离心机收取上清，离心速率为8000r/min，离心时间为30min；使用管式离心机（GQLB-N75，辽阳阳光制药机械有限公司）收取流出的澄清的抗原，离心速率为30000r/min，进液速率为2000ml/min，收集离心澄清的抗原；
（2）将离心澄清后的抗原泵入分子量大小为1000KD的切向流过滤系统进行纯化，并浓缩至原体积的1/8弃去透过液，保留回流液；
（3）用无菌的PBS缓冲溶液将抗原浓缩液稀释至原体积；所述PBS溶液pH值为7.4，浓度为0.01mol/L；
（4）重复步骤（2）和步骤（3）4次，收获纯化后的禽流感疫苗抗原，注意保持纯化前后抗原体积不变。
（5）将纯化前后的抗原进行10倍倍比稀释，接种SPF鸡胚，计算纯化前后抗原的ELD50，计算抗原回收率，结果见表1。
（6）用分光光度计测定纯化前后总蛋白含量，计算蛋白去除率，结果见表1。
实施例4传染性支气管炎疫苗抗原纯化
（1）将收获的传染性支气管炎疫苗抗原（乾元浩生物股份有限公司生产）使用筒式离心机收取上清，离心速率为10000r/min，离心时间为20min；使用管式离心机（GQLB-N75，辽阳阳光制药机械有限公司）收取流出的澄清的抗原，离心速率为20000r/min，进液速率为500ml/min，收集离心澄清的抗原；
（2）将离心澄清后的抗原泵入分子量大小为300KD的切向流过滤系统进行纯化，并浓缩至原体积的1/5弃去透过液，保留回流液；
（3）用无菌的PBS缓冲溶液将抗原浓缩液稀释至原体积；所述PBS溶液pH值为7.3，浓度为0.01mol/L；
（4）重复步骤（2）和步骤（3）4次，收获纯化后的禽流感疫苗抗原，注意保持纯化前后抗原体积不变。
（5）将纯化前后的抗原进行10倍倍比稀释，接种SPF鸡胚，计算纯化前后抗原的EID50，计算抗原回收率，结果见表1。
（6）用分光光度计测定纯化前后总蛋白含量，计算蛋白去除率，结果见表1。
实施例5减蛋综合症疫苗抗原纯化
（1）将收获的减蛋综合征疫苗抗原（乾元浩生物股份有限公司生产）使用筒式离心机收取上清，离心速率为20000r/min，离心时间为15min；使用管式离心机（GQLB-N75，辽阳阳光制药机械有限公司）收取流出的澄清的抗原，离心速率为30000r/min，进液速率为1500ml/min，收集离心澄清的抗原；
（2）将离心澄清后的抗原泵入分子量大小为500KD的切向流过滤系统进行纯化，并浓缩至原体积的1/10弃去透过液，保留回流液；
（3）用无菌的PBS缓冲溶液将抗原浓缩液稀释至原体积；所述PBS溶液pH值为7.2，浓度为0.01mol/L；
（4）重复步骤（2）和步骤（3）4次，最后1次将抗原浓缩至原体积的1/2，即可收获纯化后的禽流感疫苗抗原。
（5）用1%的鸡红细胞检测纯化前后疫苗抗原HA的大小。纯化后的抗原用PBS逐渐稀释至HA效价与纯化前保持一致，记下稀释后的纯化抗原体积，根据纯化前后抗原体积的大小计算抗原回收率。结果见表1。
（6）用分光光度计测定纯化前后总蛋白含量，计算蛋白去除率。结果见表1。
表1禽用疫苗抗原纯化检测结果
Figure BDA0000400829060000061
Figure BDA0000400829060000071
注：a体积单位为ml；b蛋白浓度单位为μg/ml；c病毒效价表示方式为ELD50/0.2ml；d病毒效价表示方式为EID50/0.1ml；e抗原回收率=（纯化后体积×纯化后病毒效价）/（纯化前体积×纯化前病毒效价）；f蛋白去除率=1-（纯化后体积×纯化后蛋白浓度）/（纯化前体积×纯化前蛋白浓度）。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种禽用疫苗抗原纯化的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将收获的禽用疫苗抗原经离心机离心澄清，收取澄清的抗原液；
（2）将步骤（1）得到的澄清抗原泵入分子量切割过滤系统进行纯化，并浓缩至原体积的1/2～1/10；
（3）用无菌的PBS缓冲液将步骤（2）得到的抗原浓缩液稀释至原体积；
（4）重复步骤（2）和步骤（3）2～5次后，收获纯化后的禽用疫苗抗原。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述的禽用疫苗抗原为禽流感疫苗抗原、新城疫疫苗抗原、鸡传染性法氏囊疫苗抗原、鸡传染性支气管炎疫苗抗原或减蛋综合症疫苗抗原。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）使用筒式离心机收取上清；使用管式离心机收取流出的澄清的抗原。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）中筒式离心机离心速率为8000～20000r/min，离心时间为5～30min；管式离心机离心速率为10000r/min～30000r/min，进液速率为100ml/min～5000ml/min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中分子量切割过滤系统为切向流超滤系统，膜包的分子量大小为30KD～1000KD。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中动物疫苗抗原浓缩至原体积的1/2～1/10后，弃去透过液，保留回流液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述PBS缓冲液pH值为7.2～7.4，浓度为0.01mol/L。
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