CN105505889A - 一种禽流感病毒纯化的方法 - Google Patents

一种禽流感病毒纯化的方法 Download PDF

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徐家华
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Abstract

本发明公开了一种禽流感病毒纯化的方法，具体包括如下步骤：两次过滤：采用不锈钢筛网对收获的含禽流感病毒抗原的半成品胚液进行两次过滤；离心：滤出液进行离心，收集上清液和沉淀；溶解：沉淀中加入PBS溶液重新溶解，并且搅拌，得到溶液；离心：溶液进行离心，收集上清液；浓缩：采用孔径为30-500K的膜包对上清液进行浓缩；分子筛层析：以葡聚糖凝胶G200为层析填料，采用纯净水平衡层析柱，以0.05M的PBS溶液为洗脱液，对浓缩液进行分子筛层析，回收禽流感病毒液；浓缩：采用膜包对回收禽流感病毒液使用进行浓缩，获得纯化后的禽流感病毒。该方法处理量大，处理速度快，能够去除胚液中80％以上的异源蛋白，病毒回收率大于85％，并且不影响病毒HA效价。

Description

一种禽流感病毒纯化的方法
技术领域
本发明涉及兽用生物制品行业的兽用疫苗制造领域，更具体地说，涉及一种禽流感病毒纯化的方法。
背景技术
禽流感是一种由A型流感病毒引起的传染性疾病综合征，被国际兽疫局定为A类传染病。按病原性的致病力，禽流感可分为高致病性、低致病性和非致病性三大类。非致病性禽流感不会引起明显症状，仅使染病的禽鸟体内产生病毒抗体。低致病性禽流感可使禽类出现轻度呼吸道症状，食量减少、产蛋量下降，出现零星死亡。高致病性禽流感最为严重，发病率和死亡率高。
禽流感疫苗主要通过鸡胚繁殖病毒而生产。该种疫苗具有制备工艺简单，免疫效果确实，免疫持续时间较长等特点，己被许多国家地区在家禽中使用，并在预防和控制禽流感暴发中起到一定积极作用。
在规模化生产禽流感油乳剂灭活苗中，通过对原辅材料、生产过程关键技术地控制和工艺改进等措施，生产出高效、稳定的产品。生产过程的关键技术直接关系到产品的质量，是生产高效优质产品的保障。鸡胚含有大量的蛋白、脂类、细胞碎片等杂质，这些物质和病毒抗原结合在一起。这些异源性物质容易引起的鸡应激，降低生产性能，例如生长缓慢、产蛋量下降等，在蛋鸡上表现尤为明显。因此，为了提高禽流感疫苗的品质有必要去除胚液中部分异源性物质。
目前，有许多研究致力于从胚液中纯化病毒或者生产相应产品。有人通过乙醚等化学试剂从浓缩的胚液中提取病毒提高病毒产量。提取病毒的目的在于，病毒颗粒与细胞碎片或者块状物质分离开。有人通过离子交换层析分离病毒；也有人通过，通过中等速度离心去除胚液中的大块物质，然后通过CaHPO4凝胶吸附澄清胚液中的病毒颗粒，达到纯化病毒的目的。有人研究发现，流感病毒液中加入0.3MNaCl降低纯化后的流感病毒聚集。虽然有不少人对采用了不同方法对禽流感病毒进行了分离纯化，但是这些方法明显存在以下缺点：处理量小，例如高速离心，回收率低，对病毒抗原存在影响，例如使用乙醚等化学试剂从浓缩的胚液中提取病毒。这些因素均不利于产业化。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，提供一种禽流感病毒纯化的方法，该方法处理量大，处理速度快，能够去除胚液中80％以上的异源蛋白，病毒回收率大于85％，并且不影响病毒HA效价。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种禽流感病毒纯化的方法，具体包括如下步骤：
(1)一次过滤：采用不锈钢筛网对收获的含禽流感病毒抗原的半成品胚液进行一次过滤，收集滤出液A；
(2)二次过滤：采用不锈钢筛网对步骤(1)中滤出液A进行二次过滤，收集滤出液B；
(3)离心：对步骤(2)的滤出液B进行离心，收集上清液C和沉淀D；
(4)溶解：在步骤(3)得到的沉淀D中加入0.1M的PBS溶液重新溶解，并且搅拌，得到溶液E；
(5)离心：对步骤(4)得到的溶液E进行离心，收集上清液F；
(6)浓缩：将步骤(3)与步骤(5)中得到的上清液C和上清液F合并，然后采用孔径为30-500K的膜包对合并液进行浓缩，浓缩至原始体积的(1/2)-(1/8)，得到浓缩液G；
(7)分子筛层析：以葡聚糖凝胶G200为层析填料，采用纯净水平衡层析柱，以0.05M的PBS溶液为洗脱液，对步骤(6)中得到浓缩液G进行分子筛层析，回收禽流感病毒液H；
(8)浓缩：采用孔径为30-500K的膜包对步骤(7)回收禽流感病毒液H使用进行浓缩，获得纯化后的禽流感病毒I。
本发明所述的禽流感病毒纯化的方法，其中，所述步骤(1)中不锈钢筛网的目数为150-250目。
本发明所述的禽流感病毒纯化的方法，其中，所述步骤(2)中不锈钢筛网的目数为550-550目。
本发明所述的禽流感病毒纯化的方法，其中，所述步骤(3)中离心速度为4000-6000rmp/min，离心时间为30-60min。
本发明所述的禽流感病毒纯化的方法，其中，所述步骤(4)中搅拌速度为6000-10000rpm/min，搅拌时间为30min-1h，加入的PBS溶液的体积与步骤(1)中的半成品胚液的体积相等。
本发明所述的禽流感病毒纯化的方法，其中，所述步骤(5)中的离心速度为4000-6000rmp/min，离心时间为30-60min。
本发明所述的禽流感病毒纯化的方法，其中，所述步骤(6)中膜包的孔径为100-300K。
本发明所述的禽流感病毒纯化的方法，其中，所述步骤(8)中膜包的孔径为100-300K。
实施本发明的禽流感病毒纯化的方法，具有以下有益效果：
(1)根据本申请的纯化方法能够去除含禽流病毒胚液中80％以上的异源蛋白，并且禽流病毒回收率大于85％。说明本方法采用简单物理过程对禽流感病进行纯化，能够保持有效去除异源蛋白同时保留禽流感病毒；
(2)另外，与未加PBS溶液的胚液相比，本发明加入0.1M和0.05M的PBS溶液进行处理后并未降低禽流感病毒血凝性(HA价)，由此可见，0.1M和0.05M的PBS溶液对禽流感病毒血凝性没有影响，说明本方法采用简单物理过程对禽流感病进行纯化，能够保持禽流感病毒原有的HA价，并未涉及到化学或者其它导致病毒变性。
(3)与高速离心等不同纯化方法，本发明的纯化方法处理量大，处理速度快，回收率高。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1是本发明实施例1中经G200分子筛层析后的禽流感病毒液H的分离效果图；
其中，具有两个峰值的曲线为禽流感病毒粗纯样品通过G200层析填料分离情况；具有一个峰值的曲线为溶液中电导(各种离子浓度)变化情况；黑色箭头为禽流感病毒峰。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：
一种禽流感病毒纯化的方法，具体包括如下步骤：
(1)一次过滤：采用目数为150-250目的不锈钢筛网对收获的含禽流感病毒抗原的半成品胚液进行一次过滤，收集滤出液A；
(2)二次过滤：采用目数为550-550目的不锈钢筛网对步骤(1)中滤出液A进行二次过滤，收集滤出液B；
(3)离心：对步骤(2)的滤出液B进行离心，离心速度为4000-6000rmp/min，离心时间为30-60min，收集上清液C和沉淀D；
(4)溶解：在步骤(3)得到的沉淀D中加入0.1M的PBS溶液重新溶解，并且搅拌，搅拌速度为6000-10000rpm/min，搅拌时间为30min-1h，加入的PBS溶液的体积与步骤(1)中的半成品胚液的体积相等，得到溶液E；
(5)离心：对步骤(4)得到的溶液E进行离心，离心速度为4000-6000rmp/min，离心时间为30-60min，收集上清液F；
(6)浓缩：将步骤(3)与步骤(5)中得到的上清液C和上清液F合并，然后采用孔径为30-500K的膜包对合并液进行浓缩，浓缩至原始体积的(1/2)-(1/8)，得到浓缩液G；进一步优选地，本步骤中膜包的孔径为100-300K。
(7)分子筛层析：以葡聚糖凝胶G200为层析填料，采用纯净水平衡层析柱，以0.05M的PBS溶液为洗脱液，对步骤(6)中得到浓缩液G进行分子筛层析，回收禽流感病毒液H；
(8)浓缩：采用孔径为30-500K的膜包对步骤(7)回收禽流感病毒液H使用进行浓缩，获得纯化后的禽流感病毒I。进一步优选地，本步骤中膜包的孔径为100-300K。
实施例1鸡胚尿囊液中禽流感病毒纯化方法
禽流感病毒抗原的半成品胚液1L，
(1)一次过滤：使用200目的不锈钢筛网一次过滤，去除胚液中蛋壳等大块物质，收集滤出液A。
(2)二次过滤：滤出液A使用500目的不锈钢筛网过滤，去除胚液中相对较小的颗粒物质，收集滤出液B。
(3)离心：对滤出液B进行离心5000rmp/min，40min，收集收集上清液C和沉淀D。
(4)溶解：在沉淀D中加入PBS重新溶解，0.1M的PBS溶液量为1L，并且搅拌，搅拌速度为8000rpm/min，30min。
(5)离心：再次离心，5500rmp/min，30min，收集上清液F。
(6)浓缩：对上清液使用孔径为100K的膜包进行浓缩，浓缩至原始体积的1/4。
(7)分子筛层析：然后使用G200层析填料(GE公司产品)进行层析，层析过程中使用0.05M的PBS溶液进行洗脱，回收禽流感病毒液(见图1，图1中黑色箭头为禽流感病毒的峰形)。
(8)浓缩：最后对回收禽流感病毒液使用孔径为300K的膜包进行浓缩，浓缩至原始体积的1/4。
下面，检测并计算胚液中禽流感病毒纯度和回收率以及每个步骤中的总蛋白质含量。具体按照传统国家标准血凝集实验测定上述每个步骤中病毒含量(HA价)，按照血凝集实验稀释倍数计算每个操作步骤病毒回收量占最初病毒含量的百分比。
病毒回收量＝每个步骤病毒回收总量/最初病毒总量。
最初病毒总量＝病毒效价(HA)价×体积；
每个步骤病毒回收总量＝每个步骤病毒效价(HA)价×该步骤回收溶液的总体积。
每个步骤总蛋白质回收百分比＝每个操作步骤蛋白总量/最初溶液中蛋白质总量的百分比；上述每个步骤通过微量法测定总蛋白质含量。
表1：不同纯化步骤
对胚液中禽流感病毒纯度和回收率的影响
表1为不同纯化步骤对胚液中禽流感病毒纯度和回收率的影响结果，从表中的数据可知，根据本申请的纯化方法能够去除含禽流病毒胚液中80％以上的异源蛋白，并且禽流病毒回收率大于85％。说明本方法采用简单物理过程对禽流感病进行纯化，能够保持有效去除异源蛋白同时保留禽流感病毒。
实施例2纯化过程中溶液对禽流感病毒血凝性(HA价)的影响
由于整个病毒纯化过程除了使用到PBS溶液外，所有步骤均是简单物理过程，未涉及到化学或者其它导致病毒变性的步骤。在含有禽流感病毒的胚液中分别加入不同体积0.1M和0.05M的PBS溶液，混匀后放置在2-8℃冰箱中保存，以未加PBS溶液的胚液为对照，每12个小时测定一次禽流感病毒的HA价，观察48小时。
表2纯化过程中溶液对
禽流感病毒血凝性(HA价)的影响结果
表2为纯化过程中溶液对禽流感病毒血凝性(HA价)的影响结果，与未加PBS溶液的胚液相比，加入0.1M和0.05M的PBS溶液后并未降低禽流感病毒血凝性(HA价)，由此可见，0.1M和0.05M的PBS溶液对禽流感病毒血凝性没有影响，说明本方法采用简单物理过程对禽流感病进行纯化，能够保持禽流感病毒原有的HA价，并未涉及到化学或者其它导致病毒变性。
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种禽流感病毒纯化的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)一次过滤：采用不锈钢筛网对收获的含禽流感病毒抗原的半成品胚液进行一次过滤，收集滤出液A；
(2)二次过滤：采用不锈钢筛网对步骤(1)中滤出液A进行二次过滤，收集滤出液B；
(3)离心：对步骤(2)的滤出液B进行离心，收集上清液C和沉淀D；
(4)溶解：在步骤(3)得到的沉淀D中加入0.1M的PBS溶液重新溶解，并且搅拌，得到溶液E；
(5)离心：对步骤(4)得到的溶液E进行离心，收集上清液F；
(6)浓缩：将步骤(3)与步骤(5)中得到的上清液C和上清液F合并，然后采用孔径为30-500K的膜包对合并液进行浓缩，浓缩至原始体积的(1/2)-(1/8)，得到浓缩液G；
(7)分子筛层析：以葡聚糖凝胶G200为层析填料，采用纯净水平衡层析柱，以0.05M的PBS溶液为洗脱液，对步骤(6)中得到浓缩液G进行分子筛层析，回收禽流感病毒液H；
(8)浓缩：采用孔径为30-500K的膜包对步骤(7)回收禽流感病毒液H使用进行浓缩，获得纯化后的禽流感病毒I。
2.根据权利要求1所述的禽流感病毒纯化的方法，其特征在于，所述步骤(1)中不锈钢筛网的目数为150-250目。
3.根据权利要求1所述的禽流感病毒纯化的方法，其特征在于，所述步骤(2)中不锈钢筛网的目数为550-550目。
4.根据权利要求1所述的禽流感病毒纯化的方法，其特征在于，所述步骤(3)中离心速度为4000-6000rmp/min，离心时间为30-60min。
5.根据权利要求1所述的禽流感病毒纯化的方法，其特征在于，所述步骤(4)中搅拌速度为6000-10000rpm/min，搅拌时间为30min-1h，加入的PBS溶液的体积与步骤(1)中的半成品胚液的体积相等。
6.根据权利要求1所述的禽流感病毒纯化的方法，其特征在于，所述步骤(5)中的离心速度为4000-6000rmp/min，离心时间为30-60min。
7.根据权利要求1所述的禽流感病毒纯化的方法，其特征在于，所述步骤(6)中膜包的孔径为100-300K。
8.根据权利要求1所述的禽流感病毒纯化的方法，其特征在于，所述步骤(8)中膜包的孔径为100-300K。
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