CN102731670B - Hib荚膜多糖纯化工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了Hib荚膜多糖纯化工艺，包括以下步骤：a、加入甲醛溶液，4℃搅拌过夜，离心，收集上清液；b、中空纤维过滤；c、超滤浓缩，用PBS清洗浓缩液；d、加入乙醇，过夜；e、离心，向上清液补加乙醇，离心，收集上清液；f、加入乙醇，静置；g、离心，收集沉淀，沉淀用水溶解，离心，去除不溶物质；h、用透析膜对水透析；i、离心，滤膜过滤，依次通过AKTAexplorer、CL-4B层析柱，收集Kd≤0.5的目的峰。本发明的有益效果是：解决了现有的Hib制备工艺中核酸、蛋白不易去除的困难，避免了对人体健康和环境造成的危害，降低了处理难度，提高了处理质量，且处理稳定性好。
Description
技术领域
本发明涉及荚膜多糖纯化技术领域，特别是一种Hib荚膜多糖纯化工艺。
背景技术
b型流感嗜血杆菌Hib（Hamephilus influenzae type b，Hib)是引起3月龄至5周岁婴幼儿脑膜炎、败血症和肺炎等传染病的主要致病菌之一，而且75%以上的Hib感染发生在2岁以下婴幼儿，侵袭性b型流感嗜血杆菌通常引起肺炎、蜂窝组织炎、化脓性关节炎和菌血症，发病率高，致死率高。WHO统计显示，每年Hib在全球可引起至少300万严重病例和大约38.6万死亡病例。接种疫苗是预防绝大多数Hib严重病例的唯一公共卫生措施。全球各区域已经有90多个国家将Hib疫苗纳入儿童常规免疫规划。但是在低收入国家，仅有小部分儿童能享受Hib疫苗接种服务。Hib荚膜多糖（polyribosylribitol phosphate，PRP）的提取纯化，是生产结合疫苗关键环节。研究发现，很多因素影响Hib的培养、PRP产生和提取纯化。本研究通过研究提取纯化PRP多糖，为进一步研究开发Hib多糖结合疫苗奠定基础。
b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的主要成分是多聚核糖基核糖醇磷酸盐(PRP)。PRP具有抗原性，能在人体中诱发保护性免疫力。PRP是一种非胸腺依赖性抗原，虽然可以产生较弱的IgM型抗体，但不产生免疫记忆。l8个月龄以下的婴儿，其B淋巴细胞尚未成熟到足以产生自我保护能力，为了获得免疫反应，PRP必须结合到一种载体蛋白上，使得多糖成为胸腺依赖性抗原。这样就可激活T辅助淋巴细胞辅助B细胞产生特异性IgG抗体。当重复注射疫苗时，可产生明显的免疫增强效果，标志着免疫记忆反应的建立。常规的去除蛋白质的方法是将Hib粗制多糖溶解于饱和中性醋酸钠溶液中，然后用冷酚溶液抽提，根据粗制多糖中含有的蛋白的情况，此步骤通常需要重复数次。该工艺的缺点是会使用大量的苯酚，苯酚是一种强腐蚀性的高毒性物质，对人的皮肤和粘膜有强烈的腐蚀作用，可抑制中枢神经或损害肝、肾功能。皮肤接触可致灼伤。同时，该工艺会产生大量的废弃苯酚，对水体和大气可造成污染，对环境有严重危害。
在Hib疫苗制备的过程中，荚膜多糖的制备是关键的步骤。在我国多采用和流行性脑膜炎球菌以及伤寒Vi多糖提取相似的工艺来提取Hib荚膜多糖。此工艺采用超滤透析去除核酸、蛋白质，进一步采用色谱分离可以大大提高纯度，但粗多搪的蛋白和核酸含量较高时,也会影响色谱纯化效果效果。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种安全有效、减轻对人体和环境危害的Hib荚膜多糖纯化工艺，解决现有的Hib制备工艺中核酸、蛋白不易去除的问题。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：Hib荚膜多糖纯化工艺，它包括以下步骤：
a、在发酵液中加入终浓度为0.8%的甲醛溶液，4℃搅拌过夜，15000～20000rpm离心30～60min去除菌体，收集上清液；
b、离心上清液用0.22um的中空纤维膜过滤，收集透过液；
c、透过液通过选用100KD膜包的Millipore Pellicon超滤装置，进行超滤浓缩，用PBS缓冲液反复清洗浓缩液，直至浓缩液280和260下的吸光度达到恒定，收集浓缩洗涤液；
d、向浓缩洗涤液中加入95%乙醇至终浓度为20%～25%，摇匀后4℃过夜；
e、6000～8000rpm离心15～30min弃除沉淀，向上清液内补加95%乙醇至70%终浓度，摇匀后，4℃下6000～8000rpm离心40～50min，收集上清液；
f、向上清液中加入95%乙醇至80%～85%终浓度，混匀后，4℃静置3～4h；
g、静置后的溶液6000～8000rpm离心15～30min收集沉淀，沉淀用水溶解，沉淀水溶液6000～8000rpm离心15～30min去除不溶物质；
h、上清液用12～14KD透析膜对水透析，即得粗提PRP透析液；
i、粗提PRP透析液，6000～8000rpm离心15～30min收集上清，上清用0.45um滤膜过滤，滤液依次通过AKTA explorer、CL 4B层析柱，收集Kd≤0.5的目的峰，即得Hib荚膜多糖纯化样品。
本发明具有以下优点：
1、本发明解决了现有的Hib制备工艺中核酸、蛋白不易去除的困难。
2、本发明避免使用十六烷基三甲基溴化铵沉淀复合多糖以及苯酚抽提蛋白过程中对人体健康和环境造成的危害。
3、本发明降低了处理难度，提高了处理质量，且处理稳定性好，使得人工纯化的Hib多糖在连续的生产批次内各个指标都能符合药典标准，且产生的杂质残留量少又易去除。
4、本发明大大提高了纯化PRP的纯度，纯化样品检测合格，免疫双扩散实验证实抗原性良好，为进一步制备Hib PRP多糖蛋白结合疫苗奠定了基础。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的描述：
实施例1：
Hib荚膜多糖纯化工艺，它包括以下步骤：
a、在发酵液中加入终浓度为0.8%的甲醛溶液，4℃搅拌过夜，20000rpm离心30min去除菌体，收集上清液；
b、离心上清液用0.22um的中空纤维膜过滤，收集透过液；
c、透过液通过选用100KD膜包的Millipore Pellicon超滤装置，进行超滤浓缩，用PBS缓冲液反复清洗浓缩液，直至浓缩液280和260下的吸光度达到恒定，收集浓缩洗涤液；
d、向浓缩洗涤液中加入95%乙醇至终浓度为20%，摇匀后4℃过夜；
e、6000rpm离心30min弃除沉淀，向上清液内补加95%乙醇至70%终浓度，摇匀后，4℃下6000rpm离心50min，收集上清液；
f、向上清液中加入95%乙醇至83%终浓度，混匀后，4℃静置3h；
g、静置后的溶液8000rpm离心15min收集沉淀，沉淀用水溶解，沉淀水溶液8000rpm离心15min去除不溶物质；
h、上清液用13KD透析膜对水透析，即得粗提PRP透析液；
i、粗提PRP透析液，8000rpm离心15min收集上清，上清用0.45um滤膜过滤，滤液依次通过AKTAexplorer、CL 4B层析柱，收集Kd≤0.5的目的峰，即得Hib荚膜多糖纯化样品。
本实施例得到的样品的检测结果如下：
取样并按中国药典方法检测核糖含量、蛋白含量、核酸含量、磷含量，本实施例制备的3批Hib荚膜多糖纯化样品进行检测，其检测结果如表1所示。
实施例2：
Hib荚膜多糖纯化工艺，它包括以下步骤：
a、在发酵液中加入终浓度为0.8%的甲醛溶液，4℃搅拌过夜，15000rpm离心50min去除菌体，收集上清液；
b、离心上清液用0.22um的中空纤维膜过滤，收集透过液；
c、透过液通过选用100KD膜包的Millipore Pellicon超滤装置，进行超滤浓缩，用PBS缓冲液反复清洗浓缩液，直至浓缩液280和260下的吸光度达到恒定，收集浓缩洗涤液；
d、向浓缩洗涤液中加入95%乙醇至终浓度为22%，摇匀后4℃过夜；
e、7000rpm离心20min弃除沉淀，向上清液内补加95%乙醇至70%终浓度，摇匀后，4℃下7000rpm离心40min，收集上清液；
f、向上清液中加入95%乙醇至80%终浓度，混匀后，4℃静置3.5h；
g、静置后的溶液7000rpm离心20min收集沉淀，沉淀用水溶解，沉淀水溶液7000rpm离心20min去除不溶物质；
h、上清液用12KD透析膜对水透析，即得粗提PRP透析液；
i、粗提PRP透析液，7000rpm离心20min收集上清，上清用0.45um滤膜过滤，滤液依次通过AKTAexplorer、CL 4B层析柱，收集Kd≤0.5的目的峰，即得Hib荚膜多糖纯化样品。
本实施例得到的样品的检测结果如下：
取样并按中国药典方法检测核糖含量、蛋白含量、核酸含量、磷含量，本实施例制备的3批Hib荚膜多糖纯化样品进行检测，其检测结果如表1所示。
实施例3：
Hib荚膜多糖纯化工艺，它包括以下步骤：
a、在发酵液中加入终浓度为0.8%的甲醛溶液，4℃搅拌过夜，18000rpm离心60min去除菌体，收集上清液；
b、离心上清液用0.22um的中空纤维膜过滤，收集透过液；
c、透过液通过选用100KD膜包的Millipore Pellicon超滤装置，进行超滤浓缩，用PBS缓冲液反复清洗浓缩液，直至浓缩液280和260下的吸光度达到恒定，收集浓缩洗涤液；
d、向浓缩洗涤液中加入95%乙醇至终浓度为25%，摇匀后4℃过夜；
e、8000rpm离心15min弃除沉淀，向上清液内补加95%乙醇至70%终浓度，摇匀后，4℃下8000rpm离心45min，收集上清液；
f、向上清液中加入95%乙醇至85%终浓度，混匀后，4℃静置4h；
g、静置后的溶液6000rpm离心30min收集沉淀，沉淀用水溶解，沉淀水溶液6000rpm离心30min去除不溶物质；
h、上清液用14KD透析膜对水透析，即得粗提PRP透析液；
i、粗提PRP透析液，6000rpm离心30min收集上清，上清用0.45um滤膜过滤，滤液依次通过AKTAexplorer、CL 4B层析柱，收集Kd≤0.5的目的峰，即得Hib荚膜多糖纯化样品。
本实施例得到的样品的检测结果如下：
取样并按中国药典方法检测核糖含量、蛋白含量、核酸含量、磷含量，本实施例制备的3批Hib荚膜多糖纯化样品进行检测，其检测结果如表1所示。
表1实施例样品的核糖、蛋白、核酸、磷含量检测结果
Claims (1)
1.Hib荚膜多糖纯化工艺，解决现有Hib制备工艺中核酸、蛋白不易去除的问题，其特征在于：它包括以下步骤：
a、在发酵液中加入终浓度为0.8%的甲醛溶液，4℃搅拌过夜，15000～20000rpm离心30～60 min去除菌体，收集上清液；
b、离心上清液用0.22μm的中空纤维膜过滤，收集透过液；
c、透过液通过选用100KD 膜包的Millipore Pellicon超滤装置，进行超滤浓缩，用PBS缓冲液反复清洗浓缩液，直至浓缩液在280nm和260nm下的吸光度达到恒定，收集浓缩洗涤液；
d、向浓缩洗涤液中加入95%乙醇至终浓度为20%～25%，摇匀后4℃过夜；
e、6000～8000rpm离心15～30min弃除沉淀，向上清液内补加95%乙醇至70%终浓度，摇匀后，4℃下6000～8000rpm离心40～50min，收集上清液；
f、向上清液中加入95%乙醇至80%～85%终浓度，混匀后，4℃静置3～4h；
g、静置后的溶液6000～8000rpm离心15～30 min收集沉淀，沉淀用水溶解，沉淀水溶液6000～8000rpm离心15～30min去除不溶物质；
h、上清液用12～14KD透析膜对水透析，即得粗提PRP透析液；
i、粗提PRP透析液，6000～8000rpm离心15～30min收集上清液，上清液用0.45μm滤膜过滤，滤液依次通过AKTA explorer、CL-4B层析柱，收集Kd≤0.5的目的峰，即得Hib荚膜多糖纯化样品。
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