具体实施方式:
实施例1
采用生物反应器对b型流感嗜血杆菌进行发酵培养;于对数生长后期杀菌后,离心收集上清液;在上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵至终浓度0.1%,室温静置12小时后,4000rpm离心15分钟,收集沉淀;沉淀中加入1mol/LCaCl2溶液,搅拌3小时后,加入乙醇至终浓度25%,离心收集上清液;上清液加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;洗涤后的多糖经冷冻干燥,获得b型流感嗜血杆菌粗制多糖。
10克粗糖按50mg/ml溶解于注射用水中,按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提2次,4000g离心30分钟收集上清,上清加入氯化钙至0.5mol/L,加入乙醇至25%,4℃静置12小时,10000g离心1小时去除沉淀。上清液用10kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至2mg/ml,上样于Sepharose 4FF柱,每次上样36ml(柱体积的2%)。0.02mol/L氯化钠溶液洗脱;收集Kd0.5之前的洗脱峰,加入乙醇至终浓度50%,置4℃静置12小时,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次。洗涤的经多糖冷冻干燥,获得480mg精制b型流感嗜血杆菌多糖。
各项检定指标如下:
实施例2
采用生物反应器对A群脑膜炎球菌进行发酵培养;于对数生长后期杀菌后,离心收集上清液;在上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵至终浓度0.1%,室温静置12小时后,离心收集沉淀;沉淀中加入1mol/L CaCl2溶液,搅拌3小时后,加入乙醇至终浓度25%,离心收集上清液;上清液加入乙醇至终浓度75%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;洗涤后的多糖经冷冻干燥,获得A群脑膜炎球菌粗制多糖。
40克粗糖按10mg/ml溶解于注射用水,按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提2次,4000g离心30分钟收集上清,上清加入氯化钙至0.5mol/L,加入乙醇至25%,4℃静置12小时,10000g离心1小时去除沉淀。上清液用100kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至浓度50mg/ml,上样于Sepharose 4FF柱,上样270毫升(15%柱体积)。用1.0mol/L氯化钠溶液洗脱;收集Kd0.5之前的洗脱峰,加入乙醇至终浓度90%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤两次。洗涤的多糖经冷冻干燥,获得7280mg精制A群脑膜炎球菌多糖。
各项检定指标如下:
实施例3
采用生物反应器对C群脑膜炎球菌进行发酵培养;于对数生长后期杀菌后,离心收集上清液;在上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵至终浓度0.1%,室温静置12小时后,离心收集沉淀;沉淀中加入1mol/L CaCl2溶液,搅拌3小时后,加入乙醇至终浓度25%,离心收集上清液;上清液加入乙醇至终浓度75%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;洗涤后的多糖经冷冻干燥,获得C群脑膜炎球菌粗制多糖。
20克粗糖按10mg/ml溶解于注射用水,按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提2次,4000g离心30分钟收集上清,上清加入氯化钙至0.5mol/L,加入乙醇至25%,4℃静置12小时,10000g离心1小时去除沉淀。上清液用50kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至浓度20mg/ml,上样于Sepharose 4FF柱,上样180毫升(10%柱体积)。用0.2mol/L氯化钠溶液洗脱;收集Kd0.5之前的洗脱峰,加入乙醇至终浓度75%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤两次。洗涤的多糖经冷冻干燥,获得1865mg精制C群脑膜炎球菌多糖。
各项检定指标如下:
实施例4
采用生物反应器对W135群脑膜炎球菌进行发酵培养;于对数生长后期杀菌后,离心收集上清液;在上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵至终浓度0.1%,室温静置12小时后,离心收集沉淀;沉淀中加入1mol/L CaCl2溶液,搅拌3小时后,加入乙醇至终浓度25%,离心收集上清液;上清液加入乙醇至终浓度75%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;洗涤后的多糖经冷冻干燥,获得W135群脑膜炎球菌粗制多糖。
20克粗糖按10mg/ml溶解于注射用水,按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提2次,4000g离心30分钟收集上清,上清加入氯化钙至0.5mol/L,加入乙醇至25%,4℃静置12小时,10000g离心1小时去除沉淀。上清液用30kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至浓度10mg/ml,上样于Sepharose 4FF柱,上样90毫升(5%柱体积)。用0.02mol/L氯化钙溶液洗脱;收集Kd0.5之前的洗脱峰,加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤两次。洗涤的多糖经冷冻干燥,获得650mg精制W135群脑膜炎球菌多糖。
各项检定指标如下:
实施例5
采用生物反应器对Y群脑膜炎球菌进行发酵培养;于对数生长后期用甲醛杀菌后,离心收集上清液;在上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵至终浓度0.1%,室温静置12小时后,离心收集沉淀;沉淀中加入1mol/LCaCl2溶液,搅拌3小时后,加入乙醇至终浓度25%,离心收集上清液;上清液加入乙醇至终浓度75%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;洗涤后的多糖经真空冷冻干燥,获得Y群脑膜炎球菌粗制多糖。
25克粗糖按20mg/ml溶解于注射用水,按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次,4000g离心30分钟收集上清,上清加入氯化钙至0.5mol/L,加入乙醇至25%,4℃静置12小时,10000g离心1小时去除沉淀。上清液用50kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至浓度50mg/ml,上样于Sepharose 4FF柱,上样54毫升(柱体积的3%)。用1.0mol/L氯化钙溶液洗脱;收集Kd0.5之前的洗脱峰,加入乙醇至终浓度75%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次。洗涤的多糖经冷冻干燥,获得1760mg精制Y群脑膜炎球菌多糖。
各项检定指标如下:
实施例6
采用生物反应器对伤寒沙门氏菌进行发酵;于对数生长后期用甲醛杀菌后,离心收集上清液;在上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵至终浓度0.1%,室温静置12小时后,离心收集沉淀;沉淀中加入1mol/LCaCl2溶液,搅拌3小时后,加入乙醇至终浓度25%,离心收集上清液;上清液加入乙醇至终浓度75%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;洗涤后的多糖经冷冻干燥,获得伤寒Vi粗制多糖;
15克粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中,按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次,4000g离心30分钟收集上清,上清加入氯化钙至0.5mol/L,加入乙醇至25%,4℃静置12小时,10000g离心1小时去除沉淀。上清液用30kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至20mg/ml,上样于Sepharose 4FF柱,上样72毫升(柱体积的4%)。用0.2mol/L氯化钙溶液洗脱;收集Kd0.5之前的洗脱峰,加入乙醇至终浓度70%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次。洗涤的多糖经冷冻干燥,获得1050mg精制伤寒Vi多糖。
各项检定指标如下:
实施例7
采用生物反应器对A群链球菌进行发酵;于对数生长期后期用甲醛杀菌后,离心收集菌体;按照菌体湿重每100克加入0.5mol/LNaOH500毫升,搅拌下提取2小时,加入醋酸中和至pH7.0,4000rpm离心30分钟收集上清。用50kD超滤膜超滤,加入CaCl2至0.5mol/L,加入乙醇至终浓度25%,离心收集上清液;上清液加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;洗涤后的多糖经冷冻干燥,获得A群链球菌粗制多糖。
将15g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中,按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提2次,4000g离心30分钟收集上清,上清加入氯化钙至0.5mol/L,加入乙醇至25%,4℃静置12小时,10000g离心1小时去除沉淀。上清液用50kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至40mg/ml,上样于Sepharose 4FF柱,上样108毫升(柱体积的6%)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱;收集Kd0.5之前的洗脱峰,加入乙醇至终浓度90%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;经洗涤的多糖经冷冻干燥,获得1750mg精制A群链球菌多糖。
各项检定指标如下:
实施例8
采用生物反应器对B群链球菌进行发酵;于对数生长期后期用甲醛杀菌后,离心收集菌体;按照菌体湿重每100克加入0.5mol/LNaOH500毫升,搅拌下提取2小时,加入醋酸中和至pH7.0,4000rpm离心30分钟收集上清。用50kD超滤膜超滤,加入CaCl2至0.5mol/L,加入乙醇至终浓度25%,离心收集上清液;上清液加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;洗涤后的多糖经冷冻干燥,获得B群链球菌粗制多糖。
将25g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中,按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提2次,4000g离心30分钟收集上清,上清加入氯化钙至0.5mol/L,加入乙醇至25%,4℃静置12小时,10000g离心1小时去除沉淀。上清液用30kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至30mg/ml,上样于Sepharose 4FF柱,上样90毫升(柱体积的5%)。用0.3mol/L氯化钙溶液洗脱;收集Kd0.5之前的洗脱峰,加入乙醇至终浓度90%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;经洗涤的多糖经冷冻干燥,获得850mg精制B群链球菌多糖。
各项检定指标如下:
实施例9
采用生物反应器对肺炎链球菌1型进行发酵;于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后,离心收集上清液;上清用50kD超滤膜浓缩10倍,加入CaCl2至0.5mol/L,加入乙醇至终浓度25%,离心收集上清液;上清液加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;洗涤后的多糖经冷冻干燥,获得肺炎链球菌1型粗制多糖。
将25g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中,按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次,4000g离心30分钟收集上清,上清加入氯化钙至0.5mol/L,加入乙醇至25%,4℃静置12小时,10000g离心1小时去除沉淀。上清液用30kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至25mg/ml,上样于Sepharose 4FF柱,上样180毫升(柱体积的10%)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱;收集Kd0.5之前的洗脱峰,加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;经洗涤的多糖经冷冻干燥,获得1650mg精制肺炎链球菌1型多糖。
各项检定指标如下:
实施例10
采用生物反应器对肺炎链球菌2型进行发酵;于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后,离心收集上清液;上清用50kD超滤膜浓缩10倍,加入CaCl2至0.5mol/L,加入乙醇至终浓度25%,离心收集上清液;上清液加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;洗涤后的多糖经冷冻干燥,获得肺炎链球菌2型粗制多糖。
将25g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中,按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次,4000g离心30分钟收集上清,上清加入氯化钙至0.5mol/L,加入乙醇至25%,4℃静置12小时,10000g离心1小时去除沉淀。上清液用30kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至20mg/ml,上样于Sepharose 4FF柱,上样180毫升(柱体积的10%)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱;收集Kd0.5之前的洗脱峰,加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;经洗涤的多糖经冷冻干燥,获得1650mg精制肺炎链球菌2型多糖。
各项检定指标如下:
实施例11
采用生物反应器对肺炎链球菌3型进行发酵;于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后,离心收集上清液;上清用50kD超滤膜浓缩10倍,加入CaCl2至0.5mol/L,加入乙醇至终浓度25%,离心收集上清液;上清液加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;洗涤后的多糖经冷冻干燥,获得肺炎链球菌3型粗制多糖。
将30g粗糖按20mg/ml溶解于注射用水中,按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次,4000g离心30分钟收集上清,上清加入氯化钙至0.5mol/L,加入乙醇至25%,4℃静置12小时,10000g离心1小时去除沉淀。上清液用30kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至25mg/ml,上样于Sepharose 4FF柱,上样180毫升(柱体积的10%)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱;收集Kd0.5之前的洗脱峰,加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;经洗涤的多糖经冷冻干燥,获得1850mg精制肺炎链球菌3型多糖。
各项检定指标如下:
实施例12
采用生物反应器对肺炎链球菌4型进行发酵;于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后,离心收集上清液;上清用50kD超滤膜浓缩10倍,加入CaCl2至0.5mol/L,加入乙醇至终浓度25%,离心收集上清液;上清液加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;洗涤后的多糖经冷冻干燥,获得肺炎链球菌4型粗制多糖。
将15g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中,按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次,4000g离心30分钟收集上清,上清加入氯化钙至0.5mol/L,加入乙醇至25%,4℃静置12小时,10000g离心1小时去除沉淀。上清液用30kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至25mg/ml,上样于Sepharose 4FF柱,上样90毫升(柱体积的5%)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱;收集Kd0.5之前的洗脱峰,加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;经洗涤的多糖经冷冻干燥,获得1250mg精制肺炎链球菌4型多糖。
各项检定指标如下:
实施例13
采用生物反应器对肺炎链球菌5型进行发酵;于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后,离心收集上清液;上清用50kD超滤膜浓缩10倍,加入CaCl2至0.5mol/L,加入乙醇至终浓度25%,离心收集上清液;上清液加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;洗涤后的多糖经冷冻干燥,获得肺炎链球菌5型粗制多糖。
将25g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中,按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次,4000g离心30分钟收集上清,上清加入氯化钙至0.5mol/L,加入乙醇至25%,4℃静置12小时,10000g离心1小时去除沉淀。上清液用30kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至25mg/ml,上样于Sepharose 4FF柱,上样180毫升(柱体积的10%)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱;收集Kd0.5之前的洗脱峰,加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;经洗涤的多糖经冷冻干燥,获得1020mg精制肺炎链球菌5型多糖。
各项检定指标如下:
实施例14
采用生物反应器对肺炎链球菌6B型进行发酵;于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后,离心收集上清液;上清用50kD超滤膜浓缩10倍,加入CaCl2至0.5mol/L,加入乙醇至终浓度25%,离心收集上清液;上清液加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;洗涤后的多糖经冷冻干燥,获得肺炎链球菌6B型粗制多糖。
将20g粗糖按20mg/ml溶解于注射用水中,按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次,4000g离心30分钟收集上清,上清加入氯化钙至0.5mol/L,加入乙醇至25%,4℃静置12小时,10000g离心1小时去除沉淀。上清液用30kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至40mg/ml,上样于Sepharose 4FF柱,上样54毫升(柱体积的3%)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱;收集Kd0.5之前的洗脱峰,加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;经洗涤的多糖经冷冻干燥,获得1350mg精制肺炎链球菌6B型多糖。
各项检定指标如下:
实施例15
采用生物反应器对肺炎链球菌7F型进行发酵;于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后,离心收集上清液;上清用50kD超滤膜浓缩10倍,加入CaCl2至0.5mol/L,加入乙醇至终浓度25%,离心收集上清液;上清液加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;洗涤后的多糖经冷冻干燥,获得肺炎链球菌7F型粗制多糖。
将30g粗糖按20mg/ml溶解于注射用水中,按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次,4000g离心30分钟收集上清,上清加入氯化钙至0.5mol/L,加入乙醇至25%,4℃静置12小时,10000g离心1小时去除沉淀。上清液用30kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至25mg/ml,上样于Sepharose 4FF柱,上样180毫升(柱体积的10%)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱;收集Kd0.5之前的洗脱峰,加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;经洗涤的多糖经冷冻干燥,获得2250mg精制肺炎链球菌7F型多糖。
各项检定指标如下:
实施例16
采用生物反应器对肺炎链球菌8型进行发酵;于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后,离心收集上清液;上清用50kD超滤膜浓缩10倍,加入CaCl2至0.5mol/L,加入乙醇至终浓度25%,离心收集上清液;上清液加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;洗涤后的多糖经冷冻干燥,获得肺炎链球菌8型粗制多糖。
将25g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中,按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次,4000g离心30分钟收集上清,上清加入氯化钙至0.5mol/L,加入乙醇至25%,4℃静置12小时,10000g离心1小时去除沉淀。上清液用50kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至25mg/ml,上样于Sepharose 4FF柱,上样90毫升(柱体积的5%)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱;收集Kd0.5之前的洗脱峰,加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;经洗涤的多糖经冷冻干燥,获得1750mg精制肺炎链球菌8型多糖。
各项检定指标如下:
实施例17
采用生物反应器对肺炎链球菌9N型进行发酵;于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后,离心收集上清液;上清用50kD超滤膜浓缩10倍,加入CaCl2至0.5mol/L,加入乙醇至终浓度25%,离心收集上清液;上清液加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;洗涤后的多糖经冷冻干燥,获得肺炎链球菌9N型粗制多糖。
将25g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中,按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次,4000g离心30分钟收集上清,上清加入氯化钙至0.5mol/L,加入乙醇至25%,4℃静置12小时,10000g离心1小时去除沉淀。上清液用30kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至25mg/ml,上样于Sepharose 4FF柱,上样180毫升(柱体积的10%)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱;收集Kd0.5之前的洗脱峰,加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;经洗涤的多糖经冷冻干燥,获得1320mg精制肺炎链球菌9N型多糖。
各项检定指标如下:
实施例18
采用生物反应器对肺炎链球菌9V型进行发酵;于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后,离心收集上清液;上清用50kD超滤膜浓缩10倍,加入CaCl2至0.5mol/L,加入乙醇至终浓度25%,离心收集上清液;上清液加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;洗涤后的多糖经冷冻干燥,获得肺炎链球菌9V型粗制多糖。
将30g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中,按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次,4000g离心30分钟收集上清,上清加入氯化钙至0.5mol/L,加入乙醇至25%,4℃静置12小时,10000g离心1小时去除沉淀。上清液用30kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至20mg/ml,上样于Sepharose 4FF柱,上样180毫升(柱体积的10%)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱;收集Kd0.5之前的洗脱峰,加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;经洗涤的多糖经冷冻干燥,获得1550mg精制肺炎链球菌9V型多糖。
各项检定指标如下:
实施例19
采用生物反应器对肺炎链球菌10A型进行发酵;于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后,离心收集上清液;上清用50kD超滤膜浓缩10倍,加入CaCl2至0.5mol/L,加入乙醇至终浓度25%,离心收集上清液;上清液加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;洗涤后的多糖经冷冻干燥,获得肺炎链球菌10A型粗制多糖。
将30g粗糖按20mg/ml溶解于注射用水中,按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次,4000g离心30分钟收集上清,上清加入氯化钙至0.5mol/L,加入乙醇至25%,4℃静置12小时,10000g离心1小时去除沉淀。上清液用30kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至25mg/ml,上样于Sepharose 4FF柱,上样180毫升(柱体积的10%)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱;收集Kd0.5之前的洗脱峰,加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;经洗涤的多糖经冷冻干燥,获得1730mg精制肺炎链球菌10A型多糖。
各项检定指标如下:
实施例20
采用生物反应器对肺炎链球菌11A型进行发酵;于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后,离心收集上清液;上清用50kD超滤膜浓缩10倍,加入CaCl2至0.5mol/L,加入乙醇至终浓度25%,离心收集上清液;上清液加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;洗涤后的多糖经冷冻干燥,获得肺炎链球菌11A型粗制多糖。
将25g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中,按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次,4000g离心30分钟收集上清,上清加入氯化钙至0.5mol/L,加入乙醇至25%,4℃静置12小时,10000g离心1小时去除沉淀。上清液用30kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至25mg/ml,上样于Sepharose 4FF柱,上样90毫升(柱体积的5%)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱;收集Kd0.5之前的洗脱峰,加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;经洗涤的多糖经冷冻干燥,获得1560mg精制肺炎链球菌11A型多糖。
各项检定指标如下:
实施例21
采用生物反应器对肺炎链球菌12F型进行发酵;于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后,离心收集上清液;上清用50kD超滤膜浓缩10倍,加入CaCl2至0.5mol/L,加入乙醇至终浓度25%,离心收集上清液;上清液加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;洗涤后的多糖经冷冻干燥,获得肺炎链球菌12F型粗制多糖。
将25g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中,按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次,4000g离心30分钟收集上清,上清加入氯化钙至0.5mol/L,加入乙醇至25%,4℃静置12小时,10000g离心1小时去除沉淀。上清液用30kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至25mg/ml,上样于Sepharose 4FF柱,上样180毫升(柱体积的10%)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱;收集Kd0.5之前的洗脱峰,加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;经洗涤的多糖经冷冻干燥,获得1220mg精制肺炎链球菌12F型多糖。
各项检定指标如下:
实施例22
采用生物反应器对肺炎链球菌14型进行发酵;于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后,离心收集上清液;上清用50kD超滤膜浓缩10倍,加入CaCl2至0.5mol/L,加入乙醇至终浓度25%,离心收集上清液;上清液加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;洗涤后的多糖经冷冻干燥,获得肺炎链球菌14型粗制多糖。
将40g粗糖按20mg/ml溶解于注射用水中,按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次,4000g离心30分钟收集上清,上清加入氯化钙至0.5mol/L,加入乙醇至25%,4℃静置12小时,10000g离心1小时去除沉淀。上清液用30kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至30mg/ml,上样于Sepharose 4FF柱,上样180毫升(柱体积的10%)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱;收集Kd0.5之前的洗脱峰,加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;经洗涤的多糖经冷冻干燥,获得2350mg精制肺炎链球菌14型多糖。
各项检定指标如下:
实施例23
采用生物反应器对肺炎链球菌15B型进行发酵;于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后,离心收集上清液;上清用50kD超滤膜浓缩10倍,加入CaCl2至0.5mol/L,加入乙醇至终浓度25%,离心收集上清液;上清液加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;洗涤后的多糖经冷冻干燥,获得肺炎链球菌15B型粗制多糖。
将30g粗糖按20mg/ml溶解于注射用水中,按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次,4000g离心30分钟收集上清,上清加入氯化钙至0.5mol/L,加入乙醇至25%,4℃静置12小时,10000g离心1小时去除沉淀。上清液用30kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至25mg/ml,上样于Sepharose 4FF柱,上样180毫升(柱体积的10%)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱;收集Kd0.5之前的洗脱峰,加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;经洗涤的多糖经冷冻干燥,获得2150mg精制肺炎链球菌15B型多糖。
各项检定指标如下:
实施例24
采用生物反应器对肺炎链球菌17F型进行发酵;于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后,离心收集上清液;上清用50kD超滤膜浓缩10倍,加入CaCl2至0.5mol/L,加入乙醇至终浓度25%,离心收集上清液;上清液加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;洗涤后的多糖经冷冻干燥,获得肺炎链球菌17F型粗制多糖。
将25g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中,按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次,4000g离心30分钟收集上清,上清加入氯化钙至0.5mol/L,加入乙醇至25%,4℃静置12小时,10000g离心1小时去除沉淀。上清液用50kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至25mg/ml,上样于Sepharose 4FF柱,上样90毫升(柱体积的5%)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱;收集Kd0.5之前的洗脱峰,加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;经洗涤的多糖经冷冻干燥,获得1350mg精制肺炎链球菌17F型多糖。
各项检定指标如下:
实施例25
采用生物反应器对肺炎链球菌18C型进行发酵;于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后,离心收集上清液;上清用50kD超滤膜浓缩10倍,加入CaCl2至0.5mol/L,加入乙醇至终浓度25%,离心收集上清液;上清液加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;洗涤后的多糖经冷冻干燥,获得肺炎链球菌18C型粗制多糖。
将25g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中,按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次,4000g离心30分钟收集上清,上清加入氯化钙至0.5mol/L,加入乙醇至25%,4℃静置12小时,10000g离心1小时去除沉淀。上清液用50kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至25mg/ml,上样于Sepharose 4FF柱,上样90毫升(柱体积的5%)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱;收集Kd0.5之前的洗脱峰,加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;经洗涤的多糖经冷冻干燥,获得1750mg精制肺炎链球菌18C型多糖。
各项检定指标如下:
实施例26
采用生物反应器对肺炎链球菌19A型进行发酵;于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后,离心收集上清液;上清用50kD超滤膜浓缩10倍,加入CaCl2至0.5mol/L,加入乙醇至终浓度25%,离心收集上清液;上清液加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;洗涤后的多糖经冷冻干燥,获得肺炎链球菌19A型粗制多糖。
将30g粗糖按20mg/ml溶解于注射用水中,按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次,4000g离心30分钟收集上清,上清加入氯化钙至0.5mol/L,加入乙醇至25%,4℃静置12小时,10000g离心1小时去除沉淀。上清液用50kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至25mg/ml,上样于Sepharose 4FF柱,上样90毫升(柱体积的5%)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱;收集Kd0.5之前的洗脱峰,加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;经洗涤的多糖经冷冻干燥,获得1850mg精制肺炎链球菌19A型多糖。
各项检定指标如下:
实施例27
采用生物反应器对肺炎链球菌19F型进行发酵;于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后,离心收集上清液;上清用50kD超滤膜浓缩10倍,加入CaCl2至0.5mol/L,加入乙醇至终浓度25%,离心收集上清液;上清液加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;洗涤后的多糖经冷冻干燥,获得肺炎链球菌19F型粗制多糖。
将25g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中,按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提2次,4000g离心30分钟收集上清,上清加入氯化钙至0.5mol/L,加入乙醇至25%,4℃静置12小时,10000g离心1小时去除沉淀。上清液用50kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至40mg/ml,上样于Sepharose 4FF柱,上样72毫升(柱体积的4%)。用0.1mol/L氯化钙溶液洗脱;收集Kd0.5之前的洗脱峰,加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;经洗涤的多糖经冷冻干燥,获得1350mg精制肺炎链球菌19F型多糖。
各项检定指标如下:
实施例28
采用生物反应器对肺炎链球菌20型进行发酵;于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后,离心收集上清液;上清用50kD超滤膜浓缩10倍,加入CaCl2至0.5mol/L,加入乙醇至终浓度25%,离心收集上清液;上清液加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;洗涤后的多糖经冷冻干燥,获得肺炎链球菌20型粗制多糖。
将25g粗糖按20mg/ml溶解于注射用水中,按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次,4000g离心30分钟收集上清,上清加入氯化钙至0.5mol/L,加入乙醇至25%,4℃静置12小时,10000g离心1小时去除沉淀。上清液用50kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至25mg/ml,上样于Sepharose 4FF柱,上样90毫升(柱体积的5%)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱;收集Kd0.5之前的洗脱峰,加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;经洗涤的多糖经冷冻干燥,获得1550mg精制肺炎链球菌20型多糖。
各项检定指标如下:
实施例29
采用生物反应器对肺炎链球菌22F型进行发酵;于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后,离心收集上清液;上清用50kD超滤膜浓缩10倍,加入CaCl2至0.5mol/L,加入乙醇至终浓度25%,离心收集上清液;上清液加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;洗涤后的多糖经冷冻干燥,获得肺炎链球菌22F型粗制多糖。
将30g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中,按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次,4000g离心30分钟收集上清,上清加入氯化钙至0.5mol/L,加入乙醇至25%,4℃静置12小时,10000g离心1小时去除沉淀。上清液用50kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至30mg/ml,上样于Sepharose 4FF柱,上样90毫升(柱体积的5%)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱;收集Kd0.5之前的洗脱峰,加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;经洗涤的多糖经冷冻干燥,获得1750mg精制肺炎链球菌22F型多糖。
各项检定指标如下:
实施例30
采用生物反应器对肺炎链球菌23F型进行发酵;于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后,离心收集上清液;上清用50kD超滤膜浓缩10倍,加入CaCl2至0.5mol/L,加入乙醇至终浓度25%,离心收集上清液;上清液加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;洗涤后的多糖经冷冻干燥,获得肺炎链球菌23F型粗制多糖。
将25g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中,按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提2次,4000g离心30分钟收集上清,上清加入氯化钙至0.5mol/L,加入乙醇至25%,4℃静置12小时,10000g离心1小时去除沉淀。上清液用50kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至40mg/ml,上样于Sepharose 4FF柱,上样90毫升(柱体积的5%)。用0.1mol/L氯化钙溶液洗脱;收集Kd0.5之前的洗脱峰,加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;经洗涤的多糖经冷冻干燥,获得2350mg精制肺炎链球菌23F型多糖。
各项检定指标如下:
实施例31
采用生物反应器对肺炎链球菌33F型进行发酵;于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后,离心收集上清液;上清用50kD超滤膜浓缩10倍,加入CaCl2至0.5mol/L,加入乙醇至终浓度25%,离心收集上清液;上清液加入乙醇至终浓度80%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;洗涤后的多糖经冷冻干燥,获得肺炎链球菌33F型粗制多糖。
将30g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中,按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次,4000g离心30分钟收集上清,上清加入氯化钙至0.5mol/L,加入乙醇至25%,4℃静置12小时,10000g离心1小时去除沉淀。上清液用50kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至25mg/ml,上样于Sepharose 4FF柱,上样90毫升(柱体积的5%)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱;收集Kd0.5之前的洗脱峰,加入乙醇至终浓度70%,离心收集多糖沉淀;多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次;经洗涤的多糖经冷冻干燥,获得1850mg精制肺炎链球菌33F型多糖。
各项检定指标如下:
本发明与现有技术的比较:
从上表可以看出,本发明纯化获得的细菌多糖的蛋白含量、核酸含量、内毒素含量均优于现有技术,说明本发明是一种获得高纯度细菌多糖的新方法,本发明纯化获得的细菌多糖适合于制备疫苗。