CN104592408A - 一种荚膜多糖的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种荚膜多糖的纯化方法，其步骤主要为：多糖粗制品溶解后经乙醇分级沉淀、膜超滤、十六烷基三甲基溴化铵沉淀、膜超滤、冻干步骤获得纯度较高的荚膜多糖。此过程能将粗制品中含有的培养基、细菌代谢产物及细菌本身含有的蛋白、核酸等杂质去除。方法简便、有效，且不需要使用苯酚、丙酮等对环境污染、伤害人体健康的有机溶剂，能将核酸、蛋白、内毒素等杂质含量控制在符合或优于《中华人民共和国药典》(2010版)或《欧洲药典》(8.0版)的标准范围以内。提取的荚膜多糖适用于疾病的诊断、预防和治疗，尤其适用于细菌多糖或结合疫苗的制备。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及对细菌性荚膜多糖粗制品的纯化方法。
背景技术
细菌的荚膜是包裹在细菌细胞外的一层黏性物质，主要成分是多糖，是细菌的保护性抗原和毒力因子。随着生物化学技术的广泛应用，可将细菌的荚膜作为有效的抗原成分提取出来，作为制备疫苗的候选抗原。
由于发酵液中存在大量的培养细菌生长过程中代谢产物，为了避免二次污染，保证多糖的稳定性，需要快速的将多糖与细胞残片等杂质分离，往往先制备成粗制品的形式。虽然粗制品能暂时保证多糖的稳定性，但其中成份复杂，各种杂质含量仍然很高。为了满足疫苗制备所必须的荚膜多糖纯度，仍需经过纯化步骤处理，将粗制品中多余的蛋白、核酸、内毒素等杂质去除，从而避免后续接种疫苗可能引起的副反应。
传统荚膜多糖的纯化是以Gotschlich的方法(Gotschlich EC,Liu T Y,Artenstein MS.Human immunity to the meningococcus III.Preparation and immunochemical properties of thegroup A,group B,and group C meningococcal polysaccharides[J].J Exp Med,1969,129(6):1349)为基础发展起来的。国内最权威的，《中华人民共和国药典》2010版三部中明确指出A群脑膜炎球菌多糖疫苗和伤寒Vi多糖疫苗均采用以下方法进行多糖纯化：多糖粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液稀释至适宜浓度；按适当比例用冷酚提取数次，离心收集上清液，并用0.1mol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析或超滤，加入乙醇至终浓度为75％～80％；离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙酮分别洗涤，干燥后用灭菌注射用水溶解沉淀物，除菌过滤后即为多糖原液。国内疫苗生产厂家多采用此法进行荚膜多糖的纯化，如23价肺炎链球菌荚膜多糖疫苗的研制采用方法大致流程如下：粗制粗糖按1:2用冷酚抽提去蛋白，乙醇沉淀多糖后用无水乙醇、丙酮洗涤多糖(杨耀,栗克喜等.23价肺炎链球菌荚膜多糖疫苗的研制.中国生物制品学杂质,2000,13(3):154-156)(韩菲,曹欣等.23价肺炎链球菌荚膜多糖疫苗的研制.国际生物制品学杂质,2010,33(3):134-138)。
国内对细菌荚膜多糖的纯化工艺一直沿用传统的酚抽提法，该方法需要较长的离心时间，且苯酚作为有一种具有极强腐蚀的试剂，可能腐蚀操作者的皮肤、粘膜甚至抑制操作者的中枢神经或损害肝、肾功能；且废弃苯酚的处理，对环境保护来说存在着较严重的威胁。因此，开发出来新的、有效的、环保的荚膜多糖纯化工艺是我们所关注的。
美国专利US004686102、US5714354中分别公开了23价肺炎多糖疫苗的制备方法，绝大多数型别使用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)去除来沉淀肺炎荚膜多糖，US004686102仍需增加活性炭和多步乙醇沉淀的方法，US5714354需活性炭、羟基磷灰石、阴离子交换来纯化多糖，才能获得核酸、蛋白指标满足疫苗制备的要求。其步骤繁琐，很大程度上影响荚膜多糖的回收率。
专利US5847112提到对于可采用离子交换的方法获得纯度较高的精糖，但对于粗制品的处理是用核酸和蛋白酶的方法来控制最终多糖中核酸、蛋白的含量。专利CN 102653565 A中提到用CTAB结合超滤、乙醇沉淀的方法能将核酸、蛋白含量控制在很低的水平，但同样在粗制品部分添加了蛋白酶处理的。我们知道如果制品添加了额外的核酸酶、蛋白酶，为了避免外源因子的污染，将会增加后续纯化的负担，同时仍需对最终产品中的残留量进行控制；且酶的成本昂贵、处理量小，不适合规模化的使用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术纯化荚膜多糖需增加加多试剂、工艺复杂或增加有害苯酚、丙酮等有毒有害试剂、对操作人员健康带来危害，造成环境污染，或添加额外的、成本昂贵的蛋白酶或核酸酶、增加后续纯化的负担的缺陷和不足，其目的是提供一种不论粗制品中杂质成分有多复杂，杂质含量有高，均能纯化出安全性较高的、符合标准或优于标准的、工艺简便的、适合于产业化的荚膜多糖纯化新方法。
本发明所述的新方法的技术方案如下：
1.一种荚膜多糖的纯化方法，包括以下步骤：
(1)将荚膜多糖粗制品用注射用水溶解至荚膜多糖粗制品的终浓度为2～20mg/ml，再加入CaCl2和乙醇，使CaCl2的终浓度为0.3～0.8mol/L，乙醇的终浓度为20～35％(ml/ml)，充分搅拌后，静置沉淀6～12小时后离心，收集上清；
(2)上清液用孔径为10～100KD膜超滤，得超滤浓缩液1，超滤所用的注射用水体积为上清液体积的10～20倍；
(3)向超滤浓缩液1中加入十六烷基三甲基溴化铵至十六烷基三甲基溴化铵的终浓度为0.5～5％(g/ml)，充分搅拌后，静置沉淀6～12小时后离心，收集沉淀；
(4)沉淀用浓度为0.05～0.5mol/L盐溶液溶解，离心收集上清，并进行澄清过滤得滤液；
(5)滤液用孔径为10～100KD膜超滤浓缩，得超滤浓缩液2，超滤浓缩所用的注射用水体积为上清液体积的5～10倍；
(6)超滤浓缩液2经冷冻干燥，即为纯化的荚膜多糖。
2.根据技术方案1所述的一种荚膜多糖的纯化方法，所述的荚膜多糖为细菌荚膜多糖包括但不限于以下任意一种：肺炎球菌荚膜多糖、脑膜炎双球菌荚膜多糖、b型流感嗜血杆菌荚膜多糖、伤寒Vi荚膜多糖。
3.根据技术方案1或2所述的一种荚膜多糖的纯化方法，步骤(2)所用的膜包括但不限于以下任意一种：孔径为10～100KD的超滤膜、孔径为10～100KD的中空纤维滤膜。
4.根据技术方案1或2所述的一种荚膜多糖的纯化方法，步骤(5)所用的膜包括但不限于以下任意一种：孔径为10～100KD膜超滤膜、孔径为10～100KD的中空纤维滤膜。
5.根据技术方案1或2所述的一种荚膜多糖的纯化方法，步骤(4)所述的盐包括但不限于以下任意一种：NaCl、CaCl2、MgCl2。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、不论荚膜多糖粗制品中杂质含量有多高，采用本发明方法最终均能将核酸、蛋白、内毒素等杂质含量控制在符合或优于《中华人民共和国药典》(2010版)或《欧洲药典》(8.0版)的标准范围以内。且该方法不仅能纯化出纯度高的革兰氏阳性细菌的荚膜多糖，如肺炎荚膜多糖；同时也能将内毒素产生大户，革兰氏阴性细菌中的内毒素含量控制在10EU/μg以内，如流脑荚膜多糖和伤寒Vi荚膜多糖。大大提高制品的安全性，可用于纯度高的细菌性荚膜多糖疫苗或多糖蛋白结合疫苗的制备。
2、本发明方法简便、有效、每一步骤易放大，处理量大，对设备要求低投入成本较低，适宜规模化生产。
3、本发明的纯化过程避免了苯酚、丙酮等有毒有害试剂的使用，减小了对操作人员健康的危害，避免了有毒有害试剂对生态环境造成的污染。
4、本发明的纯化过程避免了核酸、蛋白酶等外源因子的使用，工艺简单、同时降低了后续检测项目的压力。
5、本发明方法荚膜多糖回收率高，相应降低了成本(本发明步骤少，因此，损失量小、回收率高，而现有技术纯化步骤多，每增加一步骤，收率相应降低20％)。
具体实施方式
通过以下实施例进一步阐明本发明，以下各实施例操作中无特殊说明的为常规方法。
材料来源：
肺炎球菌、脑膜炎双球菌、b型流感嗜血杆菌、伤寒沙门氏菌购置于中国食品药品检定研究院的中国医学细菌保藏管理中心。其肺炎球菌荚膜多糖粗制品、脑膜炎双球菌荚膜多糖粗制品、b型流感嗜血杆菌荚膜多糖粗制品、伤寒Vi荚膜多糖粗制品具体制备方法参照《中华人民共和国药典》(2010版)进行制备。
超滤膜及夹具：0.1平米(购自美国颇尔公司)。
中空纤维滤膜系统：QuixStand系统(购自通用电气公司)。
离心机：CR21G(购自日立公司)。
其余化学试剂均购于国药集团化学试剂有限公司。
实施例1 18C型肺炎球菌荚膜多糖的纯化
一、18C型肺炎球菌荚膜多糖的纯化
(1)将18C型肺炎球菌荚膜多糖粗制品用注射用水溶解至18C型肺炎球菌荚膜多糖粗制品终浓度为20mg/ml，再加入CaCl2和乙醇，使CaCl2的终浓度为0.3mol/L，乙醇的终浓度为20％(ml/ml)，充分搅拌后，静置沉淀8小时后于10000r/min、8℃条件下离心60min，收集上清；
(2)上清液用孔径为100KD中空纤维滤膜超滤，获得超滤浓缩液1，超滤所用的注射用水体积为上清液体积的20倍；
(3)向超滤浓缩1中加入十六烷基三甲基溴化铵至十六烷基三甲基溴化铵的终浓度为3％(g/ml)，充分搅拌后，静置沉淀8小时后于10000r/min、23℃条件下离心30min，收集沉淀；
(4)沉淀用浓度为0.5mol/L的CaCl2溶液溶解，于10000r/min、8℃条件下离心45min收集上清，并进行澄清过滤得滤液；
(5)滤液用孔径为100KD中空纤维滤膜超滤浓缩，获得超滤浓缩液2，超滤浓缩所用的注射用水体积为上清液体积的10倍；
(6)超滤浓缩液2于-40℃条件下冷冻干燥，即为纯化的18C型肺炎球菌荚膜多糖。
二、18C型肺炎球菌荚膜多糖的检测
其中蛋白含量的检测依据《中国药典》2010版三部(附录ⅥB第二法)进行；核酸含量的检测依据《中国药典》2010版三部(附录ⅡA)进行；总氮含量的检测依据《中国药典》2010版三部(附录ⅥA)进行；磷含量的检测依据《中国药典》2010版三部(附录ⅦA)进行；甲基戊糖含量的检测依据《欧洲药典》(8.0版)2.5.21法进行；荚膜多糖分子大小的检测依据《欧洲药典》(8.0版)2.2.30法进行；内毒素含量的检测依据《中国药典》2010版三部(附录ⅫE)进行；鉴别试验依据《中国药典》2010版三部(附录ⅧC)进行，其结果见表1。
表1 Pn18C荚膜多糖检测指标
实施例2 6A型肺炎球菌荚膜多糖的纯化
一、6A型肺炎球菌荚膜多糖的纯化
(1)将6A型肺炎球菌荚膜多糖粗制品用注射用水溶解至6A型肺炎球菌荚膜多糖粗制品终浓度为20mg/ml，再加入CaCl2和乙醇，至CaCl2的终浓度为0.8mol/L，乙醇的终浓度为35％(ml/ml)，充分搅拌后，静置沉淀8小时后于10000r/min、8℃条件下离心60min，收集上清；
(2)上清液用孔径为10KD超滤膜超滤，获得超滤浓缩液1，超滤所用的注射用水体积为上清液体积的10倍；
(3)向超滤浓缩1中加入十六烷基三甲基溴化铵至十六烷基三甲基溴化铵的终浓度为5％(g/ml)，充分搅拌后，静置沉淀8小时后离心于10000r/min、23℃条件下离心30min，收集沉淀；
(4)沉淀用浓度为0.1mol/L NaCl溶液溶解，于10000r/min、8℃条件下离心45min收集上清，并进行澄清过滤得滤液；
(5)滤液用孔径为10KD超滤膜超滤浓缩，获得超滤浓缩液2，超滤浓缩所用的注射用水体积为上清液体积的5倍；
(6)超滤浓缩液2于-40℃条件下冷冻干燥，即为纯化的6A型肺炎球菌荚膜多糖。
二、6A型肺炎球菌荚膜多糖的检测
其中蛋白含量的检测依据《中国药典》2010版三部(附录ⅥB第二法)进行；核酸含量的检测依据《中国药典》2010版三部(附录ⅡA)进行；总氮含量的检测依据《中国药典》2010版三部(附录ⅥA)进行；磷含量的检测依据《中国药典》2010版三部(附录ⅦA)进行；甲基戊糖含量的检测依据《欧洲药典》(8.0版)2.5.21法进行；荚膜多糖分子大小的检测依据《欧洲药典》(8.0版)2.2.30法进行；内毒素含量的检测依据《中国药典》2010版三部(附录ⅫE)进行；鉴别试验依据《中国药典》2010版三部(附录ⅧC)进行，其结果见表2。
表2 Pn6A荚膜多糖检测指标
备注：Pn6A型的标准参见Pn6B型的标准。
实施例3 A群脑膜炎双球菌荚膜多糖的纯化
一、A群脑膜炎双球菌荚膜多糖的纯化
(1)将A群脑膜炎双球菌荚膜多糖粗制品用注射用水溶解至A群脑膜炎双球菌荚膜多糖粗制品终浓度为2mg/ml，再加入CaCl2和乙醇，使CaCl2的终浓度为0.5mol/L，乙醇的终浓度为25％(ml/ml)，充分搅拌后，静置沉淀12小时后于10000r/min、8℃条件下离心60min，收集上清；
(2)上清液用孔径为为30KD超滤膜超滤，获得超滤浓缩液1，超滤所用的注射用水体积为上清液体积的15倍；
(3)向超滤浓缩1中加入十六烷基三甲基溴化铵至十六烷基三甲基溴化铵的终浓度为0.5％(mg/ml)，充分搅拌后，静置沉淀12小时后于10000r/min、23℃条件下离心30min，收集沉淀；
(4)沉淀用浓度为0.05mol/L的MgCl2溶液溶解，于10000r/min、8℃条件下离心45min收集上清，并进行澄清过滤得滤液；
(5)滤液用孔径为30KD超滤膜超滤浓缩，获得超滤浓缩液2，超滤浓缩所用的注射用水体积为上清液体积的7倍；
(6)超滤浓缩液2于-40℃条件下冷冻干燥，即为纯化的A群脑膜炎双球菌荚膜多糖。
二、A群脑膜炎双球菌荚膜多糖的检测
其中蛋白含量的检测依据《中国药典》2010版三部(附录ⅥB第二法)进行；核酸含量的检测依据《中国药典》2010版三部(附录ⅡA)进行；O-乙酰基含量的检测依据《中国药典》2010版三部(附录ⅥF)进行；磷含量的检测依据《中国药典》2010版三部(附录ⅦA)进行；荚膜多糖分子大小的检测依据《中国药典》2010版三部(附录ⅧG)进行；内毒素含量的检测依据《中国药典》2010版三部(附录ⅫE)进行；鉴别试验依据《中国药典》2010版三部(附录ⅧC)进行，其结果见表3。
表3 MenA荚膜多糖检测指标
实施例4 b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的纯化
一、b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的纯化
(1)将b型流感嗜血杆菌荚膜多糖粗制品用注射用水溶解至b型流感嗜血杆菌荚膜多糖粗制品终浓度为15mg/ml，再加入CaCl2和乙醇，使CaCl2的终浓度为0.3mol/L，乙醇的终浓度为30％(ml/ml)，充分搅拌后，静置沉淀8小时后于10000r/min、8℃条件下离心60min，收集上清；
(2)上清液用孔径为50KD超滤膜超滤，获得超滤浓缩液1，超滤所用的注射用水体积为上清液体积的15倍；
(3)向超滤浓缩1中加入十六烷基三甲基溴化铵至十六烷基三甲基溴化铵的终浓度为2％(g/ml)，充分搅拌后，静置沉淀8小时后于10000r/min、23℃条件下离心30min，收集沉淀；
(4)沉淀用浓度为0.1mol/L的NaCl溶液溶解，于10000r/min、8℃条件下离心45min收集上清，并进行澄清过滤得滤液；
(5)滤液用孔径为50KD超滤膜超滤浓缩，获得超滤浓缩液2，超滤浓缩所用的注射用水体积为上清液体积的7倍；
(6)超滤浓缩液2于-40℃条件下冷冻干燥，即为纯化的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖。
二、b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的检测
其中蛋白含量的检测依据《中国药典》2010版三部(附录ⅥB第二法)进行；核酸含量的检测依据《中国药典》2010版三部(附录ⅡA)进行；磷含量的检测依据《中国药典》2010版三部(附录ⅦA)进行；核糖含量的检测依据《中国药典》2010版三部(附录ⅧJ)进行；荚膜多糖分子大小的检测依据《中国药典》2010版三部(附录ⅧG)进行；内毒素含量的检测依据《中国药典》2010版三部(附录ⅫE)进行；鉴别试验依据《中国药典》2010版三部(附录ⅧC)进行，其结果见表4。
表4 Hib荚膜多糖检测指标
实施例5 伤寒Vi荚膜多糖的纯化
一、伤寒Vi荚膜多糖的纯化
(1)将伤寒Vi荚膜多糖粗制品用注射用水溶解至伤寒Vi荚膜多糖粗制品终浓度为5mg/ml，再加入CaCl2和乙醇，使CaCl2的终浓度为0.3mol/L，乙醇的终浓度为30％(ml/ml)，充分搅拌后，静置沉淀6小时后离心于10000r/min、8℃条件下离心60min，收集上清；
(2)上清液用孔径为为50KD超滤器超滤，获得超滤浓缩液1，超滤所用的注射用水体积为上清液体积的15倍；
(3)向超滤浓缩1中加入十六烷基三甲基溴化铵至十六烷基三甲基溴化铵的终浓度为2％(g/ml)，充分搅拌后，静置沉淀6小时后离心于10000r/min、23℃条件下离心30min，收集沉淀；
(4)沉淀用浓度为0.2mol/L的NaCl溶液溶解，于10000r/min、8℃条件下离心45min收集上清，并进行澄清过滤得滤液；
(5)滤液用孔径为50KD超滤器超滤浓缩，获得超滤浓缩液2，超滤浓缩所用的注射用水体积为上清液体积的7倍；
(6)超滤浓缩液2于-40℃条件下冷冻干燥，即为纯化的伤寒Vi荚膜多糖。
二、伤寒Vi荚膜多糖的检测
其中蛋白含量的检测依据《中国药典》2010版三部(附录ⅥB第二法)进行；核酸含量的检测依据《中国药典》2010版三部(附录ⅡA)进行；O-乙酰基含量的检测依据《中国药典》2010版三部(附录ⅥF)进行；荚膜多糖分子大小的检测依据《中国药典》2010版三部(附录ⅧH)进行；内毒素含量的检测依据《中国药典》2010版三部(附录ⅫE)进行；鉴别试验依据《中国药典》2010版三部(附录ⅧC)进行，其结果见表5。
表5 STVi荚膜多糖检测指标
Claims (5)
1.一种荚膜多糖的纯化方法，其特征在于：
(1)将荚膜多糖粗制品用注射用水溶解至荚膜多糖粗制品的终浓度为2～20mg/ml，再加入CaCl2和乙醇，使CaCl2的终浓度为0.3～0.8mol/L，乙醇的终浓度为20～35％(ml/ml)，充分搅拌后，静置沉淀6～12小时后离心，收集上清；
(2)上清液用孔径为10～100KD膜超滤，得超滤浓缩液1，超滤所用的注射用水体积为上清液体积的10～20倍；
(3)向超滤浓缩液1中加入十六烷基三甲基溴化铵至十六烷基三甲基溴化铵的终浓度为0.5～5％(g/ml)，充分搅拌后，静置沉淀6～12小时后离心，收集沉淀；
(4)沉淀用浓度为0.05～0.5mol/L盐溶液溶解，离心收集上清，并进行澄清过滤得滤液；
(5)滤液用孔径为10～100KD膜超滤浓缩，得超滤浓缩液2，超滤浓缩所用的注射用水体积为上清液体积的5～10倍；
(6)超滤浓缩液2经冷冻干燥，即为纯化的荚膜多糖。
2.根据权利要求1所述的一种荚膜多糖的纯化方法，其特征在于：所述的荚膜多糖为细菌荚膜多糖包括但不限于以下任意一种：肺炎球菌荚膜多糖、脑膜炎双球菌荚膜多糖、b型流感嗜血杆菌荚膜多糖、伤寒Vi荚膜多糖。
3.根据权利要求1或2所述的一种荚膜多糖的纯化方法，其特征在于：步骤(2)所用的膜包括但不限于以下任意一种：超滤膜、中空纤维滤膜。
4.根据权利要求1或2所述的一种荚膜多糖的纯化方法，其特征在于：步骤(5)所用的膜包括但不限于以下任意一种：超滤膜、空纤维滤膜。
5.根据权利要求1或2所述的一种荚膜多糖的纯化方法，其特征在于：步骤(4)所述的盐包括但不限于以下任意一种：NaCl、CaCl2、MgCl2。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150506 |