CN110831980A

CN110831980A - 用于从细菌荚膜多糖基制剂中去除杂质的方法

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Publication number: CN110831980A
Application number: CN201880045050.8A
Authority: CN
Inventors: 拉杰夫·马拉萨坎特·迪希尔; 桑巴吉·尚卡尔·皮萨尔; 塔特瑞亚·萨尔马·安南拉留
Original assignee: Serum Institute of India Pvt Ltd
Current assignee: Serum Institute of India Pvt Ltd
Priority date: 2017-05-05
Filing date: 2018-05-03
Publication date: 2020-02-21
Anticipated expiration: 2038-05-03
Also published as: AU2018262438B2; US11739356B2; AU2018262438A1; GEP20227408B; MD20190088A2; BR112019022868A2; EP3619241A1; JP7319929B2; CN110831980B; JP2023017929A; JP2020518707A; EA201992636A1; CU20190090A7; UA125937C2; US20200190549A1; KR20200015524A; CA3062399A1; US20240026405A1; KR102565771B1; WO2018203268A1

Abstract

本发明涉及用于对细菌荚膜多糖、更具体地革兰氏阴性细菌的荚膜多糖进行纯化的改进方法。该方法包括：对收获物进行浓缩并渗滤，用阴离子去污剂和强碱进行处理，然后离心、渗滤、和基于阳离子去污剂的细菌多糖沉淀。该方法促成内毒素杂质、蛋白质杂质和核酸杂质的显著减少，从而以所需的O‑乙酰基水平提供了荚膜多糖的更高回收率。该方法是可扩展的和非酶促的，并且采用了较少的纯化步骤。

Description

用于从细菌荚膜多糖基制剂中去除杂质的方法

技术领域

本发明广泛地属于生物技术领域，并且具体地涉及用于对细菌荚膜多糖进行纯化的收获和下游加工。

背景技术

脑膜炎奈瑟氏球菌是造成大脑和脊髓周围的膜(脑膜)和脑脊液(CSF)感染的主要原因，从而导致世界范围内的死亡和残疾。

脑膜炎奈瑟氏球菌，也称为脑膜炎球菌，是一种革兰氏阴性细菌。根据多糖荚膜的结构，已鉴定出脑膜炎奈瑟氏球菌的13个血清组，其中6个血清组(A、B、C、W、X和Y)有可能引起流行病(参考：Lee Harrison等，2011)。

脑膜炎在世界各地以小群形式发生，其中季节性流行是由于流行性细菌性脑膜炎的比例不同而引起的。脑膜炎球菌病的最大负担出现在非洲大陆、尤其是撒哈拉以南的非洲地区，这些地区也被称为脑膜炎带。据“疾病控制和预防中心(CDC)”和“世界卫生组织”估计，2000年全球脑膜炎球菌病导致171,000人死亡。此外，CDC报道证实了在美国儿童和年轻人中脑膜炎奈瑟氏球菌的出现是脑膜炎和败血病的主要原因。因此，脑膜炎奈瑟氏球菌在发达国家和发展中国家都继续是公共健康问题。

在1996年-1997年，据报道：由脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A引起的流行病导致了超过250,000例疾病和超过25,000例死亡，从而敦促世界卫生界承诺开发一种可消除非洲A群脑膜炎球菌流行病的疫苗。

在2010年，在非洲大陆成功引入了脑膜炎球菌A多糖结合疫苗，即Menafrivac，从而促使由脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A引起的流行病几乎消失。随着脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的影响力逐渐减弱，其他脑膜炎球菌血清组比如脑膜炎球菌血清组-C、脑膜炎球菌血清组-W、脑膜炎球菌血清组-X和脑膜炎球菌血清组-Y的影响力呈上升趋势。为了对抗这种戏剧性的效果，已经开发并销售了包含上述血清组的各种单价和多价疫苗。尽管自2005年以来，多价A、C、Y和W结合疫苗

已被批准用于加拿大、美国和欧洲的儿童和成人，但是由于结合疫苗在市场上以非常高的价格出售，因此对于世界其他地区而言是无法承受的。

血清组A荚膜由O-乙酰化(α1-6)链接的N-乙酰基甘露糖胺-1-磷酸的重复单元构成。来自血清组B、血清组C、血清组W和血清组Y的荚膜多糖由唾液酸衍生物构成，血清组B和血清组C表达(α2→8)链接的和(α2→9)链接的唾液酸均聚物，并且血清组W和血清组Y表达d-半乳糖或d-葡萄糖和唾液酸的交替序列。发酵液中的污染物与存在于荚膜多糖上的重复部分以不同的方式相互作用。因此，需要一种利用这些差异来对来自不同血清组的不同细菌荚膜多糖进行分离的方法。

根据世界卫生组织关于脑膜炎球菌结合疫苗的技术报告系列可知分离的多糖应当符合以下规格。

表1

疫苗中使用的细菌荚膜PS的经典纯化方法包括用乙醇和/或阳离子去污剂进行若干种选择性沉淀，然后连续离心、超离心和用苯酚脱蛋白。

Gotschlich等人(1969年)发表了对来自血清组A、血清组B和血清组C的脑膜炎奈瑟氏球菌多糖进行分离的最早文献。Gotschlich等人使用阳离子去污剂十六华隆(十六烷基三甲基溴化铵)从整个培养物中快速沉淀带负电荷的多糖，然后使用0.9M CaCl2的萃取和离心作用将去污剂-多糖复合物解离，使用乙醇沉淀技术去除核酸，然而通过使用乙酸钠对多糖进行处理并且然后用含氯仿的丁醇均质化由此去除了蛋白质，但据报道，还可以选择使用热酚-水混合物。最终的纯化方法是用乙醇(4倍-5倍)和丙酮来沉淀多糖。该方法涉及氯仿使用不便和乙醇用量大。(参考：T.P.Pato，硕士学位论文，里约热内卢联邦大学，里约热内卢，2003年，第95页。)

Tanizaki等人报道了脑膜炎奈瑟氏球菌C多糖的纯化方法，其中，使用蛋白酶K、那加酶和胰蛋白酶的混合物将酚提取用蛋白酶消化代替；中空纤维100kDa截留物中的切向超滤代替超速离心；然后使用100kDa截留膜在含有0.5％脱氧胆酸盐的20mM Tris-HCl缓冲液中进行大量渗滤，以消除低分子量蛋白质和脂多糖(LPS)。尽管使用了上述改进，分离的多糖制品仍含有值为2％(w/w)的蛋白质和值为1.5％(w/w)的核酸值。[参考：Tanizaki等人；微生物学方法杂志，第27卷，第1期，1996年9月，第19页-23页和Goncalves等人，2007年；Formatex；在应用的微生物学中传达当前的研究和教育主题及趋势]。

TP Pato等人(2006)公开了一种脑膜炎奈瑟氏球菌C多糖的改进的纯化方法，该方法包括：对培养物进行连续流式离心以去除细胞；通过切向过滤(截止值为100kDa)浓缩上清液；加入0.5％DOC，在30分钟内加热至55℃，并且进行切向过滤(截止值为100kDa)；阴离子交换色谱法(源15Q)和尺寸排阻色谱法(Sepharose CL-4B)。[参考：T.P.Pato等人/J.Chromatogr.B 832(2006年)第262页–第267页]。

US7491517B2公开了一种CTAB、乙醇、蛋白酶K、活性炭和凝胶过滤在纯化脑膜炎奈瑟氏球菌C多糖期间去除杂质的用途。然而，该多步骤方法导致多糖回收率的损失，并且所使用的活性炭可能会引起不期望的可浸出物。

WO2017006349公开了一种使用乙酸锌/硫酸铵/柠檬酸钠从脑膜炎奈瑟氏球菌收获的提取物中去除蛋白质污染物的用途。还公开了一种使用酶如苯并酶、蛋白酶K或Nargase来降解残留的蛋白质和/或核酸材料并且然后进行色谱纯化的用途。

WO2015128798A1公开了一种用于从脑膜炎奈瑟氏球菌C多糖中去除杂质的方法。所述方法采用了：在阴离子去污剂如脱氧胆酸钠或HEPES的存在下于50℃-60℃进行孵育，使用0.5M至1.5M NaOH在50℃将粗制多糖脱乙酰化30分钟至10小时，并且通过渗滤和疏水性相互作用色谱法(HIC)进行进一步纯化。

Tian等人公开了一种用于对脑膜炎奈瑟氏球菌C、W和Y型血清组多糖进行纯化的方法，该方法包括使用CTAB、乙醇、DOC、Capto粘附(多模式阴离子交换色谱法)、Capto DEAE(弱阴离子)和Sephadex G25，其中，内毒素含量低于25EU/mg，蛋白质含量低于10mg/g，核酸含量在1mg/g至7mg/g之间[参考：Tian等人，2013年，通用电气医疗集团；应用笔记，29216880AA]。

Gotschlich程序是多步骤的过程，从而导致产物回收率的大量损失，即损失约37％。此外，使用诸如苯酚的化学物质会导致多糖或蛋白质载体的不期望的结构变化，并且还导致不期望的酚类有毒废物。

US7491517B2、WO2017006349和TP Pato等人(2006)的方法利用了有助于降解蛋白质和核酸污染物的酶，然而酶和水解物质的去除是艰巨的任务，并且可能会导致目标产物的损失。此外，由于存在病毒污染的风险，因此监管机构限制了动物酶在人类产品中的使用。除了成本高的事实之外，酶的使用还将在cGMP框架中引入了更多的监管问题，例如酶的来源(来自动物或重组体)、不同厂商与批次之间的酶活性变化等。

WO2017006349和US4686102A公开了一种硫酸铵用于沉淀蛋白质和核酸污染物的用途。然而，有时硫酸铵也会沉淀荚膜多糖，由此导致总多糖损失。

脱氧胆酸钠(DOC)是温和的去污剂，并且是多糖纯化中最常用的去污剂之一。具有核心甾体结构的脱氧胆酸钠变性程度较低并且其溶解强度有限，它可以在不影响化学结构的情况下破坏内毒素。因此，在去除脱氧胆酸钠之后，内毒素恢复了其生物学活性。此外，基于DOC的方法不能有效地从多糖、尤其是含唾液酸的多糖中去除污染物。这可能是由于DOC对下游加工期间形成的脂多糖-蛋白质结合的去污活性弱，从而导致最终分离的多糖中内毒素和蛋白质含量较高。此外，脱氧胆酸钠是一种动物源性产品，即使其在最终产品中的残留存在也可能会导致监管机构和某些宗教团体对该产品的不认可。

诸如尺寸排阻色谱、离子交换色谱和疏水相互作用色谱之类的色谱技术已成功地用于分离细菌多糖并有效去除蛋白质和核酸污染物。尽管已成功分离出符合WHO规格的细菌多糖，但色谱技术的使用仍涉及多步劳动和耗时的样品制备，涉及规模性问题，极大地损害了荚膜多糖的回收率，并且因此对于工业规模的下游加工而言不是可行的低成本选择。

生物制剂的下游加工是总生产成本的20％-80％的根本原因(Ansejo和Patrick，1990年)，新的下游策略的开发对于降低生产成本并允许由公共健康系统将疫苗分配给整个群体是必要的。

目前，用于获得纯化形式的多糖的方法包括去污剂处理以及使用有机溶剂比如乙醇对收获液进行差异沉淀的几个步骤。

然而，以下两个主要限制因素迫使寻找替代性的纯化方法。

目前，作为去除杂质(蛋白质、核酸和内毒素)的初始步骤，使用了阴离子去氧胆酸钠(DOC)。DOC是具有核心类固醇结构的动物来源的胆汁清洁剂。DOC因其庞大的结构而具有有限的溶解强度和对生物大分子的较弱变性的能力。另外，DOC的具有必需的法规认证的稳定供应限于单个厂商/供应商。

乙醇的高消耗和多余步骤(碳过滤)的加入使该过程繁琐、耗时且昂贵。

仍然强烈需要替代的、简单的、可扩展的、成本有效的方法来纯化细菌多糖以获得更高的多糖回收率。本发明提供了一种用于分离细菌荚膜多糖的稳健且负担得起的下游纯化方法，其中，所述方法导致内毒素杂质、蛋白质杂质和核酸杂质的显著减少，从而使得能够根据WHO规范实现多糖的更高回收率以及维持所需的O-乙酰基水平。

发明内容

本发明涉及用于细菌荚膜多糖、更具体地脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖的替代性纯化方法。

该方法包括通过100kD切向流过滤对收获物进行浓缩和渗滤，然后加入阴离子去污剂和强碱以使蛋白质、核酸和脂多糖变性。稍后将生物提取物进行离心、渗滤、和基于CTAB的细菌多糖沉淀。该方法提高了多糖的回收率，是可扩展的和非酶促的，采用了低成本和较少数量的纯化步骤。所述方法促成内毒素杂质、蛋白质杂质和核酸杂质的显著减少，从而实现了多糖的更高回收率并且保持所需的O-乙酰基水平。

附图说明

i.图1：脑膜炎奈瑟氏球菌血清组-C多糖的NMR光谱

ii.图2：脑膜炎奈瑟氏球菌血清组-Y多糖的NMR光谱

iii.图3：脑膜炎奈瑟氏球菌血清组-W多糖的NMR光谱

iv.图4：脑膜炎奈瑟氏球菌血清组-A多糖的NMR光谱

v.图5：脑膜炎奈瑟氏球菌血清组-X多糖的NMR光谱。

具体实施方式

根据本发明的总的方面，目的细菌血清组之一在合适的培养基中生长并且使用甲醛或现有技术中任何通常已知的方法灭活；进一步进行下游加工以对纯化的荚膜多糖进行分离。本发明的用于对荚膜多糖进行分离的目的细菌是从革兰氏阴性细菌中获得的，所述革兰氏阴性细菌选自包括但不限于埃希氏菌、奈瑟氏球菌、嗜血杆菌、假单胞菌等的属，更优选地由脑膜炎奈瑟氏球菌血清组表达的荚膜多糖。在本发明的另一方面，多糖可以来源于包括下述各者的组：所述各者为幽门螺杆菌、肺炎衣原体、沙眼衣原体、解脲脲原体、肺炎支原体、葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、A组链球菌、B组链球菌、Ib、II、III、V、VI或VIII；C组链球菌、化脓性链球菌、无乳链球菌、失乳链球菌、肺炎链球菌、绿链球菌、粪肠球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、淋病奈瑟氏球菌、伤寒杆菌、炭疽杆菌、沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、巴斯德氏杆菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲菌、梭状芽孢杆菌、艰难梭菌、分枝杆菌属、结核分枝杆菌、梅毒螺旋体、鲍氏疏螺旋体、伯氏疏螺旋体、钩端螺旋体、杜氏嗜血杆菌、白喉棒杆菌、百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌、支气管败血博德特氏菌、流感嗜血杆菌、大肠埃希菌、志贺氏菌、埃里希氏菌和立克次氏体；肺炎链球菌1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9A、9F、9N、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、15C、17F、18C、19F、19A、20、22F、23B、23F、24F、33F、35B、38和45型的多糖；脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A、B、C、D、W135、X、Y、Z、29E的多糖；以及b型流感嗜血杆菌。

实验期间使用的生物材料如下：

多糖分离自：

表2

生物名称	菌株名称	菌株源
			脑膜炎奈瑟氏球菌A	M1027	SynCo生物伙伴(荷兰)
脑膜炎奈瑟氏球菌C	C11(60E)	CBER/FDA，美国
			脑膜炎奈瑟氏球菌W	S877	CBER/FDA，美国
脑膜炎奈瑟氏球菌Y	M10659	CDC，美国
			脑膜炎奈瑟氏球菌X	M8210	CBER/FDA，美国

未结合的载体蛋白，即，CRM197或TT.CRM197来源于美国Pfenex公司的荧光假单胞菌的重组菌株CS463-003(MB101)。TT来源于获自印度、喜马偕尔邦、卡索利，国家控制局，的CRI的破伤风梭状芽胞杆菌(Harvard号49205)。CRI从荷兰NVI获得了该菌株。

根据本发明的第一实施方式，使用离心从失活的收获物中分离纯化细菌荚膜多糖。用100kD切向流过滤单元对上清液进行渗滤。本领域技术人员非常清楚的是，可以使用任何其他合适的方法代替离心和渗滤来浓缩细菌荚膜多糖。在该实施方式的优选方面之一中，荚膜多糖来源于脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A、C、W、Y和X。

根据本发明的第二实施方式，将第一实施方式中获得的渗余物用阴离子表面活性剂/去污剂进行处理。阴离子去污剂选自包括下述各者的组：所述各者为烷基硫酸盐、十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠、十二烷基磺酸钠、s-烷基硫酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠、油基硫酸钠、N-油基聚(氨基酸)钠、烷基苯磺酸钠、α-烯烃磺酸钠、烷基磺酸钠、α-磺基单羧酸酯、脂肪酸磺基烷基酯、琥珀酸酯磺酸盐、烷基萘磺酸盐、烷烃磺酸钠、木质素磺酸钠和烷基甘油醚磺酸钠。

优选地，所述阴离子表面活性剂为烷基硫酸盐，更优选地，向渗余物中加入终浓度在0.1％至4％的范围内，更优选地为1％的十二烷基硫酸钠并且在室温下搅拌2小时。SDS的两亲性质使其成为不仅可以破坏蛋白质而且可以使其溶解的强离液剂。

在第二实施方式的另一方面，失活的收获物可以直接用阴离子表面活性剂处理，并且进一步进行荚膜多糖的浓缩，促成杂质的充分减少，从而使得使用阳离子去污剂的后续步骤是非必要的。

根据本发明的第三实施方式，向由上述实施方式获得的混合物中加入强碱，并且在室温下持续搅拌1小时将强碱的pH调节至在pH9至pH11之间。所述强碱选自包括氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、羟胺、三乙胺和氢氧化锂的组。

根据本发明的第三实施方式的优选方面，向由上述实施方式获得的混合物中加入终浓度在5M至20M之间的所述强碱即氢氧化钠，并且在室温下持续搅拌1小时将所述强碱即氢氧化钠的pH调节至pH10.5。

在本发明的第三实施方式的另一方面，替代性地，向由第二实施方式获得的混合物中加入EDTA和乙酸钠代替加入碱，在室温下持续搅拌1小时。

根据本发明的第四实施方式，通过加入温和有机酸来中和(pH7.0)从上述实施方式获得的溶液。所述温和有机酸是包括甲酸、乙酸、丙酸、草酸等的一种或更多种酸的组合。向该中和的混合物中加入亲水性醇、优选地乙醇直至终浓度为30％-35％，并且在室温下持续搅拌进行孵育数小时。亲水性醇选自下述各者中的一者或者选自下述各者中的两者或更多者的组合：所述各者为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丙酮和叔丁醇；其浓度为<65％或>95％。

根据本发明的第五实施方式，将过量的阴离子去污剂从溶液中去除。对从上述实施方式获得的溶液进行离心并且收集上清液。将0.1M钾盐与上清液混合，并且在溶解之后将混合物在2℃-8℃下孵育持续>3小时。钾盐选自下述各者中的一者或者选自下述各者中的两者或更多者的组合：所述各者为氯化钾、乙酸钾、硫酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾、磷酸钾、磷酸氢钾、磷酸二氢钾、硝酸钾和其他钾盐。该步骤利用了十二烷基硫酸钾的低溶解度。在加入钾盐优选地为KCl之后，溶液中的SDS被转化为十二烷基硫酸钾，其溶解度较低并且易于沉淀出来，从而促成SDS被完全去除。本领域技术人员非常清楚的是，可以改变KCl的浓度以获得期望的结果。本领域技术人员可以根据需要对本发明的该实施方式中提到的协议进行修改。

在第五实施方式的另一方面，可以使用凝胶过滤、乙醇沉淀和离子交换树脂/Amberlite柱将过量的阴离子去污剂从溶液中去除。

根据本发明的第六实施方式，将从上述实施方式中获得的溶液进行离心并且收集上清液。使上清液穿过0.2μ过滤器，并且通过100kDa切向流过滤对渗余物进行渗滤。

根据本发明的第七实施方式，使用终浓度为25mM的Tris-HCl缓冲液对从上述实施方式获得的渗余物进行渗滤。随后加入阳离子去污剂直至终浓度为1％-2％，并且在室温持续搅拌进行孵育1小时。阳离子去污剂选自下述各者中的一者或者选自下述各者中的两者或更多者的组合：所述各者为十六烷基三甲基铵盐、四丁基铵盐、十四烷基三甲基铵盐、和溴化己二甲铵。本领域技术人员非常清楚的是，阳离子去污剂的浓度可以在0.1％至4％的范围内变化以获得期望的结果。优选地，阳离子去污剂是CTAB。

根据本发明的第八实施方式，可以将从上述实施方式中获得的溶液进行离心，并且收集沉淀的CTAB-多糖并将其溶解于30％-64％的乙醇中。可以将溶解的混合物进一步离心以去除未溶解的残留物。

根据本发明的第九实施方式，在持续搅拌下，向从上述实施方式获得的上清液中加入NaCl直至终浓度为0.1M。收集沉淀的多糖并将其溶解于1M NaCl中，并且随后进行醇沉淀(30％-64％)。

根据本发明的第十实施方式，将从上述实施方式获得的溶液使用100kDa切向流过滤通过WFI(注射用水)进行充分渗滤，并且穿过0.2μ过滤器，并且在-20℃或-20℃以下作为最终批量存储。

根据本发明的第十一实施方式，按照下述步骤获得脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C、W和Y的纯化的荚膜多糖，所述步骤为：

·使脑膜炎奈瑟氏球菌的血清组C、W和Y分别在合适的培养基中生长，并且使用甲醛使其灭活。

·向该灭活的收获物加入十二烷基硫酸钠加直至终浓度为1％，并且在室温下搅拌2小时。

·加入氢氧化钠直至终浓度为05mM-20mM，并且在室温下持续搅拌1小时将其pH调节至pH10.5。

·通过加入温和有机酸，即，乙酸来中和从上述步骤中获得的溶液。

·向该中和的溶液中加入乙醇至终浓度为30％-35％，并且在持续搅拌下孵育数小时。

·将从上述步骤中获得的溶液离心，并且收集上清液。

·向上清液中加入0.1M KCL，并且在2℃-8℃孵育不少于3小时。

·将从上述步骤中获得的溶液进行离心，并且收集上清液。使上清液穿过0.2μ过滤器，并且使用Tris-HCl缓冲液通过100kDa MWCO过滤器切向流过滤对渗余物进行渗滤。

·向从上述步骤中获得的渗余物中加入Tris-HCl缓冲液直至终浓度为25mM；再加入CTAB直至终浓度为2％；并且在室温下孵育不少于1小时。

·将从上述步骤中获得的溶液离心，收集沉淀，并且将其溶解于30％-64％的乙醇中。将溶解的混合物进一步进行离心以去除未溶解的残余物。

·向上述步骤中获得的上清液中加入NaCl直至终浓度为0.1M–0.3M。将沉淀的PS溶解于1M NaCl中，然后进行30％-64％的乙醇沉淀。

·将从上述步骤中获得的溶液使用100kDa切向流过滤通过WFI进行充分渗滤，并且穿过0.2μ过滤器，并且在-20℃下作为最终批量存储。

根据本发明的第十二实施方式，提供了一种如第十一实施方式中提到的纯化方法：

·脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C多糖的回收率在60％至80％之间，其中，内毒素含量小于50EU/mg，蛋白质含量小于0.50％，并且核酸含量小于0.20％。

·脑膜炎奈瑟氏球菌血清组Y多糖的回收率在60％至80％之间，其中，内毒素含量小于50EU/mg，蛋白质含量小于0.50％，并且核酸含量小于0.30％。

·脑膜炎奈瑟氏球菌血清组W多糖的回收率在60％至80％之间，其中，内毒素含量小于50EU/mg，蛋白质含量小于0.5％，核酸含量小于0.2％。

根据本发明的第十三实施方式，按照下述步骤获得脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A和X的纯化的荚膜多糖：

·使脑膜炎奈瑟氏球菌的血清组A和X分别在合适的培养基中生长，并且使用甲醛使其灭活；

·向该灭活的收获物中加入十二烷基硫酸钠直至其终浓度为1％，并且在室温下搅拌2小时。

·向该灭活的收获物中加入EDTA和乙酸钠直至其终浓度为1％，并且在室温下搅拌2小时。

·加入乙醇直至终浓度为30％-35％，并且在持续搅拌下孵育几个小时。

·将从上述步骤中获得的溶液离心，并且收集上清液。

·向上清液中加入0.1M KCL，并且在2℃-8℃下孵育>3小时。

·将从上述步骤中获得的溶液进行离心，并且收集上清液。使上清液通过0.2μ过滤器，并且使用25mM Tris-HCl通过100kDa MWCO切向流过滤对渗余物进行浓缩和渗滤。

·加入CTAB直至终浓度为1％-2％，并且在室温下孵育不少于1小时。

·将从上述步骤中获得的溶液使用100kDa切向流过滤通过WFI进行充分渗滤，并且穿过0.2μ过滤器，并且在-20℃或-20℃以下作为最终批量存储。

根据本发明的第十四实施方式，提供了一种如第十三实施方式中提到的纯化方法：

·脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A多糖的回收率在60％-80％之间，其中，内毒素含量小于50EU/mg，蛋白质含量小于0.50％，核酸含量小于0.20％。

·脑膜炎奈瑟氏球菌血清组X多糖的回收率在60％-80％之间，其中，内毒素含量小于50EU/mg，蛋白质含量小于0.50％，并且核酸含量小于0.30％。

根据本发明的第十五实施方式，所述纯化多糖与载体蛋白缀合。本领域技术人员非常清楚的是，用于与多糖结合的载体蛋白可以是根据需要的本领域已知的任何载体蛋白。非特异性载体蛋白的示例包括来自但不限于下述各者的组的载体蛋白：所述各者为CRM197、白喉类毒素、破伤风类毒素、百日咳类毒素、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST、铜绿假单胞菌的外毒素A、外膜复合物c(OMPC)、孔蛋白、转铁蛋白结合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌粘附蛋白(PsaA)、肺炎球菌表面蛋白BVH-3和BVH-11、炭疽芽孢杆菌的保护性抗原(PA)、排毒杆菌的解毒浮肿因子(EF)、炭疽杆菌的致死因子(LF)、卵清蛋白、匙孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、以及结核菌素(PPD)的纯化蛋白衍生物。

在第十五实施方式的另一方面，在缀合之前，通过化学或机械手段对通过本方法纯化多糖进行分级，所述化学或机械手段包括但不限于超声处理、微波、臭氧分解、电离辐射、高压细胞破碎、均质器、微流化剂、乙酸钠、钠偏高碘酸盐、真空加热等。

在第十五实施方式的另一方面，通过本发明的方法纯化多糖可以通过使用还原胺化、氰基化、碳二亚胺共轭化学而与载体蛋白缀合。

根据本发明的第十六实施方式，制备了一种免疫原性组合物。该组合物包括：

(a)(i)脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的荚膜糖与(ii)破伤风类毒素的缀合物；

(b)(i)脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖与(ii)CRM197的缀合物；

(c)(i)脑膜炎奈瑟氏球菌血清组Y的荚膜糖与(ii)CRM 197的缀合物；

(d)(i)脑膜炎奈瑟氏球菌血清组W135的荚膜糖与(ii)CRM197的缀合物；以及

(e)(i)脑膜炎奈瑟氏球菌血清组X的荚膜糖与(ii)破伤风类毒素的缀合物。

根据本发明的第十七实施方式，内毒素含量可以通过“通过动力学浊度测定法(KTA)进行细菌内毒素测试”或兔热原性测试来测定；蛋白质含量可以通过Lowry方法来测定；并且核酸含量可以通过分光光度法来测定。众所周知，任何其他合适的方法都可以用于内毒素、蛋白质和核酸含量的定量。

在第十七实施方式的另一方面，可以使用尺寸排阻高效液相色谱法完成脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A、C、W、Y和X的纯化多糖的分子大小分布。

在第十六实施方式的另一方面，可以使用比色Hestrin测定法测定O乙酰基含量。

示例

示例1：细菌多糖的生产(脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的上游加工)

使用下面提到的发酵工艺生产多糖。

发酵规模：300升

·进行了发酵罐的原位清洗(CIP)、保压测试和原位灭菌(SIP)。

·SIP完成之后，将无菌发酵培养基无菌地转移至发酵罐。

·组合物培养基

血清组C发酵培养基

表3

成分	量(g/L)
		D–水合葡萄糖	10
氯化钠	5.8
		L-精氨酸	1
L-丝氨酸	1
		氯化钙	0.028
硫酸铁(II)水合物	0.01
		氯化铵	0.3
磷酸氢二钾	4
		酵母抽提物	5
氯化镁	0.4
		大豆蛋白胨	3
酪蛋白氨基酸	5
		L-谷氨酸钠一水合物	10
硫酸铵	1.2
		胱氨酸	0.3

血清组C进料培养基

表4

成分	量(g/L)
		D–水合葡萄糖	200
L-谷氨酸钠一水合物	150
		酪蛋白氨基酸	4
氯化铵	0.2

·将溶解氧水平调节至所需水平。

·在发酵培养基中接种培养生物。发酵罐在喂料分批模式下运行11小时至14小时。

·培养物在590nm处达到所需的OD之后，使用甲醛对发酵罐中的培养物进行灭活。

·孵育完成之后，将温度设置为10℃±5℃，然后通过离心来分离细胞。

·收集上清液并进行深度过滤；分离纯化的收获物用0.2μ过滤器过滤并转移纯化。

结果

表5

参数	脑膜炎奈瑟氏球菌血清组-C
		收获的总多糖产量(mg/L)	703.33
内毒素杂质(多糖的EU/mg)	>500
		蛋白质杂质(％)	109
核酸杂质(％)	12.3

示例2：荚膜多糖的生产(脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A、W、X和Y的上游加工)

使用示例1中提到的方案生产脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A、W、X和Y的荚膜多糖。

血清组Y发酵培养基

表6

成分	量(g/L)
		D–水合葡萄糖	10
氯化钠	5.8
		硫酸钾	1
L-精氨酸	0.75
		L-丝氨酸	0.75
半胱氨酸	0.4
		氯化钙	0.025
硫酸铁(II)水合物	0.01
		氯化铵	0.15
磷酸氢二钾	4
		酵母抽提物	3
氯化镁	0.3
		大豆蛋白胨	3
酪蛋白氨基酸	5
		盐酸硫胺素	0.05
L-谷氨酸钠一水合物	10
		L-色氨酸	0.2

血清组Y进料培养基

表7

成分	量(g/L)
		D–水合葡萄糖	200
L-谷氨酸钠一水合物	150
		L-精氨酸	1
L-丝氨酸	1
		大豆蛋白胨	10
酵母抽提物	16.6

血清组W发酵培养基

表8

成分	量(g/L)
		D–水合葡萄糖	10
氯化钠	5.8
		硫酸钾	1
L-精氨酸	0.75
		L-丝氨酸	0.75
半胱氨酸	0.4
		氯化钙	0.025
硫酸铁(II)水合物	0.01
		氯化铵	0.25
磷酸氢二钾	4
		酵母抽提物	3
氯化镁	0.3
		大豆蛋白胨	3
酪蛋白氨基酸	5
		盐酸硫胺素	0.05
L-谷氨酸钠一水合物	10

血清组W进料培养基

表9

成分	量(g/L)
		D–水合葡萄糖	200
L-谷氨酸钠一水合物	150
		L-精氨酸	4
L-丝氨酸	4
		大豆蛋白胨	4
酵母抽提物	4
		氯化镁	1.6
氯化钙	0.2
		氯化铵	0.8

结果：

表10

观察到经测试获得的分离纯化收获物的PS(多糖)含量为1gm/l-6gm/l。将该分离纯化的收获物进行进一步纯化。

示例3：使用SDS对荚膜多糖进行纯化(脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的下游加工)，然后进行醇沉淀。

将根据示例1获得的粗制多糖与不同浓度的SDS混合。然后加入乙醇直至终浓度比多糖开始沉淀的终浓度低约10％为止。将其进一步过滤。

所测试的SDS浓度为0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％和10％。

上述所有浓度的SDS均显示出杂质减少的功效。SDS高于4％时，没有观察到杂质分布的明显差异。

在1％SDS下观察到最佳的杂质、尤其是蛋白质杂质的减少。

纯化多糖的内毒素杂质含量>多糖的100EU/μg，而WHO限值<多糖的100EU/μg。

示例4：荚膜多糖的纯化(脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的下游加工)

协议：

进行了两组不同的实验，发酵规模为5升和300升。

使用下述纯化方法纯化多糖。

·将根据示例1获得的粗制多糖放入容器中。

·使用100kDa盒通过TFF将粗制多糖浓缩3倍-6倍。

·加入氢氧化钠直至终浓度为08mM-20mM，并且在室温下持续搅拌1小时将其pH调节至pH10.5。

·通过加入乙酸来中和从上述步骤中获得的溶液。

·向该中和的溶液中加入乙醇直至终浓度为33％，并且在持续搅拌下孵育数小时。

·将从上述步骤中获得的溶液离心，并且收集上清液。

·乙醇浓度增加到40％。

·向上清液中加入0.1M KCL，并且在2℃–8℃下孵育不少于3小时。

·将从上述步骤中获得的溶液进行离心，并且收集上清液。通过将乙醇的终浓度提高到65％可以沉淀出多糖。

·将多糖沉淀物溶解于1M NaCl中。使上清液穿过0.2μ过滤器，并使用25mM Tris-HCl缓冲液通过100kDa切向流过滤对渗余物进行渗滤，以获得纯化多糖(阶段I)。

·加入CTAB直至终浓度为2％，并且在室温下孵育1小时。

·将从上述步骤中获得的溶液离心，收集沉淀，并且将其溶解于96％乙醇中。将溶解的混合物进一步进行离心以去除未溶解的残余物。

·向从上述步骤中获得的上清液中加入NaCl直至终浓度为0.2M。将沉淀的PS溶解于1M NaCl中，然后使用65％的乙醇沉淀PS。

·将从上述步骤中获得的溶液首先用0.5M NaCl且然后使用100kD切向流过滤并通过WFI进行充分渗滤，并且穿过0.2μ过滤器，并且在-20℃下作为最终批量存储。

结果：

表11

注意：NA＝不适用

进行了两组不同的实验，发酵规模为5升和300升。

观察到，阴离子去污剂和碱的组合使用对降低杂质分布有深远的影响。纯化阶段I和阶段II的杂质水平远低于WHO对脑膜炎奈瑟氏球菌血清组-C多糖的规格限制。

在5升和300升的规模下，蛋白质杂质(％)＝<1％；核酸杂质(％)＝<0.3％；内毒素杂质(多糖的EU/μg)＝<多糖的40EU/μg。

在两个规模上以及在纯化阶段I和阶段II中，与粗样品相比，纯化多糖的回收率均超过60％。

示例5：荚膜多糖的纯化(脑膜炎奈瑟氏球菌血清组W&Y的下游加工)

协议：

进行了两组不同的实验，发酵规模分别为5L和300L。

使用下述纯化方法纯化多糖。

·将根据示例2获得的粗制多糖取入容器中。

·使用100kDa盒通过TFF将粗制多糖浓缩3倍-6倍。

·加入氢氧化钠直至终浓度为08mM-20mM，并且在室温下持续搅拌1小时将其调节至pH10.5。

·通过加入乙酸来中和从上述步骤中获得的溶液。

·向该中和的溶液中加入乙醇至终浓度为33％，并且在持续搅拌下孵育数小时。

·将从上述步骤中获得的溶液离心，并且收集上清液。

·向上清液中加入0.1M KCL，并且在2℃–8℃下孵育约8小时。

·将从上述步骤中获得的溶液进行离心，并且收集上清液。

·使上清液穿过0.2μ过滤器，并且使用25mM Tris-HCl缓冲液通过100kDa切向流过滤对渗余物进行渗滤，以获得纯化多糖(阶段I)。

·加入CTAB直至终浓度为2％，并且在室温下孵育1小时。

·向从上述步骤中获得的上清液中加入NaCl直至终浓度0.25M。将沉淀的PS溶解于1M NaCl中，然后使用65％的乙醇沉淀PS。

·将从上述步骤中获得的溶液使用100kD切向流过滤并通过WFI进行充分渗滤，并且穿过0.2μ过滤器，并且在-20℃下作为最终批量存储(阶段II)。

结果

表12

表13

进行了两组不同的实验，发酵规模分别为5L和300L。

相比之下，观察到纯化阶段I和阶段II的杂质水平远低于WHO对脑膜炎奈瑟氏球菌血清组-Y和脑膜炎奈瑟氏球菌血清组n-W多糖的规格限制。

在5升和300升的规模下，蛋白质杂质(％)＝<3.5％；核酸杂质(％)＝<1.5％；内毒素杂质(多糖的EU/μg)＝<多糖的60EU/μg。

示例6：荚膜多糖的纯化

(脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A和X的下游加工)

协议：

进行了两组不同的实验，发酵规模分别为5L和300L。

使用下述纯化方法纯化多糖。

将根据示例2获得的粗制多糖取入容器中。

·使用100kDa盒通过TFF将粗制多糖浓缩3倍-6倍。

·加入乙酸钠、EDTA和十二烷基硫酸钠直至终浓度分别为6％、2mM和1％；并且在室温下持续搅拌1小时。

·将从上述步骤中获得的溶液离心，并且收集上清液。

·向上清液中加入0.1M KCL，并且在2℃–8℃下孵育约3小时。

·将从上述步骤中获得的溶液进行离心，并且收集上清液。

·加入CTAB直至终浓度为2％；并且在室温下孵育1小时。

·将从上述步骤中获得的溶液使用100kD切向流过滤并通过WFI进行充分渗滤，并且穿过0.2μ过滤器，并且以-20℃下作为最终批量存储(阶段II)。

结果：

表14

表15

相比之下，观察到纯化阶段I和阶段II的杂质水平远低于WHO对脑膜炎奈瑟氏球菌血清组-A和脑膜炎奈瑟氏球菌血清组-X多糖的规格限制。

观察到，阴离子去污剂的使用对降低杂质分布有深远的影响。纯化阶段I和阶段II的杂质水平远低于WHO对脑膜炎奈瑟氏球菌血清组-A和脑膜炎奈瑟氏球菌血清组-X多糖的规格限制。

在300升的规模下，蛋白质杂质(％)＝<2.5％；核酸杂质(％)＝<1％；内毒素杂质(多糖的EU/μg)＝<多糖的40EU/μg。

在两个规模上以及在纯化阶段I和阶段II中，与粗样品相比，血清组X的纯化多糖的回收率均高于60％，血清组A的纯化多糖的回收率均高于50％。

示例7：

分离多糖(PS)的结构完整性

NMR光谱参照图1至图5。

使用核磁共振(NMR)验证了脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A、C、W、Y和X的分离多糖的结构完整性。

记录的NMR光谱具有可比性，并且证实了记录的NMR光谱与血清组A、C、W和Y的部分O-乙酰化脑膜炎球菌多糖以及血清组X的N-乙酰化多糖相当。

示例8：

基于脱氧胆酸钠(DOC)的纯化工艺与所要求保护的多糖纯化工艺的比较分析。

基于脱氧胆酸钠(DOC)的方法“An improved method for meningococcuspolysaccharide purification(一种用于脑膜炎球菌多糖纯化的改进方法)，Tanizaki等人(共轭和多糖疫苗，海报79，http：//neisseria.org/ipnc/1996/Neis1996-chap4.pdf)”被优化如下：

100kD收获物；DOC+EDTA+NaOAc+乙醇(40％)处理；离心，收集上清液并进行0.2μ过滤；浓缩和渗滤；室温下进行CTAB(3％)处理；离心和收集CTAB-PS沉淀物；将CTAB-PS沉淀物溶解于96％乙醇中，并且用0.1M NaCl沉淀；将沉淀溶解于40％乙醇中并加入1M NaCl(2℃-8℃)；离心收集上清液；碳过滤；通过增加乙醇浓度使PS沉淀；PS颗粒在WFI中溶解，并且用WFI浓缩和渗滤，并且在0.2μ过滤后在-20℃存储。

基于DOC的方法在整个工业中广泛用于对待用作疫苗抗原的多糖进行纯化。

将通过基于DOC的方法获得的多糖的杂质分布与要求保护的本发明的方法进行比较。

结果：

表16

对于血清组A和血清组C而言，基于SDS的本发明方法和基于DOC的方法显示出相似的结果，然而对于血清组W、Y和X而言，与DOC方法相比，SDS方法显示出更高的最终回收率。

从上述结果可以看出，改进的SDS方法在易于操作以及其他一些优点——比如DOC是动物来源的成分并且不符合HALAL标准——方面都具有明显的优点。DOC由全球的单个厂商制造和供应，而SDS是经过HALAL认证的合成去污剂并且在全球范围内有多家供应商。DOC在不影响化学成分的情况下分解内毒素，并且一旦去除去污剂即可以恢复其生物学活性，而SDS因其两亲性质和较高的聚集数而使蛋白质充分变性和溶解，并且还将内毒素不可逆地破坏成其单体单元。

通过使用SDS，化学品和消耗品(乙醇、超滤器、碳过滤器等)的消耗减少具有明显的优势。另外，使用SDS作为替代对多糖的结构完整性是非侵入性的。

示例9：

制备如下所示的免疫原性组合物并且测试其免疫原性。

该组合物包括：

结果：

发现该免疫原性组合物是免疫原性的。

本发明的优点：

该方法促成内毒素杂质、蛋白质杂质和核酸杂质的显著减少，从而提供具有所需的O-乙酰基水平的荚膜多糖的更高回收率。从以上结果可以看出，要求保护的方法在易于操作方面以及其他一些优势方面具有明显的优势，所述其他一些优势如下：

监管问题：DOC是动物来源的成分并且不符合HALAL标准。DOC由全球的单个厂商制造和供应，而SDS是经过HALAL认证的合成去污剂并且在全球范围内有多家供应商。

功能问题：DOC在不影响化学成分的情况下分解内毒素，并且一旦去除去污剂即可以恢复其生物学活性，而SDS因其两亲性质和较高的聚集数而使蛋白质充分变性和溶解，并且还将内毒素不可逆地破坏成其单体单元。

通过使用SDS，化学品和消耗品(乙醇、超滤器、碳过滤器等)的消耗减少是明显的优势。

本专利申请的发明方法促成其他细胞杂质的显著减少。此外，该方法提供了在上游加工和下游加工期间使用的试剂的有效去除。

另外，本专利申请的发明方法对多糖的结构完整性是非侵入性的，从而保持了其免疫原性。

考虑到所公开的本发明的原理所可以应用于的许多可能的实施方式，应当认识到的是，示出的实施方式仅是本发明的优选示例而不应当视为限制本发明的范围。

Claims

1.一种用于从生物样品中分离多糖的方法，所述方法包括下述步骤：

a)将粗制多糖溶液与阴离子去污剂混合；

b)向溶液中加入碱；

c)进行溶液的pH中和；

d)使溶液进行基于醇的沉淀，然后离心并保留上清液；

e)去除所述上清液中存在的去污剂；

f)进行多糖的浓缩和渗滤；

其中，得到的纯化多糖具有60％-80％的回收率，具有最佳的O-乙酰化水平，并且具有包括内毒素、蛋白质和核酸的最少的杂质。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括下述步骤：

g)将多糖溶液与阳离子去污剂混合；

h)将溶液离心并收集沉淀物；

i)将所述沉淀物溶解于乙醇中，然后进行基于盐的多糖沉淀。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述阴离子去污剂选自包括下述各者的组：所述各者为烷基硫酸盐、十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠、十二烷基磺酸钠、s-烷基硫酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠、油基硫酸钠、N-油基聚(氨基酸)钠、烷基苯磺酸钠、α-烯烃磺酸钠、烷基磺酸钠、α-磺基单羧酸酯、脂肪酸磺基烷基酯、琥珀酸酯磺酸盐、烷基萘磺酸盐、烷烃磺酸钠、木质素磺酸钠和烷基甘油醚磺酸钠。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述阴离子去污剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。

5.根据权利要求3所述的方法，其中，溶液中的所述阴离子去污剂(SDS)的终浓度在0.1％-4.0％的范围内，优选地小于1％。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述碱选自包括氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、羟胺、三乙胺和氢氧化锂的组。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述碱是氢氧化钠。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，溶液中的所述碱的终浓度在5mM-50mM的范围内，优选地在5mM-20mM的范围内，并且最优选地在8mM-15mM的范围内。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，在加入所述碱之后溶液的pH在pH9至pH11的范围内，优选地为pH10.5。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，通过加入温和有机酸来中和溶液(pH7.0)。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述温和有机酸是甲酸、乙酸、丙酸、草酸中的一者，优选地是乙酸。

12.根据权利要求1所述的方法，其中，使用钾盐处理、凝胶过滤、乙醇处理、以及离子交换树脂/Amberlite柱中的至少一者或更多者进行去污剂的去除。

13.根据权利要求1所述的方法，其中，通过使用钾盐对去污剂进行沉淀来去除去污剂。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述钾盐是下述各者中的一者或者是下述各者中的两者或更多者的组合：所述各者为氯化钾、乙酸钾、硫酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾、磷酸钾、磷酸氢钾、磷酸二氢钾、硝酸钾和其他钾盐。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述钾盐是氯化钾。

16.根据权利要求13所述的方法，其中，溶液中所述钾盐的终浓度高于或等于使阴离子表面活性剂充分沉淀的浓度。

17.根据权利要求13所述的方法，其中，溶液中所述钾盐的终浓度小于300mM，优选地为100mM。

18.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多糖来源于生物源。

19.根据权利要求1和18所述的方法，其中，所述多糖来源于革兰氏阴性细菌。

20.根据权利要求1和18所述的方法，其中，所述多糖是唾液酸残基的聚合物。

21.根据权利要求1和18-20所述的方法，其中，所述多糖来源于脑膜炎奈瑟氏球菌。

22.根据权利要求1和18-21所述的方法，其中，所述多糖来源于脑膜炎奈瑟氏球菌血清型B、脑膜炎奈瑟氏球菌血清型C、脑膜炎奈瑟氏球菌血清型W、脑膜炎奈瑟氏球菌血清型Y。

23.根据权利要求2所述的方法，其中，所述阳离子去污剂是下述各者中的一者或者是下述各者中的两者或更多者的组合：所述各者为十六烷基三甲基铵盐、四丁基铵盐、十四烷基三甲基铵盐、和溴化己二甲铵。

24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述阳离子去污剂是十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。

25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述阳离子去污剂的浓度小于3％，优选地为1％。

26.根据权利要求1和2所述的方法，其中，所述醇是亲水性醇。

27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述亲水性醇为下述各者中的一者或者为下述各者中的两者或更多者的组合：所述各者为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丙酮和叔丁醇；所述亲水性醇的浓度为<65％或>95％。

28.根据权利要求1和2所述的方法，其中，所述醇是乙醇。

29.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多糖的浓缩和渗滤是使用切向流过滤和100kDa MWCO膜完成的。

30.根据权利要求2所述的方法，其中，用于沉淀的所述盐是下述各者中的一者或者是下述各者中的两者或更多者的组合：所述各者为氯化钠、氯化铵、氯化钾。

31.根据权利要求2和30所述的方法，其中，用于沉淀的所述盐是氯化钠。

32.根据权利要求2和30-31所述的方法，其中，所述盐的浓度在0.25M至2M的范围内。

33.一种用于分离多糖的方法，所述方法包括下述步骤：

a)将粗制多糖溶液与阴离子去污剂混合；

b)向溶液中加入EDTA和乙酸钠；

c)使溶液进行乙醇沉淀，然后离心并保留上清液；

d)去除所述上清液中存在的去污剂；

e)进行细菌多糖的浓缩和渗滤；

其中，得到的纯化多糖具有60％-80％的回收率，具有最佳的O-乙酰化曲线，并且具有包括内毒素、蛋白质和核酸的最少的杂质。

34.根据权利要求33所述的方法，其中，所述方法还包括下述步骤：

a)将细菌多糖溶液与阳离子去污剂混合；

b)将溶液离心并收集沉淀物；

c)将所述沉淀溶解于乙醇中，然后进行基于盐的沉淀。

35.根据权利要求33所述的方法，其中，去污剂是阴离子去污剂。

36.根据权利要求35的方法，其中，所述阴离子去污剂是下述各者中的一者或者是下述各者中的两者或更多者的组合：所述各者为烷基硫酸盐、十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠、十二烷基磺酸钠、s-烷基硫酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠、油基硫酸钠、N-油基聚(氨基酸)钠、烷基苯磺酸钠、α-烯烃磺酸钠、烷基磺酸钠、α-磺基单羧酸酯、脂肪酸磺基烷基酯、琥珀酸酯磺酸盐、烷基萘磺酸盐、烷烃磺酸钠、木质素磺酸钠、烷基甘油醚磺酸钠、和其他阴离子去污剂。

37.根据权利要求35所述的方法，其中，所述阴离子去污剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。

38.根据权利要求35所述的方法，其中，所述十二烷基硫酸钠(SDS)的终浓度在0.1％-4.0％的范围内，优选地小于1％。

39.根据权利要求33所述的方法，其中，使用钾盐处理、凝胶过滤、乙醇处理、以及离子交换树脂/Amberlite柱中的至少一者或更多者进行去污剂的去除。

40.根据权利要求33所述的方法，其中，通过使用钾盐对去污剂进行沉淀来去除去污剂。

41.根据权利要求33所述的方法，其中，溶液中所述钾盐的终浓度高于或等于使阴离子表面活性剂充分沉淀的浓度。

42.根据权利要求40所述的方法，其中，所述钾盐是下述各者中的一者或者是下述各者中的两者或更多者的组合：所述各者为氯化钾、乙酸钾、硫酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾、磷酸钾、磷酸氢钾、磷酸二氢钾、硝酸钾和其他钾盐。

43.根据权利要求34所述的方法，其中，所述阳离子去污剂是下述各者中的一者或者是下述各者中的两者或更多者的组合：所述各者为十六烷基三甲基铵盐、四丁基铵盐、十四烷基三甲基铵盐、和溴化己二甲铵。

44.根据权利要求42所述的方法，其中，所述阳离子去污剂是十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。

45.根据权利要求35所述的方法，其中，所述CTAB的终浓度在0.5％-3.0％的范围内，优选地小于1％。

46.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述多糖来源于包括下述各者的组：所述各者为幽门螺杆菌、肺炎衣原体、沙眼衣原体、解脲脲原体、肺炎支原体、葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、A组链球菌、B组链球菌Ia、Ib、II、III、V、VI或VIII；C组链球菌、化脓性链球菌、无乳链球菌、失乳链球菌、肺炎链球菌、绿链球菌、粪肠球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、淋病奈瑟氏球菌、伤寒杆菌、炭疽杆菌、沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、巴斯德氏杆菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲菌、梭状芽孢杆菌、艰难梭菌、分枝杆菌属、结核分枝杆菌、梅毒螺旋体、鲍氏疏螺旋体、伯氏疏螺旋体、钩端螺旋体、杜氏嗜血杆菌、白喉棒杆菌、百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌、支气管败血博德特氏菌、流感嗜血杆菌、大肠埃希菌、志贺氏菌、埃里希氏菌和立克次氏体；肺炎链球菌1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9A、9F、9N、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、15C、17F、18C、19F、19A、20、22F、23B、23F、24F、33F、35B、38和45型的多糖；脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A、B、C、D、W135、X、Y、Z、29E的多糖；以及b型流感嗜血杆菌。

47.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述多糖来源于生物源。

48.一种根据前述权利要求中的任一项所述的方法获得的多糖。

49.根据前述权利要求中的任一项所述的多糖，其中，所述多糖为荚膜多糖、次荚膜多糖或胞外多糖。

50.根据权利要求48所述的多糖，所述多糖通过化学或机械手段进行分级。

51.一种根据前述权利要求中的任一项所述的方法获得的疫苗，所述疫苗包含多糖抗原。

52.根据前述权利要求中的任一项所述的多糖，所述多糖与载体蛋白缀合，其中，载体蛋白是下述各者中的一者：所述各者为CRM197、肺炎球菌表面粘附素A(PsaA)、白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)、破伤风类毒素的片段C、百日咳类毒素、流感嗜血杆菌的蛋白D、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST、铜绿假单胞菌的外毒素A、外膜复合物c(OMPC)、孔蛋白、转铁蛋白结合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌表面粘附蛋白A(PsaA)、肺炎球菌PhtD、肺炎球菌表面蛋白BVH-3和BVH-11、炭疽芽孢杆菌的保护性抗原(PA)、排毒杆菌的解毒浮肿因子(EF)、炭疽杆菌的致死因子(LF)、卵清蛋白、匙孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、结核菌素的纯化蛋白衍生物(PPD)；特别地是CRM197、破伤风类毒素、白喉类毒素和/或PsaA。

53.根据前述权利要求中的任一项所述的多糖，所述多糖通过使用还原胺化、氰基化或碳二亚胺共轭化学而缀合至载体蛋白。

54.一种根据前述权利要求中的任一项获得的免疫原性组合物，其中，缀合物包含脑膜炎奈瑟氏球菌(脑膜炎奈瑟氏球菌)的荚膜多糖，所述荚膜多糖选自血清组A、B、C、D、X、Y、Z、29E和W-135。

55.一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含下述各者中的至少一者：

a)(i)脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的荚膜糖与(ii)破伤风类毒素的缀合物；

b)(i)脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖与(ii)CRM197的缀合物；

c)(i)脑膜炎奈瑟氏球菌血清组Y的荚膜糖与(ii)CRM197的缀合物；

d)(i)脑膜炎奈瑟氏球菌血清组W135的荚膜糖与(ii)CRM197的缀合物；以及

e)(i)脑膜炎奈瑟球菌血清组X的荚膜糖与(ii)破伤风类毒素的缀合物。

56.根据权利要求54-55所述的免疫原性组合物，其中，所述组合物包含：

a)至少一种多糖-蛋白质缀合物；

b)浓度约为3％w/v的蔗糖；以及

c)浓度为约0.5％w/v的柠檬酸钠，其中，所述多糖通过根据前述权利要求中的任一项所述的方法进行纯化。