BR112019022868A2

BR112019022868A2 - método para remoção de impurezas de preparações à base de polissacarídeo capsular bacteriano

Info

Publication number: BR112019022868A2
Application number: BR112019022868A
Authority: BR
Inventors: Mhalasakant Dhere Rajeev; Shankar Pisal Sambhaji; Sarma Annamraju Dattatreya
Original assignee: Serum Institute Of India Private Limited
Priority date: 2017-05-05
Filing date: 2018-05-03
Publication date: 2020-05-19
Also published as: KR102565771B1; CU20190090A7; MX2023013110A; WO2018203268A1; ZA201908038B; KR20200015524A; AU2018262438B2; MD20190088A2; CN110831980B; US11739356B2; CA3062399A1; CN110831980A; GEP20227408B; UA125937C2; US20240026405A1; EA201992636A1; US20200190549A1; JP2023017929A; AU2018262438A1; EP3619241A1

Abstract

a presente invenção refere-se a um processo melhorado para purificação de polissacarídeos capsulares bacterianos, mais especificamente polissacarídeos capsulares de bactérias gram-negativas. o processo compreende a concentração e diafiltração da colheita, o tratamento com detergente aniônico e alcalino forte seguido por centrifugação, diafiltração e precipitação à base de um detergente catiônico de polissacarídeos bacterianos. o processo resulta na redução significativa de impurezas relacionadas à endotoxina, proteína e ácido nucleico, fornecendo, assim, recuperação maior do polissacarídeo capsular com os níveis desejados de o-acetila. o referido processo é expansível, não enzimático e emprega menos etapas de purificação.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ’’MÉTODO PARA REMOÇÃO DE IMPUREZAS DE PREPARAÇÕES À BASE DE POLISSACARÍDEO CAPSULAR BACTERIANO.

Campo da invenção

[0001] A invenção enquadra-se amplamente no campo da biotecnologia e refere-se, especificamente, com a colheita e processamento downstream (a jusante) para purificação de polissacarídeos capsulares bacterianos.

Antecedentes da invenção

[0002] Neisseria meningitidis é uma causa importante de infecção das membranas (meninges) e do líquido cefalorraquidiano (LCR) que envolve o cérebro e a medula espinhal, resultando em morte e deficiência em todo o mundo.

[0003] Neisseria meningitidis, também conhecida como meningococo, é uma bactéria Gram-negativa. De acordo com a estrutura da cápsula polissacarídica, identificaram-se 13 sorogrupos de N. meningitidis, dos quais, seis sorogrupos (A, B, C, W, Xe Y) exibem potencial para causar epidemias (Ref.: Lee Harrison et ai 2011).

[0004] A meningite ocorre em pequenos agrupamentos (dusters) por todo o mundo com surtos sazonais de proporções variáveis de meningite bacteriana epidêmica. O fardo mais pesado da doença meningocócica tem sido observado no continente africano, especialmente na África Subsaariana, também conhecida como cinturão da meningite. Segundo estimativas dos Centers for Disease Control and Prevention (CDC) e da Organização Mundial da Saúde, a doença meningocócica causou 171.000 mortes em todo o mundo no ano 2000. Além disso, o relatório dos CDC confirma a emergência de Neisseria meningitidis como uma das principais causas de meningite e septicemia em crianças e adultos jovens nos Estados Unidos. Assim, Neisseria meningitidis continua sendo um problema para saúde pública

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2/38 tanto em países desenvolvidos como nos em desenvolvimento.

[0005] Em 1996-97, na epidemia causada por Neisseria meningitidis Sorogrupo A, foram relatados mais de 250.000 casos da doença e acima de 25.000 óbitos; exortando a comunidade mundial da saúde a se empenhar pelo desenvolvimento da vacina que eliminaria a epidemia de meningite grupo A na África.

[0006] Em 2010, a vacina conjugada de polissacarídeo meningocóclco A, ou seja, Menafrivac foi introduzida com sucesso no continente africano resultando no quase desaparecimento de epidemias causadas por Neisseria meningitidis sorogrupo A. Com a influência decrescente de Neisseria meningitidis sorogrupo A, a influência de outro sorogrupo meningocócico, como Men-C, Men-W, Men~X e de Men~Y, está em ascensão. Para combater esse efeito dramático, foram desenvolvidas e comercializadas várias vacinas monovalentes e multivalentes compreendendo o sorogrupo mencionado acima. Embora vacinas conjugadas multivalentes A, C, YeW tenham sido licenciadas desde 2005 (Menactra®, Menveo®) para uso em crianças e adultos no Canadá, nos Estados Unidos da América e na Europa; essas vacinas estão disponíveis no mercado a custos muito altos, tornando-as inacessíveis para o resto da comunidade mundial.

[0007] A cápsula do sorogrupo A é composta por unidades repetidas de N-acetil-manosamina-1 -fosfato (a1-6)-ligado O-acetilado. Polissacarídeos capsulares dos sorogrupos B, C, WeY são compostos por derivados do ácido siálico; os sorogrupos B e C expressam homopolímeros do ácido siálico (a2-»8)- e (a2--*9)-ligados, e sequências alternadas de d-galactose ou d-glicose e ácido siálico são expressas pelos sorogrupos W e Y. Os contaminantes no caldo de fermentação interagem de modo diferente com as porções repetidas presentes nos polissacarídeos capsulares. Portanto, há necessidade de um processo que explore essas diferenças para o isolamento de

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3/38 diferentes polissacarídeos capsulares bacterianos de sorogrupos distintos.

[0008] De acordo com a Série de Relatórios Técnicos da OMS sobre Vacina Conjugada Meningocócica, a especificação a seguir deve ser atendida por polissacarídeos isolados:

Tabela 1

Parâmetro de controle	Especificação da OMS
Men-C	Men-W	Men-Y
Teor de polissacarídeo (PS)	>3 mg/mL	>3 mg/mL	>3 mg/mL
Impureza proteica	<1%	<5%	<5%
Impureza de ácido nucleico	<1%	<2%	<2%
Teor de ácido siálico	>80%	>56%	>56%
Teor de O-acetila	>1,5 mM/g de PS	>0,3 mM/g de PS	>0,3 mM/g de PS
Teor de endotoxina	<100 EU/pg de PS	<100 EU/pg de PS	<100 EU/pg de PS
Distribuição do tamanho molecular	75% acima de 0,5 kD	80% acima de 0,5 kD	80% acima de 0,5 kD

0009] Os processos clássicos de purificação de PS capsulares bacterianos usados em vacinas incluem diversas precipitações seletivas com etanol e/ou com detergente catiônico, seguidas por centrifugação contínua, ultracentrifugação e desproteinização com fenol.

[0010] A literatura inicial para o isolamento do polissacarídeo de Neisseria meningitidis dos Sorogrupos A, B e C foi publicada por Gotschlich et ai (1969). Gotschlich et ai empregaram o detergente catiônico Cetavlon (Brometo de hexadeciltrimetilamônio) para precipitar rapidamente os polissacarídeos com carga negativa da cultura inteira, seguido pela dissociação do complexo detergente-polissacarídeo utilizando extração com CaCh 0,9 M e centrifugação, a técnica de

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4/38 precipitação com etanol foi utilizada para remoção de ácido nucleico enquanto que as proteínas eram removidas utilizando o tratamento de polissacarídeos com acetato de sódio, seguido por homogeneização com butanol contendo clorofórmio, um uso alternativo da mistura de fenol-água quente é também relatado. O método de purificação final envolvia a precipitação do polissacarídeo com etanol (4~5 vezes) e acetona. Esse método envolve a inconveniência de usar clorofórmio e grande quantidade de etanol (Ref.: T.P. Pato, Tese de Mestrado, Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2003, p. 95).

[0011] O processo de purificação relatado por Tanizaki et al. para o polissacarídeo C de Neisseria meningitidis C, em que a extração com fenol foi substituída por digestão com proteinase, utiliza uma mistura de proteinase K, nagarse e tripsina; ultrafiltração tangencial em fibra oca com corte de 100 kDa em vez de ultracentrifugação; seguida por diaflltração extensiva, utilizando uma membrana para corte de 100 kDa, realizada em tampão Tris-HCI 20 mM contendo 0,5% de desoxicolato, para eliminar proteínas e lipopolissacarídeos (LPS) de baixo peso molecular. Apesar do uso das modificações acima, a preparação do polissacarídeo isolado continha valores de proteína e ácido nucleico de 2% (p/p) e 1,5% (p/p) respectivamente [Ref.: Tanizaki et a/; Journal of Microbiological Methods, Volume 27, Issue 1, September 1996, Pages 19-23, e Goncalves et al 2007; Formatex; Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology]. [0012] TP Pato et al (2006) descrevem um processo modificado de purificação para o polissacarídeo C de Neisseria meningitidis, o qual compreende uma centrifugação em fluxo contínuo da cultura para remoção das células; concentração do sobrenadante por filtração tangencial (corte: 100 kDa); adição de DOC 0,5%, aquecimento para 55°C durante 30 minutos e filtração tangencial (corte: 100 kDa);

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5/38 cromatografia de troca aniônica (Source 15Q) e cromatografia de exclusão por tamanho (Sepharose CL-4B) [Ref.: T.P. Pato et al. / J. Chromatogr. B 832 (2006) 262-267],

[0013] US7491517B2 revela o uso de CTAB, Etanol, Proteinase K, carvão ativado e filtração em gel para remoção de impurezas durante a purificação de polissacarídeo C de Neisseria meningitidis. No entanto, esse processo de múltiplas etapas resulta em perda de recuperação do polissacarídeo e o carvão ativado pode dar origem a Hxiviáveis indesejáveis.

[0014] WO2017006349 revela o uso de acetato de zinco/sulfato de amônio/citrato de sódio para remoção de contaminantes proteicos do extrato colhido de N. meningitidis. É também descrito o uso de enzimas como Benzonase, Proteinase K ou Nargase para degradação de proteínas residuais e/ou materiais de ácidos nucleicos, seguido por purificação cromatográfica.

[0015] WO2015128798A1 descreve um processo para remover impurezas do polissacarídeo C de Neisseria meningitidis. O referido processo emprega incubação a 50-60 °C na presença de detergentes aniônicos como desoxicolato de sódio ou HEPES, desacetilação de polissacarídeos brutos utilizando NaOH 0,5-1,5 M a 50 °C por 30 minutos a 10 horas e purificação adicional por diafiltração e cromatografia por interação hidrofóbica (HIC).

[0016] Tian et al descrevem um processo para purificação de polissacarídeos dos sorogrupos C, W e Y de Neisseria meningitidis, compreendendo o uso de CTAB, Etanol, DOC, Capto Adhere (cromatografia multimodal de troca aniônica), Capto DEAE (ânion fraco) e Sephadex G25, em que o teor de endotoxinas é inferior a 25 EU/mg, o teor de proteínas inferior a 10 mg/g, teor de ácido nucleico entre 17mg/g [Ref.: Tian et a/2013 GE Healthcare; Application note, 29216880 AA],

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[0017] O procedimento GotschHch, sendo um processo de múltiplas etapas, resulta em perda substancial de recuperação do produto, ou seja, em torno de 37%. Além disso, o uso de produto químico do tipo fenol pode levar a alterações indesejadas no polissacarídeo ou proteína transportadora e também resulta em resíduos fenólicos tóxicos indesejáveis.

[0018] O procedimento de US7491517B2, WO2017006349 e TP Pato et a/ (2006) faz uso de enzimas que ajudam na degradação de proteínas e contaminantes de ácido nucleico, no entanto, a remoção de enzimas e do material hidrolisado é uma tarefa desanimadora e pode resultar em perda do produto de interesse. Além disso, agências reguladoras restringem o uso de enzimas animais em produtos para humanos pelo risco de contaminação com prions. A utilização de enzimas, além do fato do custo alto, introduzirá mais questões regulatórias na estrutura das cGMP (boas práticas de fabricação atuais), p. ex., as origens das enzimas (de animal ou recombinante), variações na atividade das enzimas entre diferentes fornecedores e lotes, etc.

[0019] WO2017006349 e US4686102A revelam o uso de sulfato de amônio para precipitação de contaminantes proteicos e de ácido nucleico. No entanto, às vezes, os polissacarídeos capsulares também precipitam, resultando em perda de polissacarídeo total.

[0020] O desoxicolato de sódio (DOC) é um detergente leve e um dos detergentes mais comumente usados em purificações de polissacarídeos. Desoxicolato de sódio com uma estrutura esteroide central é menos desnaturante e limitado em sua força solubilizante, quebra as endotoxinas sem afetar a estrutura química; e, consequentemente, quando da remoção do desoxicolato de sódio, as endotoxinas readquirem as suas atividades biológicas. Além disso, procedimentos à base de DOC não operam de modo eficiente para remoção de contaminantes de polissacarídeos, especialmente

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7/38 polissacarídeos contendo ácido siálico. Isso talvez se deva à fraca atividade detergente de DOC na associação Lipopolissacarídeo™ Proteína formada durante o processamento downstream, resultante em nível alto de endotoxinas e teor de proteínas no polissacarídeo final isolado. Além disso, sendo o desoxicolato de sódio um produto de origem animal, mesmo sua presença residual no produto final pode levar a não aceitação do produto por agências reguladoras e certas comunidades religiosas.

[0021 ] Técnicas cromatográficas, como cromatografia de exclusão por tamanho, cromatografia de troca iônica e cromatografia de interação hidrofóbica, foram utilizadas com êxito para o isolamento de polissacarídeos bacterianos com efetiva remoção de contaminantes proteicos e de ácido nucleico. Apesar do isolamento bem-sucedido do polissacarídeo bacteriano, com as especificações da OMS, o uso de técnicas cromatográficas envolve o trabalho em múltiplas etapas e demorado para preparação de amostras, envolve questões de escalabilidade, compromete drasticamente a recuperação dos polissacarídeos capsulares e, assim, não é uma opção viável de custo baixo para o processamento downstream em escala industrial.

[0022] O processamento downstream de preparações biológicas é a causa-raiz para 20%-80% dos custos totais de produção (Ansejo and Patrick, 1990), o desenvolvimento de novas estratégias a jusante é essencial para reduzir o custo de produção e permitir a distribuição da vacina para a população inteira pelo sistema de saúde pública.

[0023] Atualmente, o método empregado para obter polissacarídeos em suas formas purificadas inclui diversas etapas de tratamentos com detergente e precipitação diferencial do caldo de colheita utilizando solvente orgânico como o etanol.

[0024] No entanto, a seguir, são apresentadas duas restrições importantes que impõem a procura por um método alternativo de

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8/38 purificação.

[0025] No momento, como uma etapa inicial de remoção de impurezas (proteínas, ácidos nucleicos e endotoxinas), um detergente aniônico desoxicolato de sódio (DOC) é empregado. DOC é um detergente biliar de origem animal com uma estrutura esteroide central. Devido a sua estrutura volumosa, possui força solubilizante limitada e menos capacidade desnaturante em macromoléculas biológicas. Além disso, o seu fornecimento estável com a certificação regulatória requerida limita-se a um único vendedor/fornecedor.

[0026] O alto consumo de etanol e a inclusão de etapas redundantes (filtração em carvão) toma o processo tedioso, demorado e dispendioso.

[0027] Permanece uma necessidade significativa de métodos alternativos, simples, expansíveis de custo compensador para purificar polissacarídeos bacterianos e obter recuperação maior do polissacarídeo. A presente invenção provê um processo robusto e acessível de purificação descendente para o isolamento de polissacarídeos capsulares bacterianos, em que o referido processo resulta na redução significativa de impurezas de endotoxinas, proteínas e ácido nucleico, possibilitando, assim, maior recuperação do polissacarídeo, bem como mantendo os níveis desejados de O-acetila de acordo com a especificação da OMS.

Sumário da invenção:

[0028] A presente invenção refere-se a um processo alternativo para purificação de polissacarídeos capsulares bacterianos, mais especificamente polissacarídeos capsulares de N. meningitidis.

[0029] O processo compreende a concentração e diafiitração da colheita através de filtração de fluxo tangencial 100kD, seguido pela adição de detergente aniônico e alcalino forte para desnaturação de proteínas, ácidos nucleicos e lipopolissacarídeos. O extrato biológico é

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9/38 submetido mais tarde à centrifugação, diafiltração e precipitação tendo por base CTAB de polissacarídeos bacterianos. O processo resulta na recuperação melhorada do polissacarídeo, é expansível, não enzimático e emprega etapas econômicas e em menor número de purificação. O referido processo resulta na redução significativa de impurezas relacionadas à endotoxinas, proteínas e ácidos nucleicos, possibilitando, assim, maior recuperação do polissacarídeo, bem como mantendo níveis desejados de O-acetila.

Figuras:

[0030] Figura 1: Espectros de RMN de polissacarídeo Men-C

[0031] Figura 2: Espectros de RMN de polissacarídeo Men-Y

[0032] Figura 3: Espectros de RMN de polissacarídeo Men~W

[0033] Figura 4: Espectros de RMN de polissacarídeo Men-A

[0034] Figura 5: Espectros de RMN de polissacarídeo Men-X.

Descrição:

[0035] De acordo com um aspecto geral da invenção, um dos sorogrupos bacterianos de interesse foi cultivado em um melo adequado e inativado utilizando formaldeído ou qualquer método comumente conhecido na técnica anterior; submetido adicionalmente ao processamento downstream para isolamento do polissacarídeo capsular purificado. A bactéria de interesse para o isolamento de polissacarídeo capsular da presente invenção foi obtida a partir de uma bactéria Gram-negatlva selecionada dentro os gêneros incluindo, entre outros, Escherichia, Neisseria, Haemophilus, Pseudomonas, etc.; mais preferivelmente, o polissacarídeo capsular expresso por sorogrupo de Neisseria meningitidis. Em outro aspecto da invenção, o polissacarídeo pode ser derivado do grupo que consiste em Helicobacter pylori, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma ureaiyticum, Mycoplasma pneumoniae, Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus spp., Streptococcus Grupo A,

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Streptococcus Grupo B la, lb, II, III, V, VI, ou VIII; Streptococcus Grupo C, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactlae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus viridans, Enterococcus faecalis, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeas, Baciiius anthracis, Salmonella spp., Salmonella typhi, Vibrio cholerae, Pasteurella pestis, Pseudomonas aeruginosa, Campylobacter spp., Campylobacter jejuni, Clostridium spp., Clostridium difficile, Mycobacterium spp., Mycobacterium tuberculosis, Treponema spp., Borrelia spp., Borrelia burgdorferi, Leptospira spp., Hemophilus ducreyi, Corynebacterium diphtheria, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Bordetella bronchiseptica, Hemophilus influenzae, Escherichia coll, Shigella spp., Ehrlichia spp. e Rickettsia spp. Polissacarídeos de Streptococcus pneumoniae tipo 1,2,3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9A, 9F, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C.17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B,38 e 45; Polissacarídeos de Neisseria meningitidis sorogrupo A, B, C, D, W135, X, Y, Z, 29E; e H. Influenzae tipo b.

[0036] Os materiais biológicos utilizados durante os experimentos foram como segue:

[0037] Os polissacarídeos foram isolados de:

Tabela 2

Nome do organismo	Designação da cepa	Fonte da cepa
Neisseria meningitidis A	M1027	SynCo Biopartners (Países Baixos)
Neisseria meningitidis C	C11(60E)	CBER/FDA, EUA
Neisseria meningitidis \N	S877	CBER/FDA, EUA
Neisseria meningitidis Y	M10659	CDC, EUA
Neisseria meningitidis X	M8210	CBER/FDA, EUA

Ό038] Proteína transportadora não conjugada, ou seja, CRM197 ou TT. CRM197 era derivada da cepa recombinante CS463-003 (MB101)

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11/38 de Pseudomonas fluorescens de Pfenex USA. TT era derivada de Clostridium Tetani (Harvard N° 49205) obtida do CRi, National Control Authority, Kasauli, Himachal Pradesh, índia. CRI obteve essa cepa de NVI, Países Baixos.

[0039] De acordo com uma primeira modalidade da invenção, ο polissacarideo capsular bacteriano foi clarificado da colheita inativada por centrifugação; e o sobrenadante foi submetido à diafiltração utilizando uma unidade de filtração de fluxo tangencial 100kD. Entendese muito bem que qualquer outro método adequado pode ser utilizado no lugar de centrifugação e diafiltração para a concentração de polissacarídeos capsulares bacterianos por um técnico no assunto. Em um dos aspectos preferidos dessa modalidade, o polissacarideo capsular era derivado de Neisseria meningitidis Sorogrupo A, C, W, Ye X.

[0040] De acordo com uma segunda modalidade da invenção, ο retentado obtido na primeira modalidade foi submetido ao tratamento com tensoativo/detergente aniônico. O detergente aniônico é selecionado a partir do grupo que consiste em sulfatos de alquila, dodecil sulfato de sódio, desoxicolato de sódio, dodecil sulfonato de sódio, s-alquíl sulfatos de sódio, sulfatos de sódio de éter de polioxietileno de álcool graxo, oleil sulfato de sódio, N-oleoil poli(aminoácido) sódico, alquilbenzenossulfonatos de sódio, alfa-olefina sulfonatos de sódio, alquil sulfonatos de sódio, ésteres do ácido alfasulfomonocarboxílico, sulfoalquil ésteres de ácidos graxos, succinato sulfonato, naftalenossulfonatos de alquila, alcano sulfonatos de sódio, Hgninassulfonato de sódio e alquil gliceril éter sulfonatos de sódio.

[0041] De preferência, o referido tensoativo aniônico é um alquil sulfato, mais preferivelmente dodecil sulfato de sódio a uma concentração final na faixa de 0,1% a 4%, mais preferivelmente a 1%, foi adicionado ao retentado e agitado à temperatura ambiente por 2

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12/38 horas. A natureza antipática de SDS o torna um forte agente caotrópico que não só rompe as proteínas, mas também as solubiliza.

[0042] Em outro aspecto da segunda modalidade, a colheita inatlvada pode ser diretamente tratada com tensoativo aniônico e submetida ainda à concentração do polissacarídeo capsular, resultando na redução suficiente de impurezas, tornando, com isso, descartável a etapa subsequente de uso do detergente catiônico.

[0043] De acordo com uma terceira modalidade da invenção, alcalino forte foi adicionado à mistura obtida da modalidade acima e o pH foi ajustado para entre 9-11 com agitação constante à temperatura ambiente por 1 hora. O referido alcalino forte foi selecionado a partir de um grupo que consistia em hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, carbonato de sódio, hidroxilamina, trietilamina e hidróxido de lítio.

[0044] De acordo com um aspecto preferido da terceira modalidade da invenção, o referido alcalino forte, ou seja, hidróxido de sódio foi adicionado a uma concentração final entre 5-20M à mistura obtida da modalidade acima e o pH ajustado para 10,5 com agitação constante à temperatura ambiente por 1 hora.

[0045] Em outro aspecto da terceira modalidade da invenção, alternativamente, no lugar do alcalino, EDTA e acetato de sódio foram adicionados à mistura obtida da segunda modalidade, com agitação constante à temperatura ambiente por 1 hora.

[0046] De acordo com uma quarta modalidade da invenção, a solução obtida da modalidade acima foi neutralizada (pH 7,0) pela adição de um ácido orgânico leve. O referido ácido orgânico leve é uma combinação de um ou mais ácidos incluindo ácido fórmico, ácido acético, ácido propiônico, ácido oxálico etc. A essa mistura neutralizada, um álcool hidrofílico, de preferência etanol foi adicionado até uma concentração final de 30-35% e incubado por umas duas horas à temperatura ambiente com agitação constante. O álcool hidrofílico é

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13/38 selecionado dentre metanol, etanol, álcool n-propílico, álcool isopropílico, acetona e álcool t-butílico; ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos; e sua concentração é <65% ou >95%.

[0047] De acordo com uma quinta modalidade da invenção, o excesso de detergente aniônico foi removido da solução. A solução obtida da modalidade acima foi submetida à centrifugação e o sobrenadante foi coletado. Sal de potássio 0,1M foi misturado com o sobrenadante e, quando da sua dissolução, a mistura foi incubada a 28°C por >3 horas. O sal de potássio é selecionado dentre cloreto de potássio, acetato de potássio, sulfato de potássio, carbonato de potássio, bicarbonato de potássio, fosfato de potássio, hidrogenofosfato de potássio, di-hidrogenofosfato de potássio, nitrato de potássio e outros sais de potássio, ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos. Essa etapa tira proveito da baixa solubilidade do dodecil sulfato de potássio. Quando da adição do sal de potássio, preferivelmente KCI, o SDS na solução é convertido em dodecil sulfato de potássio e, sendo menos solúvel, é facilmente precipitado e resulta na remoção completa de SDS. Entende-se muito bem que a concentração de KCI pode ser variada para obter o resultado desejado por um técnico no assunto. O protocolo como mencionado nessa modalidade da invenção pode ser modificado, conforme necessário, pelo técnico no assunto.

[0048] Em outro aspecto da quinta modalidade, o excesso de detergente aniônico pode ser removido da solução utilizando filtração em gel, precipitação com etanol e resinas de troca iônica/colunas Amberlite.

[0049] De acordo com uma sexta modalidade da invenção, a solução obtida da modalidade acima foi submetida à centrifugação e o sobrenadante foi coletado. O sobrenadante foi passado através de um filtro de 0,2 μ e o retentado foi diafiltrado através de filtração de fluxo tangencial 100 KDa.

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[0050] De acordo com uma sétima modalidade da invenção, o retentado obtido da modalidade acima foi diafiltrado utilizando o tampão Tris-HCI a uma concentração finai de 25 mM. A isso, seguiu-se a adição de um detergente catiônico até uma concentração final de 1-2% e incubado a RT por 1 hora com agitação constante. O(s) detergente(s) catiônico(s) é/são selecionado(s) dentre sal de cetiltrimetilamônio, sal de tetrabutilamônio, sal de miristiltrimetilamônio e brometo de hexadimetrina; ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos. Entende-se muito bem que a concentração de detergente catiônico pode ser variada na faixa de 0,1 % a 4% para obter o resultado desejado por um técnico no assunto. De preferência, o detergente catiônico é CTAB.

[0051] De acordo com uma oitava modalidade da invenção, a solução obtida da modalidade acima pode ser submetida à centrifugação e CTAB-polissacarídeo precipitado foi coletado e dissolvido em etanoi 30-64%. A mistura dissolvida pode ser ainda submetida à centrifugação para remoção de resíduos não dissolvidos. [0052] De acordo com uma nona modalidade da invenção, NaCI foi adicionado a uma concentração final de 0,1 M ao sobrenadante obtido da modalidade acima sob agitação constante. O polissacarídeo precipitado foi coletado e dissolvido em NaCI 1M seguido por precipitação com álcool (30-64%).

[0053] De acordo com uma décima modalidade da invenção, a solução obtida da modalidade acima foi diafiltrada extensamente por WFI (Água para injetáveis) utilizando filtração de fluxo tangencial 100 kDa e passada através de um filtro de 0,2 μ e armazenada a ou abaixo de -20 °C como massa final.

[0054] De acordo com a décimo primeira modalidade da invenção, o polissacarídeo capsular purificado de N. meningitidis Sorogrupo C, W e Y foi obtido de acordo com o procedimento abaixo:

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15/38 ® Os sorogrupos C, W e Y de N. meningitidis, respectivamente, foram cultivados em um meio adequado e inativados utilizando formaldeido;

® Dodecil sulfato de sódio foi adicionado à colheita inativada até uma concentração final de 1% e agitados à temperatura ambiente por 2 horas;

® Hidróxido de sódio foi adicionado até uma concentração final de 05-20mM e o pH ajustado para 10,5 com agitação constante à temperatura ambiente por 1 hora;

® A solução obtida da etapa acima foi neutralizada pela adição de ácido orgânico leve, ou seja, ácido acético.

® A essa solução neutralizada, etanol foi adicionado até uma concentração final de 30-35% e incubado por umas duas horas com agitação constante.

® A solução obtida da etapa acima foi centrifugada e o sobrenadante foi coletado.

® KCI a 0,1M foi adicionado ao sobrenadante e incubado a 2-8 °C por não menos de 3 horas.

® A solução obtida da etapa acima foi submetida à centrifugação e o sobrenadante foi coletado. O sobrenadante foi passado através de um filtro de 0,2 μ e o retentado foi diafiltrado utilizando tampão Tris-HCI através de filtração de fluxo tangencial com filtro MWCO de 100kDa.

® Ao retentado obtido na etapa acima, tampão Tris-HCI buffer foi adicionado até uma concentração final de 25 mM; ainda seguido pela adição de CTAB até uma concentração final de 2%; e incubado a RT por não menos de 1 hora.

® A solução obtida da etapa acima foi centrifugada e o precipitado foi coletado e dissolvido em etanol 30-64%. A mistura dissolvida foi ainda submetida à centrifugação para remoção de

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16/38 resíduos não dissolvidos, ® Ao sobrenadante obtido da etapa acima, NaCI foi adicionado até uma concentração final de 0,1-0,3 Μ. O PS precipitado é dissolvido em NaCI 1M seguido por precipitação com álcool 30-64%.

® A solução obtida da etapa acima foi diafiltrada extensivamente contra WFI utilizando filtração de fluxo tangencial 100 kDa e passada através de um filtro de 0,2 μ e armazenada a -20 °C como massa final.

[0055] De acordo com uma décima segunda modalidade da invenção, um processo de purificação, como mencionado na décima primeira modalidade, provê:

® o polissacarídeo de N. meningitidis Sorogrupo C com uma recuperação entre 60-80%, em que o teor de endotoxinas é inferior a 50 EU/mg, o teor de proteínas é inferior a 0,50% e o teor de ácido nucleico inferior a 0,20%.

® o polissacarídeo de N. meningitidis Sorogrupo Y com uma recuperação entre 60-80%, em que o teor de endotoxinas é inferior a 50 EU/mg, o teor de proteínas é inferior a 0,50% e o teor de ácido nucleico inferior a 0,30%.

® o polissacarídeo de /V. meningitidis Sorogrupo W com uma recuperação entre 60-80%, em que o teor de endotoxinas é inferior a 50 EU/mg, o teor de proteínas é inferior a 0,5% e o teor de ácido nucleico Inferior a 0,2%.

[0056] De acordo com uma décima terceira modalidade da invenção, o polissacarídeo capsular purificado de N. meningitidis Sorogrupo A e X foi obtido de acordo com o procedimento abaixo:

® os sorogrupos A e X de N. meningitidis, respectivamente, foram cultivados em um meio adequado e inativados utilizando formaldeído;

® Dodecil sulfato de sódio foi adicionado à colheita inativada

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17/38 até uma concentração final de 1 % e agitado à temperatura ambiente por 2 horas;

® EDTA e acetato de sódio foram adicionados à colheita inativada até uma concentração final de 1% e agitados à temperatura ambiente por 2 horas;

® etanol foi adicionado até uma concentração final de 3035% e incubado por umas duas horas com agitação constante, ® A solução obtida da etapa acima foi centrifugada e o sobrenadante foi coletado, ® KCI a 0,1M foi adicionado ao sobrenadante e incubado a 2-8°C por >3 horas.

® A solução obtida da etapa acima foi submetida à centrifugação e o sobrenadante foi coletado. O sobrenadante foi passado através de um filtro de 0,2 μ e o retentado foi concentrado e diafiltrado utilizando Tris-HCI 25 mM através de filtração de fluxo tangencial IWVCO de 100kDa.

® CTAB foi adicionado até uma concentração final de 1-2%; e incubado a RT por não menos de 1 hora.

® A solução obtida da etapa acima foi centrifugada e o precipitado foi coletado e dissolvido em etanol 30-64%. A mistura dissolvida foi ainda submetida à centrifugação para remoção de resíduos não dissolvidos.

® Ao sobrenadante obtido da etapa acima, NaCI foi adicionado até uma concentração final de 0,1-0,3 Μ. O PS precipitado é dissolvido em NaCI 1M seguido por precipitação com álcool 30-64%.

® A solução obtida da etapa acima foi diafiltrada extensivamente contra WFI utilizando filtração de fluxo tangencial 100 kDa e passada através de um filtro de 0,2 μ e armazenada a ou abaixo de -20 °C como massa final.

[0057] De acordo com uma décima quarta modalidade da invenção,

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18/38 o processo de purificação, como mencionado na décima terceira modalidade, provê:

® o polissacarídeo de N. meningitidis Sorogrupo A com uma recuperação entre 60-80%, em que o teor de endotoxinas é inferior a 50 EU/mg, o teor de proteínas é inferior a 0,50% e o teor de ácido nucleico inferior a 0,20%.

® o polissacarídeo de N. meningitidis Sorogrupo X com uma recuperação entre 60-80%, em que o teor de endotoxinas é inferior a 50 EU/mg, o teor de proteínas é inferior a 0,50% e o teor de ácido nucleico inferior a 0,30%.

[0058] De acordo com uma décima quinta modalidade da invenção, o referido polissacarídeo purificado foi conjugado a uma proteína transportadora. Entende-se muito bem que a proteína transportadora utilizada para conjugação com polissacarídeos pode ser qualquer proteína transportadora conhecida na técnica conforme requerido pelo técnico no assunto. Os exemplos não específicos de proteínas transportadoras incluem a proteína transportadora de um grupo, entre outros, CRM 197, toxoide diftérico, toxoide tetânico, toxoide pertussis, LT de E. coli, ST de E. coli, exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, complexo c da membrana externa (OMPC), porinas, proteínas de ligação da transferrina, pneumolisina, proteína A de superfície pneumocócica (PspA), proteína adesina pneumocócica (PsaA), proteínas de superfície pneumocócica BVH-3 e BVH-11, antígeno protetor (PA) de Bacillus anthracis, fator de edema detoxificado (EF), fator letal (LF) de Bacillus anthracis, ovalbumina, hemocianina do molusco keyhole limpet (KLH), albumina sérica humana, albumina sérica bovina (BSA) e derivado proteico purificado de tuberculina (PPD). [0059] Em outro aspecto da décima quinta modalidade, antes da conjugação, o polissacarídeo purificado pelo método presente foi dimensionado por meio químico ou mecânico, incluindo, entre outros,

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19/38 sonicação, micro-ondas, ozonólise, radiação ionizante, ruptura celular a alta pressão, homogeneizador, microfluidizador, acetato de sódio, metaperiodato de sódio, aquecimento a vácuo etc.

[0060] Em outro aspecto da décima quinta modalidade, o polissacarídeo purificado pelo presente método pode ser conjugado a uma proteína transportadora utilizando aminação redutiva, cianilação, química da conjugação de carbodiimida.

[0061] De acordo com uma décima sexta modalidade da invenção, uma composição imunogênica foi preparada. Uma composição composta por:

(a) um conjugado de (i) o sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo A e (ii) toxoide tetânico;

(b) um conjugado de (i) o sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo C e (ii)CRM197;

(c) um conjugado de (i) o sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo Y e (ii) CRM 197;

(d) um conjugado de (i) o sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo W135 e (ii)CRM197; e (e) um conjugado de (i) o sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo X e (ii)toxoide tetânico.

[0062] De acordo com uma décima sétima modalidade da invenção, o teor de endotoxinas pode ser medido pelo Ensaio Cinético Turbimétrico do Teste de Endotoxinas bacterianas (KTA) ou Teste de pirogenicidade em coelhos; o teor de proteínas pode ser medido pelo método de Lowry; e o teor de ácido nucleico pode ser medido por espectrofotometria. Entende-se muito bem que qualquer outro método adequado pode ser utilizado para quantificação de endotoxina, proteínas e teor de ácido nucleico.

[0063] Em outro aspecto da décima sétima modalidade, a distribuição do tamanho molecular do polissacarídeo purificado de

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Neisseria meningitidis sorogrupo A, C, W, Ye X pode ser realizada por cromatografia líquida de alta eficiência de exclusão por tamanho.

[0064] Em outro aspecto da décima sexta modalidade, o teor de Oacetila pode ser medido utilizando o ensaio colorimétrico de Hestrin. Exemplos:

Exemplo 1: Produção de polissacarídeos bacterianos (Processo a montante de N. meningitidis Sorogrupo C)

[0065] Utilizando o processo de fermentação mencionado abaixo, foram produzidos polissacarídeos.

Escala de fermentação: 300 litros

[0066] ® Realizaram-se limpeza no lugar (Cleaning in place, CIP), teste de desempenho de pressão e esterilização no lugar (Sterilization in place, SIP) do fermentador.

[0067] ® Depois de concluída a SIP, o meio de fermentação estéril foi transferido assepticamente para o fermentador.

[0068] ® Meio da composição

Meio de fermentação do Sorogrupo C

Tabela 3

Ingrediente	Quantidade (g/L)
D-glicose mono-hidratada	10
Cloreto de sódio	5,8
L-arginina	1
L-serina	1
Cloreto de cálcio	0,028
Sulfato de ferro (II) hepta-hidratado	0,01
Cloreto de amônio	0,3
Hidrogenofosfato dipotássico	4
Extrato de leveduras	5
Cloreto de magnésio	0,4
Peptona de soja	3

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Ingrediente	Quantidade (g/L)
Casaminoácidos	5
L-glutamato de sódio mono-hidratado	10
Sulfato de amônio	1,2
L-cistina	0,3

Meio de alimentação de Sorogrupo C

Tabela 4

Ingrediente	Quantidade (g/L)
D-glicose mono-hidratada	200
L-glutamato de sódio mono-hidratado	150
Casaminoácidos	4
Cloreto de amônio	0,2

[0069] ® O nível de oxigênio dissolvido foi ajustado para os níveis desejados.

[0070] ® O meio de fermentação foi inoculado com o organismo da cultura. O fermentadorfoi operado no modo de alimentação em batelada por 11 a 14 horas.

[0071] ® Após a cultura atingir a OD desejada a 590 nm, a cultura no fermentadorfoi inativada utilizando formaldeído.

[0072] ® Depois de concluída a incubação, a temperatura foi definida em 10 ± 5°C e seguida pela separação celular utilizando centrifugação.

[0073] ® O sobrenadante foi coletado e submetido à filtração profunda, a colheita clarificada foi passada através de um filtro de 0,2 μ e transferida para purificação.

Resultados:

Tabela 5

Parâmetro	Men-C
Rendimento total de PS da colheita (mg/L)	703,33
Impureza de endotoxina (EU/mg de PS)	>500

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Impureza proteica (%)	109
Impureza de ácido nucleico (%)	12,3

Exemplo 2: Produção de polissacarídeos capsulares (Processo a montante de N. meningitidis Sorogrupo A, W, X e Y)

[0074] Usando o protocolo mencionado no Exemplo 1, o polissacarídeo capsular de N. meningitidis Sorogrupo A, W, X e Y foi produzido.

Meio de fermentação do sorogrupo Y

Tabela 6

Ingrediente	Quantidade (g/L)
D-glicose mono-hidratada	10
Cloreto de sódio	5,8
Sulfato de potássio	1
L-arginina	0,75
L-serina	0,75
L-cisteína	0,4
Cloreto de cálcio	0,025
Sulfato de ferro (II) hepta-hidratado	0,01
Cloreto de amônio	0,15
Hidrogenofosfato dipotássico	4
Extrato de levedura	3
Cloreto de magnésio	0,3
Peptona de soja	3
Casaminoácido	5
Cloridrato de tiamina	0,05
L-glutamato de sódio mono-hidratado	10
L-Triptofano	0,2

Meio de alimentação do sorogrupo Y

Tabela 7

Ingrediente	Quantidade (g/L)
D-glicose mono-hidratada	200
L-glutamato de sódio mono-hidratado	150

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L-arginina	1
L-serina	1
Peptona de soja	10
Extrato de leveduras	16,6

Meio de fermentação do sorogrupo W

Tabela 8

Ingrediente	Quantidade (g/L)
D-glicose mono-hidratada	10
Cloreto de sódio	5,8
Sulfato de potássio	1
L-arginina	0,75
L-serina	0,75
L-cisteína	0,4
Cloreto de cálcio	0,025
Suifato de ferro (II) hepta-hidratado	0,01
Cloreto de amônio	0,25
Hidrogenofosfato dipotássico	4
Extrato de levedura	3
Cloreto de magnésio	0,3
Peptona de soja	3
Casaminoácido	5
Cloridrato de tiamina	0,05
L-glutamato de sódio mono-hidratado	10

Meio de alimentação do sorogrupo W

Tabela 9

Ingrediente	Quantidade (g/L)
D-glicose mono-hidratada	200
L-glutamato de sódio mono-hidratado	150
L-arginina	4

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L-serina	4
Peptona de soja	4
Extrato de levedura	4
Cloreto de magnésio	1,6
Cloreto de cálcio	0,2
Cloreto de amônio	0,8

Resultados:

Tabela 10

Parâmetro	Men-A	Men-X	Men-W	Men-Y
PS bruto (mg/L)	2540	1024	733	1205
Endotoxina (EU/pg de PS)	>500	>500	>500	>500
Proteína (%)	19,31	18,2	60,5	38
Ácido nuclelco (%)	1,2	1,16	12	3,3

Ό075] Na colheita clarificada obtida, quando do teste, foi observado o teor de PS (Polissacarídeo) de 1-6 g/L. Essa colheita clarificada foi submetida à purificação adicional.

Exemplo 3: Purificação de polissacarídeos capsulares (Processo a jusante de N. meningitidis Sorogrupo C) utilizando SDS seguido por precipitação com álcool

[0076] O polissacarídeo bruto obtido segundo o Exemplo 1 foi misturado com concentrações variadas de SDS. Etanol foi então adicionado até uma concentração final que é aproximadamente 10% abaixo da concentração à qual o polissacarídeo começa a precipitar. Este foi ainda submetido à filtração.

[0077] Concentração testada de SDS: 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%,6%,7%,8%,9% e 10%

[0078] Todas as concentrações mencionadas acima de SDS mostraram eficácia em relação à redução de impurezas. Em SDS acima de 4%, não foi observada diferença significativa no perfil de impurezas. [0079] A redução ótima de impurezas, especialmente de proteínas,

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25/38 foi observada em SDS 1%,

[0080] O polissacarídeo purificado apresentava impurezas de endotoxinas >100 EU/pg do polissacarídeo, enquanto que o limite da OMS é <100 EU/pg de polissacarídeo.

Exemplo 4: Purificação de polissacarídeos capsulares (Processo a jusante de N. meningitidis Sorogrupo C) Protocolo:

[0081 ] Dois conjuntos diferentes de experimentos foram realizados, escala de fermentação de 5 litros e de 300 litros.

[0082] Utilizando o processo de purificação mencionado abaixo, os polissacarídeos foram purificados.

[0083] ® O polissacarídeo bruto, obtido segundo o Exemplo 1, foi colocado em um vaso.

[0084] ® O polissacarídeo bruto foi concentrado 3-6 vezes por TFF utilizando um cassete de 100 kDa.

[0085] ® Dodecil sulfato de sódio foi adicionado à colheita inativada até uma concentração final de 1 % e agitado à temperatura ambiente por 2 horas;

[0086] ® Hidróxido de sódio foi adicionado até uma concentração final de 08-20mM e o pH ajustado para 10,5 com agitação constante à temperatura ambiente por 1 hora;

[0087] ® A solução obtida da etapa acima foi neutralizada pela adição de ácido acético.

[0088] ® A essa solução neutralizada, etanol foi adicionado até uma concentração final de 33% e incubado por umas duas horas com agitação constante.

[0089] ® A solução obtida da etapa acima foi centrifugada e o sobrenadante foi coletado.

[0090] ® A concentração de etanol foi aumentada para 40%.

[0091] ® KOI a 0,1M foi adicionado ao sobrenadante e incubado a

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2-8 °C por não menos de 3 horas.

[0092] ® A solução obtida da etapa acima foi submetida à centrifugação e o sobrenadante foi coletado. O polissacarídeo foi precipitado aumentando a concentração final de etanol para 65%.

[0093] ® O pélete do polissacarídeo foi dissolvido em NaCI 1M. O sobrenadante foi passado através de um filtro de 0,2 μ e o retentado foi diafiltrado com tampão Tris-HCI 25 mM através de filtração de fluxo tangencial de 100, para obter o polissacarídeo purificado (Estágio I).

[0094] ® Adição de CTAB até uma concentração final de 2%; e incubação a RT por 1 hora.

[0095] ® A solução obtida da etapa acima foi centrifugada e o precipitado foi coletado e dissolvido em etanol 96%. A mistura dissolvida foi ainda submetida à centrifugação para remoção de resíduos não dissolvidos.

[0096] ® Ao sobrenadante obtido da etapa acima, NaCI foi adicionado até uma concentração finai de 0,2 Μ. O PS precipitado é dissolvido em NaC11M seguido por precipitação do PS com álcool 65%. [0097] ® A solução obtida da etapa acima foi diafiltrada extensivamente contra NaCI 0,5M, seguido por WFI utilizando filtração de fluxo tangencial 100 kD e foi passada através de um filtro de 0,2 μ e armazenada a ~20°C como massa final.

Resultados:

Tabela 11

N. meningitidis Sorogrupo C	Polissacarídeo bruto da colheita	Polissacarídeo purificado Estágio I	Polissacarídeo purificado Estágio II
Escala de fermentação	5 L	300 L	5 L	300 L	5 L	300 L
Volume de PS	1	50	0,65	30	0,6	18
Concentração de PS (mg/mL)	3,87	4,22	3,83	5,62	3,08	7,33
PS total (gramas)	3,87	211	2,48	168	1,84	131,94

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N. meningitidis Sorogrupo C	Polissacarídeo bruto da colheita	Polissacarídeo purificado Estágio I	Polissacarídeo purificado Estágio II
Impureza proteica (%)	93,79	109,47	0,6	0,52	0,25	0,13
Impureza de ácido nucleico (%)	7,49	12,32	0,02	0,3	0,02	0,08
Impureza de endotoxina (EU/pg de PS)	NA	NA	<20	<30	<20	40
Recuperação da etapa (%)	NA	NA	64,3	79,9	74,23	78,25
Tamanho molecular por HPLC (kDa)	NA	NA	434	450	392	376
Teor de O-acetila Limite: >1,5 mMol/g	NA	NA	2,8	2,85	2,64	2,6
Recuperação final global (%)	NA	NA	64,3	79,9	64	62,5

Observação: ΝΑ = Não aplicável

[0098] Dois conjuntos diferentes de experimentos foram realizados, escala de fermentação de 5 litros e 300 litros.

[0099] Foi observado que o uso combinado de detergente aniônico e alcalino teve um efeito profundo sobre a redução do perfil de impurezas. O nível de impurezas no estágio I e estágio II da purificação fica bem abaixo da especificação da OMS para polissacarídeo Men-C.

[0100] Na escala de 5 litros e 300 litros, impureza proteica (%) = <1%; impureza de ácido nucleico (%) ·· <0,3%; impureza de (EU/pg de PS) = <40 EU/pg de PS.

[0101] Nas duas escalas e no estágio I e estágio II da purificação, a recuperação do polissacarídeo purificado foi acima de 60% em comparação com a amostra bruta.

Exemplo 5: Purificação de polissacarídeos capsulares (Processo a jusante de N. meningitidis Sorogrupo W e Y) Protocolo:

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[0102] Dois conjuntos diferentes de experimentos foram conduzidos, escala de fermentação de 5 litros e 300 litros.

[0103] Utilizando o processo de purificação mencionado abaixo, os polissacarídeos foram purificados.

[0104] ® O polissacarideo bruto, obtido segundo o Exemplo 2, foi colocado em um vaso.

[0105] ® o polissacarideo bruto foi concentrado 3-6 vezes por TFF utilizando um cassete de 100 kDa.

[0106] ® Dodecil sulfato de sódio foi adicionado à colheita inativada até uma concentração final de 1 % e agitado à temperatura ambiente por 2 horas;

[0107] ® Hidróxido de sódio foi adicionado até uma concentração final de 08-20mM e o pH ajustado para 10,5 com agitação constante à temperatura ambiente por 1 hora;

[0108] ® A solução obtida da etapa acima foi neutralizada pela adição de ácido acético.

[0109] ® A essa solução neutralizada, etanol foi adicionado até uma concentração final de 33% e incubado por umas duas horas com agitação constante.

[0110] ® A solução obtida da etapa acima foi centrifugada e o sobrenadante foi coletado.

[0111] ® KCI a 0,1M foi adicionado ao sobrenadante e incubado a

2-8 °C por -'8 horas.

[0112] ® A solução obtida da etapa acima foi submetida à centrifugação e o sobrenadante foi coletado.

[0113] ® O sobrenadante foi passado através de um filtro de 0,2 μ e o retentado foi diafiltrado utilizando tampão Tris-HCI 25 mM através de filtração de filtro tangencial de 100 kDa, para obter o polissacarideo purificado (Estágio I).

[0114] ® Adição de CTAB até uma concentração final de 2%; e

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29/38 incubação a RT por 1 hora.

[0115] ® A solução obtida da etapa acima foi centrifugada e o precipitado foi coletado e dissolvido em etanol 96%. A mistura dissolvida foi ainda submetida à centrifugação para remoção de resíduos não dissolvidos.

[0116] ® Ao sobrenadante obtido da etapa acima, NaCI foi adicionado até uma concentração final de 0,25M. O PS precipitado é dissolvido em NaC11M seguido por precipitação do PS com álcool 65%. [0117] ® A solução obtida da etapa acima foi diafiltrada extensivamente contra WFI utilizando filtração de fluxo tangencial 100 kDa e passada através de um filtro de 0,2 μ e armazenada a -20 °C como massa final (Estágio II).

Resultado:

Tabela 12

Λ/. meningitidis Sorogrupo Y	Polissacarídeo bruto da colheita	Polissacarídeo purificado do Estágio I	Polissac purifica Estác	.arídeo do do io II
Escala de fermentação	5 L	300 L	5 L	300 L	5 L	300 L
Volume de PS	1,25	50	0,75	35	0,8	29,5
Concentração de PS (mg/mL)	5,67	7,23	7,23	7,88	5,39	8,41
PS total (gramas)	7,08	361,5	5,42	275,8	4,31	248
Impureza proteica (%)	38,62	38,03	2,21	1,64	0,16	0,08
Impureza de ácido nucleico (%)	1,94	3,31	0,69	0,25	0,11	0,71
Impureza de endotoxina (EU/pg de PS)	NA	NA	50	56	44	45
Recuperação da etapa (%)	NA	NA	76,50	76,29	79,52	89,95
Tamanho molecular por HPLC (kDa)	NA	NA	660	620	608	543

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N. meningitidis Sorogrupo Y	Polissacarídeo bruto da colheita	Polissacarídeo purificado do Estágio 1	Polissacarídeo purificado do Estágio II
Teor de O-acetila Limite: >0,3 íTíMol/g	NA	NA	0,85	0,8	0,79	0,75
Recuperação final global (%)	NA	NA	76,50	76,29	60,83	68,62

Tabela 13

N. meningitidis Sorogrupo W	Polissacarídeo bruto da colheita	Polissacarídeo purificado do Estágio I	Polissac purifica Estáç	arídeo do do io II
Escala de fermentação	5 L	300 L	5 L	300 L	5 L	300 L
Volume de PS	1	39	0,8	28,5	0,8	16,5
Concentração de PS (mg/mL)	4,26	5,65	3,5	6,01	3,25	8,75
PS total (Gramas)	4,26	220	2,8	171	2,6	144
Impureza proteica (%)	62,1	60,53	3,4	2,16	<0,21	<0,21
Impureza de ácido nucleico (%)	7,98	12	0,85	1,16	0,1	0,09
Impureza de endotoxina (EU/pg de PS)	NA	NA	<30	<40	<20	<10
Recuperação da etapa (%)	NA	NA	65	77	92	84,2
Tamanho molecular por HPLC (kDa)	NA	NA	400	420	395	380
Teor de O-acetila Limite: >0,3 mMol/g	NA	NA	1,21	1,15	1,05	0,99
Recuperação final global (%)	NA	NA	65	77	61	65,4
0118] Dois conjuntos diferen	tes de experimentos foram

conduzidos, escala de fermentação de 5 litros e 300 litros.

[0119] Em comparação, foi observado que o nível de impurezas no estágio I e estágio II de purificação estão bem abaixo dos limites da especificação da OMS para polissacarídeo Men-Y e Men-W.

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[0120] Observou-se que o uso combinado de detergente aniônico e alcalino teve efeito profundo sobre a redução do perfil de impurezas. O nível de impurezas no estágio I e estágio II de purificação estão bem abaixo dos limites da especificação da OMS para polissacarídeo MenC.

[0121] Na escala de 5 L e 300L, Impureza de proteína (%) = <3,5%; Impureza de ácido nucleico (%) · <1,5%; Impureza de endotoxina (EU/pg de PS) = <60EU/pg de PS.

[0122] Nas duas escalas e no estágio I e estágio II de purificação, a recuperação de polissacarídeo purificado ficou acima de 60% em comparação com a amostra bruta.

Exemplo 6: Purificação of polissacarídeos capsulares (Processo a jusante de N. meningitidis Sorogrupo A e X) Protocolo:

[0123] Dois conjuntos diferentes de experimentos foram conduzidos, escala de fermentação de 5 litros e 300 litros.

[0124] Utilizando o processo de purificação mencionado abaixo, os polissacarídeos foram purificados.

[0125] ® O polissacarídeo bruto, obtido segundo o Exemplo 2, foi colocado em um vaso.

[0126] ® O polissacarídeo bruto foi concentrado 3-6 vezes por TFF utilizando um cassete de 100 kDa.

[0127] ® Dodecil sulfato de sódio foi adicionado à colheita inativada até uma concentração final de 1 % e agitado à temperatura ambiente por 2 horas;

[0128] ® Acetato de sódio, EDTA e dodecil sulfato de sódio foram adicionados até uma concentração final de 6%, 2 mM e 1% respectivamente; com agitação constante à temperatura ambiente por 1 hora;

[0129] ® A solução obtida da etapa acima foi centrifugada e o

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32/38 sobrenadante foi coletado.

[0130] ® KCI a 0,1M foi adicionado ao sobrenadante e incubado a

2-8 °C por horas.

[0131] ® A solução obtida da etapa acima foi submetida à centrifugação e o sobrenadante foi coletado.

[0132] ® O sobrenadante foi passado através de um filtro de 0,2 μ e o retentado foi diafiltrado utilizando tampão Tris-HCI 25 mM através de filtração de fluxo tangencial de 100 kDa, para obter o polissacarídeo purificado (estágio I).

[0133] ® Adição de CTAB até uma concentração final de 2%; e incubação a RT por 1 hora.

[0134] ® A solução obtida da etapa acima foi centrifugada e o precipitado foi coletado e dissolvido em etanol 96%. A mistura dissolvida foi ainda submetida à centrifugação para remoção de resíduos não dissolvidos.

[0135] ® Ao sobrenadante obtido da etapa acima, NaCI foi adicionado até uma concentração final de 0,2M. O PS precipitado é dissolvido em NaCI 1M seguido por precipitação com álcool 65%.

[0136] ® A solução obtida da etapa acima foi diafiltrada extensivamente contra WFI utilizando filtração de fluxo tangencial de 100 kD e passada através de um filtro de 0,2 μ e armazenada a -20 °C como massa final (estágio II).

Resultados:

Tabela 14

N. meningitidis Sorogrupo A	PS da colheita bruta	Polissacarídeo purificado do Estágio I	Polissacarídeo purificado do Estágio II
Escala de fermentação	300 L	300 L	300 L
Volume de PS	50	45	30
Concentração de PS (mg/mL)	11,44	6,63	9,75
PS total (gramas)	572	298,35	292,5

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Λ/. meningitidis Sorogrupo A	PS da colheita bruta	Polissacarídeo purificado do Estágio I	Polissacarídeo purificado do Estágio II
Impureza proteica (%)	19,31	2,05	0,14
Impureza de ácido nucleico (%)	1,22	0,12	0,05
Impureza de endotoxina (EU/pg de PS)	NA	29,08	35
SDS Residual (ppm)	NA	<5	<5
Recuperação da etapa (%)	NA	52	98
Tamanho molecular por HPLC (kDa)	NA	350	306
Teor de O-acetila Limite: >2 mMol/g	NA	2,69	2,65
Recuperação final global (%)	NA	52	51

Tabela 15

Λ/. meningitidis Sorogrupo X	PS da colheita bruta	Polissacarídeo purificado do Estágio I	Polissacarídeo purificado do Estágio II
Escala de fermentação	300 L	300 L	300 L
Volume de PS	55	40	30
Concentração de PS (mg/mL)	5,05	5,23	6,21
PS total (gramas)	277,75	209,2	186,30
Impureza proteica (%)	18,21	0,6	0,54
Impureza de ácido nucleico (%)	1,16	0,76	0,14
Impureza de endotoxina (EU/pg de PS)	NA	30	13,79
SDS Residual (ppm)	NA	<5	<5
Recuperação da etapa (%)	NA	75,3	88,9
Tamanho molecular por HPLC (kDa)	NA	485	479
Recuperação final global (%)	NA	75,3	67,25

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[0137] Em comparação, foi observado que o nível de impurezas no estágio I e estágio II de purificação estão bem abaixo dos limites da especificação da OMS para polissacarídeo Men-A e Men-X.

[0138] Observou-se que o uso de detergente aniônico teve um efeito profundo sobre a redução do perfil de impurezas. O nível de impurezas no estágio I e estágio II de purificação estão bem acima dos limites da especificação da OMS para polissacarídeo Men-A e Men-X. [0139] Na escala de 300 L, Impureza proteica (%) = <2,5%; Impureza de ácido nucleico (%) ™ <1%; Impureza de endotoxina (EU/pg de PS) = <40 EU/pg de PS.

[0140] Nas duas escalas e no estágio I e estágio II de purificação, a recuperação do polissacarídeo purificado do sorogrupo X ficou acima de 60% e do polissacarídeo purificado sorogrupo A ficou acima de 50%, em comparação com a amostra bruta.

Exemplo 7: Integridade estrutural dos polissacarídeos isolados (PS) [0141] Consultar a Figura 1 - 5 para os espectros de RMN.

[0142] A integridade estrutural dos polissacarídeos isolados de N. meningitidis sorogrupo A, C, W, Y e X foi verificada utilizando ressonância magnética nuclear (RMN).

[0143] Os espectros registrados de RMN foram comparáveis e confirmaram as suas identidades como polissacarídeo meningocócico do sorogrupo A, C, W, e Y parcialmente O-acetilado; e polissacarídeo do sorogrupo X N-acetilado.

Exemplo 8:

Análise comparativa do processo de purificação com base em desoxicolato de sódio (DOC) e o processo reivindicado para purificação de polissacarídeos

[0144] O processo com base em desoxicolato de sódio (DOC) An improved method for meningococcus polysaccharide purification Tanizaki et al (Conjugate and Polysaccharide Vaccines, Poster 79,

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35/38 http://neisseria.0rg/ipnc/1996/Neis 1996-chap4.pdf) foi aperfeiçoado como segue:

[0145] Colheita 100 kD; tratamento com DOC + EDTA + NaOAc + etanol (40%); Centrifugação, coleta do sobrenadante e filtração por 0,2 μ; Concentração e Diafiltração; tratamento com CTAB (3%) a RT; Centrifugação e coleta do pélete CTAB-PS; Dissolução do pélete CTABPS em etanol 96% e precipitação por NaCI 0,1 M; Dissolução do precipitado em etanol 40% e adição de NaC11 M (2-8 °C); Centrifugação e coleta do sobrenadante; Filtração em carvão; Precipitação de PS aumentando a concentração de etanol; Dissolução do pélete de PS em WFI e concentração e diafiltração com WFI e armazenamento a -20 °C após filtração por 0,2 μ.

[0146] O processo com base em DOC é amplamente utilizado na indústria para purificação de polissacarídeos a serem usados como antígeno vacinai.

[0147] O perfil de impurezas do polissacarídeo obtido pelo método com base em DOC foi comparado com o do processa inventivo reivindicado.

Resultados:

Tabela 16

		% de recuperação final	% de proteína	% de ácido nucleico	Endotoxina (EU/pg de PS)
Men-A	DOC	65	<0,3	<0,2	<20
SDS	64	<0,3	<0,2	<20
Men-C	DOC	65	<0,3	<0,2	<20
SDS	62,00	<0,3	<0,2	<20
Men-W	DOC	60	<0,5	<0,5	<30
SDS	70	<0,5	<0,5	<30
IVIen-Y	DOC	60	<0,5	<0,5	<30
SDS	70	<0,5	<0,5	<30
Men-X	DOC	65	<0,3	<0,2	<20
SDS	70	<0,3	<0,2	<20

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[0148] O método da invenção com base em SDS e o método com base em DOC mostraram resultados similares para o sorogrupo A e C, enquanto que, para o sorogrupo W, Y e X, o método com SDS mostrou recuperação final melhorada quando comparado ao método com DOC. [0149] Tal como visto pelos resultados acima, o processo modificado com SDS possui vantagens nítidas em termos de facilidade de operação bem como diversas outras vantagens tais como, DOC sendo um componente de origem animal e não conforme com HALAL. DOC é fabricado e produzido por um único fornecedor em todo o mundo, enquanto que SDS é um detergente sintético, com certificação HALAL e com diversos fornecedores disponíveis em nívei mundial. DOC decompõe as endotoxinas sem afetar a composição química e, assim que o detergente é removido, as endotoxinas podem readquirir a sua atividade biológica, enquanto que SDS, graças à sua natureza anfipática e maior número de agregação, desnatura e solubiliza as proteínas bem e também rompe as endotoxinas irreversivelmente em suas unidades monoméricas.

[0150] Utilizando SDS, um consumo diminuído de produtos químicos e consumíveis (etanoi, ultrafiltros, filtros de carvão etc.) oferece uma vantagem distinta. Além disso, o uso de SDS como uma substituição foi não invasivo sobre a integridade estrutural dos polissacarídeos.

Exemplo 9

[0151] Uma composição imunogênica como mostrada abaixo foi preparada e teve a imunogenicidade testada.

[0152] A composição compreendia:

(a) um conjugado de (i) sacarídeo capsuiar de Neisseria meningitidis sorogrupo A e (ii) toxoide tetânico;

(b) um conjugado de (i) sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo C e (ii) CRM197;

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37/38 (c) um conjugado de (i) sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo Y e (ii) CRM 197:

(d) um conjugado de (i) sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo W135 e (ii)CRM 197; e (e) um conjugado de (i) sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo X e (íi)toxoide tetâníco.

Resultados:

[0153] A composição ímunogênica demonstrou ser imunogênica.

Vantagens da invenção

[0154] O processo resulta na redução significativa de impurezas de endotoxinas, proteínas e ácidos nucleicos, proporcionando, assim, maior recuperação do polissacarídeo capsular com os níveis desejados de O-acetila. Tal como pode ser visto pelos resultados acima, o processo reivindicado possui vantagens nítidas em termos de facilidade de operação, bem como diversas outras vantagens como, > Questão regulatória: DOC é um componente de origem animal e não conforme com HALAL. É fabricado e fornecido por um único fornecedor em todo o mundo, enquanto que SDS é um detergente sintético, com certificação HALAL e com diversos fornecedores disponíveis em nível mundial.

> Questão funcional: DOC decompõe as endotoxinas sem afetar a composição química e, assim que o detergente é removido, elas podem readquirir a sua atividade biológica, enquanto que SDS, graças à sua natureza antipática e maior número de agregação, desnatura e solubiliza as proteínas bem e também rompe as endotoxinas irreversivelmente em suas unidades monoméricas.

> Com o uso de SDS, um consumo diminuído de produtos químicos e consumíveis (etanol, ultrafiltros, filtros de carvão etc.) foi uma vantagem distinta.

> O processo inventivo do presente pedido de

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38/38 patente resulta na diminuição significativa de outras impurezas celulares. Além disso, o processo permite a remoção eficaz dos reagentes utilizados durante o processamento upstream (a montante) e downstream.

> Adicionalmente, o processo inventivo do presente pedido de patente foi não invasivo sobre a integridade estrutural dos polissacarídeos, mantendo, assim, a sua imunogenicidade.

[0155] Em vista das muitas possíveis modalidades às quais os princípios da invenção revelada podem ser aplicados, deve-se reconhecer que as modalidades ilustradas são somente exemplos preferidos da invenção e não devem ser considerados como limitações ao âmbito da invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para isolamento de polissacarídeo de uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:

a) misturar uma solução do polissacarídeo bruto com um detergente aniônico;

b) adicionar um alcalino à solução:

c) neutralizar o pH da solução;

d) submeter a solução à precipitação com base em álcool, seguida por centrifugação e retenção do sobrenadante;

e) remover o detergente presente no sobrenadante;

f) concentrar e diafiltrar o polissacarídeo;

em que o polissacarídeo purificado obtido apresenta 60-80% de recuperação; níveis ótimos de O-acetilação e níveis mínimos de impurezas compreendendo endotoxinas, proteínas e ácido nucleico.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda as seguintes etapas:

g) misturar a solução do polissacarídeo com detergente catiônico;

h) submeter a solução à centrifugação e coleta do pélete;

i) dissolver o pélete em álcool, seguido por precipitação com base em sal dos polissacarídeos.
3. Detergente aniônico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é selecionado a partir do grupo que compreende sulfatos de alquila, dodecil sulfato de sódio, desoxicolato de sódio, dodecil sulfonato de sódio, s-alquil sulfatos de sódio, sulfatos de sódio de éter de polioxietileno de álcool graxo, oleil sulfato de sódio, N-oleoil poli(aminoácido) sódico, alquilbenzenossulfonatos de sódio, alfa-olefina sulfonatos de sódio, alquil sulfonatos de sódio, ésteres do ácido alfa-sulfomonocarboxílico, sulfoalquil ésteres de ácidos graxos,

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2/10 succinato sulfonato, naftaienossulfonatos de alquila, aicano sulfonatos de sódio, ligninassulfonato de sódio e alquil gliceril éter sulfonatos de sódio.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o detergente aniônico é dodecil sulfato de sódio (SDS).
5. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a concentração final de detergente aniônico (SDS) na solução está na faixa de 0,1-4,0%. de preferência inferior a 1%.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o alcalino é selecionado a partir do grupo que consiste em hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, carbonato de sódio, hidroxilamina, trietilamina e hidróxido de lítio.
7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o alcalino é hidróxido de sódio.
8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a concentração final do alcalino na solução está na faixa de 5-50 mM, de preferência na faixa de 5-20 mM e mais preferivelmente na faixa de 8-15 mM.
9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pH da solução após a adição do alcalino está na faixa de pH 9-11, de preferência pH 10,5.
10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a solução é neutralizada (pH 7,0) pela adição de um ácido orgânico leve.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o ácido orgânico leve é um dentre ácido fórmico, ácido acético, ácido propiônico, ácido oxáiico; de preferência ácido acético.
12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a remoção de detergente é realizada utilizando pelo menos um ou mais de tratamento com sal de potássio, filtração em gel,

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3/10 tratamento com etanol e resinas de troca iônica/colunas Amberlite.
13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a remoção de detergente é realizada por precipitação do detergente utilizando sal de potássio.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o sal de potássio é um dentre cloreto de potássio, acetato de potássio, sulfato de potássio, carbonato de potássio, bicarbonato de potássio, bicarbonate de potássio, fosfato de potássio, hidrogenofosfato de potássio, di-hidrogenofosfato de potássio, nitrato de potássio e outros sais de potássio, ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o sal de potássio é cloreto de potássio.
16. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a concentração final do sal de potássio na solução é maior ou igual à concentração à qual o tensoativo aniônico é suficientemente precipitado.
17. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a concentração final do sal de potássio na solução é inferior a 300 mM, de preferência 100 mM.
18. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polissacarídeo é derivado de uma fonte biológica.
19. Método de acordo com as reivindicações 1 e 18, caracterizado pelo fato de que o polissacarídeo é derivado de uma bactéria Gram-negativa.
20. Método de acordo com as reivindicações 1 e 18, caracterizado pelo fato de que o polissacarídeo é um polímeros de resíduos de ácido siálico.
21. Método de acordo com as reivindicações 1 e 18 a 20, caracterizado pelo fato de que o polissacarídeo é derivado de Neisseria

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4/10 meningitidis.
22. Método de acordo com as reivindicações 1 e 18 a 21, caracterizado pelo fato de que o polissacarídeo é derivado de Neisseria meningitidis sorotipo B, Neisseria meningitidis sorotipo C, Neisseria meningitidis sorotipo W e Neisseria meningitidis sorotipo Y.
23. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o(s) detergente(s) catiônico(s) é/são um dentre sal de cetiltrimetilamônio, sal de tetrabutilamônio, sal de miristiltrimetilamônio e brometo de hexadimetrina; ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos.
24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o(s) detergente(s) catiônico(s) é/são brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB).
25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a concentração de detergente(s) catiônico(s) é inferior a 3%, de preferência 1%.
26. Método de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de que o álcool é um álcool hidrofílico.
27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o álcool hidrofílico é um dentre metanol, etanol, álcool n-propílico, álcool isopropílico, acetona e álcool t-butílico; ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos; e sua concentração é <65% ou >95%.
28. Método de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de que o álcool é etanol.
29. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a concentração e diafiltração do polissacarídeo é realizada utilizando filtração de fluxo tangencial com membrana MWCO de 100 kDa.
30. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado

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5/10 pelo fato de que o sal utilizado para precipitação é um dentre cloreto de sódio, cloreto de amônio, cloreto de potássio ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos.
31. Método de acordo com as reivindicações 2 e 30, caracterizado pelo fato de que o sal utilizado para precipitação é cloreto de sódio.
32. Método de acordo com as reivindicações 2 e 30 a 31, caracterizado pelo fato de que a concentração de sal está na faixa de 0,25M a 2M.
33. Método para isolamento de polissacarideo, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:

a) misturar a solução do polissacarideo bruto com detergente aniônico;

b) adicionar EDTA e acetato de sódio à solução;

c) submeter a solução à precipitação com álcool, seguida por centrifugação e retenção do sobrenadante;

d) remover o detergente presente no sobrenadante;

e) concentrar e diafiltrar o polissacarideo bacteriano;

em que, o polissacarideo purificado obtido tem 60-80% de recuperação; perfil ótimo de O-acetilação e impurezas mínimas compreendendo endotoxinas, proteínas e ácido nucleico.
34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda as seguintes etapas:

a) misturar a solução do polissacarideo bacteriano com detergente catiônico;

b) submeter a solução à centrifugação e coletar o pélete;

c) dissolver o pélete em álcool, seguido por precipitação com base em sal.
35. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o detergente é um detergente aniônico.

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6/10
36. Detergente aniônico como definido na reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o detergente aniônico é um dentre sulfatos de alquila, dodecil sulfato de sódio, desoxicolato de sódio, dodecil sulfonato de sódio, s-alquil sulfatos de sódio, sulfatos de sódio de éter de polioxietileno de álcool graxo, oleil sulfato de sódio, N-oleoil poli(aminoácido) sódico, alquilbenzenossulfonatos de sódio, alfa-olefina sulfonatos de sódio, alquil sulfonatos de sódio, ésteres de ácido alfasulfomonocarboxílico, sulfoalquil ésteres de ácido graxo, succinato sulfonato, naftalenossulfonatos de alquila, alcano sulfonatos de sódio, ligninassulfonato de sódio, alquil gliceril éter sulfonatos de sódio e outros detergentes aniônicos ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos.
37. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o detergente aniônico é dodecil sulfato de sódio (SDS).
38. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a concentração final de dodecil sulfato de sódio (SDS) está na faixa de 0,1-4,0%, de preferência inferior a 1 %.
39. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que a remoção de detergente é realizada utilizando pelo menos um ou mais dentre tratamento com sal de potássio, filtração em gel, tratamento com etanol e resinas de troca iônica/colunas Amberlite.
40. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que a remoção de detergente é realizada por precipitação do detergente utilizando sal de potássio.
41. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que a concentração final do sal de potássio na solução é maior ou igual à concentração à qual o tensoativo aniônico é suficientemente precipitado.
42. Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o sal de potássio é um dentre cloreto de potássio,

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7/10 acetato de potássio, sulfato de potássio, carbonato de potássio, bicarbonato de potássio, fosfato de potássio, hidrogenofosfato de potássio, di-hidrogenofosfato de potássio, nitrato de potássio e outros sais de potássio, ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos.
43. Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o(s) detergente(s) catiônico(s) é/são um dentre sal de cetiltrimetilamônio, sal de tetrabutilamônio, sal de miristiltrimetilamônio e brometo de hexadimetrina; ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos.
44. Método de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o(s) detergente(s) catíôníco(s) é/são brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB).
45. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a concentração final de CTAB está na faixa de 0,53,0%, de preferência inferior a 1%.
46. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o polissacarídeo é derivado do grupo que consiste em Helicobacter pylori, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma pneumoniae, Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus spp., Streptococcus Grupo A, Streptococcus Grupo B la, lb, II, III, V, VI, ou VIII; Streptococcus Grupo C, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus viridans, Enterococcus faecalis, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Bacillus anthracis, Salmonella spp., Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Vibrio cholerae, Pasteurella pestis, Pseudomonas aeruginosa, Campylobacter spp., Campylobacter jejuni, Clostridium spp., Clostridium difficile, Mycobacterium spp., Mycobacterium tuberculosis, Treponema spp., Borrelia spp., Borrelia burgdorferi, Leptospira spp., Hemophilus ducreyi,

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Corynebacterium diphtheria, Bordetella pertussis, Berdeteila parapertussis, Berdeteila bronchiseptica, Hemophilus influenzae, Escherichia coli, Shigella spp., Ehrlichia spp. e Rickettsia spp.; Polissacarídeos de Streptococcus pneumoniae tipo 1,2,3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9A, 9F, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C.17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B, 38 e 45; Polissacarídeos de Neisseria meningitidis sorogrupo A, B, C, D, W135, X, Y, Z, 29E; e H. influenzae tipo b.
47. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o polissacarídeo é derivado de uma fonte biológica.
48. Polissacarídeo, caracterizado pelo fato de ser obtido pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações anteriores.
49. Polissacarídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que é um polissacarídeo capsular, polissacarídeo subcapsular ou exopolissacarídeo.
50. Polissacarídeo de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que é submetido a um dimensionamento por meios químicos ou mecânicos.
51. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende um antígeno polissacarídico obtido pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações anteriores.
52. Polissacarídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que é conjugado a uma proteína transportadora, em que a proteína transportadora é uma dentre CRM197, adesina A de superfície pneumocócica (PsaA), toxoide diftérico (DT), toxoide tetânico (TT), fragmento C do toxoide tetânico, toxoide pertussis, proteína D de H. influenzae, LT de E. coli, ST de E. coli, exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, complexo c da

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9/10 membrana externa (OMPC), porinas, proteínas de ligação da transferrina, pneumolisina, proteína A de superfície pneumocócica (PspA), adesina A de superfície pneumocócica (PsaA), PhtD pneumocócica, proteínas de superfície pneumocócica BVH-3, BVH-11, antígeno protetor (PA) de Bacillus anthracis, fator de edema detoxificado (EF), fator letal (LF) de Bacillus anthracis, ovalbumina, hemocianina do molusco keyhole limpet (KLH), albumina sérica humana, albumina sérica bovina (BSA), derivado proteico purificado de tuberculina (PPD); especialmente CRM 197, toxoide tetânico, toxoide diftérico e/ou PsaA.
53. Polissacarídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que é conjugado a uma proteína transportadora utilizando aminação redutiva, cianilação ou química de carbodiimida.
54. Composição imunogênica obtida como definida em qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o referido conjugado compreende um polissacarídeo capsular de Neisseria meningitidis (N. meningitidis) selecionado a partir do sorogrupo A, B, C, D, X, Y, Z, 29E e W-135.
55. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um dentre:

a) um conjugado de (i) sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo A e (ii) toxoide tetânico;

b) um conjugado de (i) sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo C e (ii) CRM197;

c) um conjugado de (i) sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo Y e (ii) CRM 197;

d) um conjugado de (I) sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo W135 e (ii) CRM 197; e

e) um conjugado de (i) sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo X e (ii) toxoide tetânico.

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56. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 54 e 55, caracterizada pelo fato de que a referida composição compreende:

a) pelo menos um conjugado polissacarídeo-proteína;

b) sacarose a uma concentração de aproximadamente 3% em p/v; e

c) citrato de sódio a uma concentração de aproximadamente 0,5% em p/v, em que o polissacarídeo é purificado por um método como definido em qualquer uma das reivindicações anteriores.