CN102653565A - 一种从荚膜细菌发酵液纯化荚膜多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了纯化荚膜多糖的方法，包括：将荚膜细菌发酵液离心，收集上清液，超滤浓缩，乙醇沉淀，收集上清液；乙醇沉淀，收集沉淀，注射水复溶；加入蛋白酶酶解，超滤蛋白酶解液；加入十六烷基三甲基溴化铵和NaCl，该NaCl的质量百分比终浓度为0.2％-0.3％，离心，收集上清液；加入十六烷基三甲基溴化铵和NaCl，该NaCl的质量百分比终浓度为0.1％-0.15％，离心，收集沉淀，溶解沉淀；加入乙醇沉淀，收集沉淀，注射水复溶；超滤，膜过滤。本发明的纯化方法荚膜多糖回收率高，蛋白质及核酸含量低，去除了传统提纯中利用有毒有机试剂的步骤，简化了纯化步骤，节省了时间和成本。
Description
技术领域
本发明属于疫苗生产制备领域，涉及一种纯化荚膜多糖的方法，具体地涉及一种从荚膜细菌发酵液纯化荚膜多糖的方法。
背景技术
近年来的研究表明，侵袭性b型流感嗜血杆菌(Hib)，脑膜炎奈瑟氏球菌以及肺炎球菌已成为我国儿童呼吸道的主要致病菌，引起下呼吸道感染、肺炎、中耳炎、脑膜炎等多种疾病，2岁以下幼儿感染率较高。在20世纪70年代，WHO就制定了Hib、脑膜炎奈瑟氏球菌以及肺炎球菌等相关细菌荚膜多糖疫苗的制检规程，又于1980年进行了修订，使得这些多糖疫苗的生产得到了规范。
现在主要的荚膜多糖的纯化工艺中往往加入酚、氯仿、丙酮等有机试剂以去除蛋白，这些物质不能被直接的降解，对于人体和环境有很大的危害。一旦这些物质在多糖制剂中不能完全去除，很容易对人体造成伤害；同时这些有机试剂在纯化过程中需要多次使用，不仅增加了操作步骤和操作时间，而且提高了生产过程中的成本。
如何减少或去除该类有机试剂的使用，简化工艺步骤，节省时间，同时提高荚膜多糖回收率高，降低蛋白质及核酸含量，是本领域研究人员一直努力解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种从荚膜细菌发酵液纯化荚膜多糖的方法，该方法不使用酚、氯仿、丙酮等有机试剂，简化工艺步骤，节省时间，同时提高荚膜多糖回收率高，降低了蛋白质及核酸含量。
为了达到上述目的，本发明提供了下列技术方案：
本发明提供了一种从荚膜细菌发酵液纯化荚膜多糖的方法，其特征在于该方法包括下列步骤：
a.将荚膜细菌发酵液离心，收集上清液，超滤浓缩上清液，加入乙醇沉淀，使该乙醇的体积百分比终浓度为20％-45％，收集上清液；
b.加入乙醇沉淀，使该乙醇的体积百分比终浓度为70％-95％，收集沉淀，用注射水复溶，得复溶液；
c.加入蛋白酶，得蛋白酶解液，超滤蛋白酶解液，得超滤液；
d.加入十六烷基三甲基溴化铵和NaCl，该NaCl的质量百分比终浓度为0.2％-0.3％，离心，收集上清液；
e.加入十六烷基三甲基溴化铵和NaCl，该NaCl的质量百分比终浓度为0.1％-0.15％，离心，收集沉淀，溶解沉淀；
f.加入乙醇沉淀，该乙醇的体积百分比终浓度为70％-95％，收集沉淀，用注射水复溶，得复溶液；
g.将步骤f中所得的复溶液进行超滤，膜过滤，得到纯化的荚膜多糖。
本发明的一种从荚膜细菌发酵液纯化荚膜多糖的方法，其特征在于：步骤a中超滤浓缩上清液后，加入乙醇沉淀之前，还包括下列步骤：加入醋酸钠，使得该醋酸钠的质量百分比终浓度为1％-5％，然后调节pH值为4-6.5。
本发明的一种从荚膜细菌发酵液纯化荚膜多糖的方法，其特征在于：步骤a和步骤b之间还包括下列步骤：加入醋酸钠，使得该醋酸钠的质量百分比终浓度为5％-25％，然后调节pH值为4-6.5。
本发明的一种从荚膜细菌发酵液纯化荚膜多糖的方法，其特征在于：步骤c中的蛋白酶是蛋白酶K、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶中一种或多种。
本发明的一种从荚膜细菌发酵液纯化荚膜多糖的方法，其特征在于：步骤b和步骤c之间还包括下列步骤：加入Tris，使得其终浓度为10mM-500mM，调节pH到6-9。
本发明的一种从荚膜细菌发酵液纯化荚膜多糖的方法，其特征在于：步骤c得蛋白酶解液后，超滤蛋白酶解液之前，还包括下列步骤：搅拌后加入10mM-100mM PB S溶液。
本发明的一种从荚膜细菌发酵液纯化荚膜多糖的方法，其特征在于：步骤d和e中所加入的十六烷基三甲基溴化铵的质量百分比浓度是0.1％-2.0％。
本发明的一种从荚膜细菌发酵液纯化荚膜多糖的方法，其特征在于：步骤e中溶解沉淀使用浓度为0.2M-2.0M KCl、0.2M-2.0M NaCl或0.2M-2.0M CaCl2中的一种或多种溶解沉淀。
本发明的一种从荚膜细菌发酵液纯化荚膜多糖的方法，其特征在于：步骤e和步骤f之间还包括下列步骤：加入醋酸钠，使得该醋酸钠的质量百分比终浓度为5％-25％，然后调节pH值为4-6.5。
本发明的一种从荚膜细菌发酵液纯化荚膜多糖的方法，其特征在于：所述的荚膜细菌选自下列之一：B型流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏球菌或肺炎球菌。
本发明的从荚膜细菌发酵液纯化荚膜多糖的方法去掉了酚、氯仿、丙酮等有机试剂的加入，而是使用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)这种相对对于人体伤害较小的物质进行了代替，而且CTAB易于被降解，从而对环境的影响大大减少。与此同时简化了纯化步骤，节省了时间和生产成本。同时提高荚膜多糖回收率高，降低了蛋白质及核酸含量。
为了更好地理解本发明，下面通过实施例对本发明做进一步说明。该实施例仅仅是示例，本发明不限于该实施例。
本发明所用的生物材料、试剂、方法和仪器，如无特别说明，为本领域常规的生物材料、试剂、方法和仪器。本发明所涉及的生物材料、试剂、方法和仪器均可以通过商购途径购买。
具体实施方式
实施例1：从B型流感嗜血杆菌发酵液纯化荚膜多糖
1.菌种：Hib菌株购自ATCC，菌种编号为51654；
2.培养基：MWSM I培养基，MWSM II培养基，MCDM I培养基；
3.细菌培养：
将菌种干粉使用相应培养基溶化后，涂布于巧克力血平板上，在二氧化碳培养箱中培养过夜，将菌体刮下后放入一级种子摇瓶中培养4小时，然后将菌液放入50L发酵罐中培养16小时，最后使用甲醛灭活。
4.纯化荚膜多糖：
通过离心和超滤浓缩将发酵液体积浓缩10倍后，加入醋酸钠使其质量百分比浓度为1％，调pH值为4，加入预先冷却的无水乙醇使之体积百分比终浓度为20％，4℃静置4小时以上，离心，弃沉淀，上清中加入醋酸钠至其质量百分比终浓度达5％，调pH值为4，加入预先冷却的无水乙醇使之体积百分比终浓度为70％，4℃静置4小时以上，离心，收集沉淀并用注射水复溶，离心，弃去不溶物。
向上清中加入Tris，使得其终浓度为10mM，HCl调节pH到6，加入蛋白酶K、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶以及枯草杆菌酶蛋白酶，37℃搅拌2小时后用10mM PBS溶液(pH7.0，10mM NaCl)超滤10倍体积。
超滤液中加入质量百分比浓度0.1％CTAB和NaCl，该NaCl的质量百分比终浓度为0.2％，4℃静置4小时以上，离心，弃沉淀。
离心上清等体积稀释2倍后，加入质量百分比浓度0.1％CTAB，4℃静置4小时，离心，弃上清，沉淀用0.2M KCl复溶。
加入5％醋酸钠，调pH值为4，加入预先冷却的无水乙醇使之体积百分比浓度为70％，4℃静置4小时以上，离心，收集沉淀，注射水复溶。
沉淀复溶后用注射水超滤10倍体积。经0.22um膜过滤，-20℃保存。
5.多糖检测：
Hib多糖检测方法参见《中华人名共和国药典(2010)》附录VIII J，D-核糖检查法；
6.残留蛋白质和核算的测定：
蛋白检测方法参见《中华人名共和国药典(2010)》附录VI B，lowery法；
核酸检测方法参见《中华人名共和国药典(2010)》附录II A，紫外-可见光光度法；
表一：Hib多糖纯化产物
其中蛋白质和核酸含量为最终多糖含量中的蛋白质和核酸含量。
实施例2：从A型脑膜炎奈瑟氏球菌发酵液纯化荚膜多糖
1.菌种：A型脑膜炎奈瑟氏球菌菌株购自中国食品药品检定研究院，菌种编号CMCC 29201；
2.培养基：MWSM I培养基，MWSM II培养基，MCDM I培养基；
3.细菌培养：
将菌种干粉使用相应培养基溶化后，涂布于巧克力血平板上，在二氧化碳培养箱中培养过夜，将菌体刮下后放入一级种子摇瓶中培养4小时，然后将菌液放入50L发酵罐中培养16小时，最后使用甲醛灭活。
4.纯化荚膜多糖：
通过离心和超滤浓缩将发酵液体积浓缩30倍后，加入醋酸钠使其质量百分比浓度为5％，调pH值为6.5，加入预先冷却的无水乙醇使之体积百分比终浓度为45％，4℃静置4小时以上，离心，弃沉淀，上清中加入醋酸钠至其质量百分比终浓度达25％，调pH值为6.5，加入预先冷却的无水乙醇使之体积百分比终浓度为95％，4℃静置4小时以上，离心，收集沉淀并用注射水复溶，离心，弃去不溶物。
向上清中加入Tris，使得其终浓度为500mM，HCl调节pH到9，加入蛋白酶K以及枯草杆菌酶蛋白酶，37℃搅拌2小时后用100mMPBS溶液(pH7.0，150mM NaCl)超滤50倍体积。
超滤液中加入质量百分比浓度2％CTAB和NaCl，该NaCl的质量百分比终浓度为0.3％，4℃静置4小时以上，离心，弃沉淀。
离心上清等体积稀释2倍后，加入质量百分比浓度2％CTAB，4℃静置4小时，离心，弃上清，沉淀用0.2M NaCl复溶。
加入25％醋酸钠，调pH值为6.5，加入预先冷却的无水乙醇使之体积百分比浓度为95％，4℃静置4小时以上，离心，收集沉淀，注射水复溶。
沉淀复溶后用注射水超滤50倍体积。经0.22um膜过滤，-20℃保存。
5.A型脑膜炎奈瑟氏球菌多糖(CPS)检测：
A型脑膜炎奈瑟氏球菌多糖(CPS)检测方法参见《中华人名共和国药典(2010)》附录VI F，o-乙酰基检查法；
6.残留蛋白质和核算的测定：
蛋白检测方法参见《中华人名共和国药典(2010)》附录VI B，lowery法；
核酸检测方法参见《中华人名共和国药典(2010)》附录II A，紫外-可见光光度法；
表二：CPS纯化产物
其中蛋白质和核酸含量为最终多糖含量中的蛋白质和核酸含量。
实施例3：从肺炎球菌发酵液纯化荚膜多糖
1.菌种：肺炎球菌菌株购自中国食品药品检定研究院，菌种编号CMCC31218；
2.培养基：MWSM I培养基，MWSM II培养基，MCDM I培养基；
3.细菌培养：
将菌种干粉使用相应培养基溶化后，涂布于巧克力血平板上，在二氧化碳培养箱中培养过夜，将菌体刮下后放入一级种子摇瓶中培养4小时，然后将菌液放入50L发酵罐中培养16小时，最后使用甲醛灭活。
4.纯化荚膜多糖：
通过离心和超滤浓缩将发酵液体积浓缩20倍后，加入醋酸钠使其质量百分比浓度为2.5％，调pH值为5，加入预先冷却的无水乙醇使之体积百分比终浓度为30％，4℃静置4小时以上，离心，弃沉淀，上清中加入醋酸钠至其质量百分比终浓度达15％，调pH值为5，加入预先冷却的无水乙醇使之体积百分比终浓度为80％，4℃静置4小时以上，离心，收集沉淀并用注射水复溶，离心，弃去不溶物。
向上清中加入Tris，使得其终浓度为200mM，HCl调节pH到7.5，加入蛋白酶K、胰蛋白酶以及枯草杆菌酶蛋白酶，37℃搅拌2小时后用50mM PB S溶液(pH7.0，70mM NaCl)超滤25倍体积。
超滤液中加入质量百分比浓度0.65％CTAB和NaCl，该NaCl的质量百分比终浓度为0.25％，4℃静置4小时以上，离心，弃沉淀。
离心上清等体积稀释2倍后，加入质量百分比浓度0.65％CTAB，4℃静置4小时，离心，弃上清，沉淀用0.2M CaCl复溶。
加入15％醋酸钠，调pH值为5，加入预先冷却的无水乙醇使之体积百分比浓度为80％，4℃静置4小时以上，离心，收集沉淀，注射水复溶。
沉淀复溶后用注射水超滤30倍体积。经0.22um膜过滤，-20℃保存。
5.肺炎多糖检测：
肺炎多糖(CPS)检测方法参见《欧盟药典(第六版)》，蒽酮检查法；
6.残留蛋白质和核算的测定：
蛋白检测方法参见《中华人名共和国药典(2010)》附录VI B，lowery法；
核酸检测方法参见《中华人名共和国药典(2010)》附录II A，紫外-可见光光度法；
表二：肺炎多糖纯化产物
其中蛋白质和核酸含量为最终多糖含量中的蛋白质和核酸含量。
Claims (10)
1.一种从荚膜细菌发酵液纯化荚膜多糖的方法，其特征在于该方法包括下列步骤：
a.将荚膜细菌发酵液离心，收集上清液，超滤浓缩上清液，加入乙醇沉淀，使该乙醇的体积百分比终浓度为20％-45％，收集上清液；
b.加入乙醇沉淀，使该乙醇的体积百分比终浓度为70％-95％，收集沉淀，用注射水复溶，得复溶液；
c.加入蛋白酶，得蛋白酶解液，超滤蛋白酶解液，得超滤液；
d.加入十六烷基三甲基溴化铵和NaCl，该NaCl的质量百分比终浓度为0.2％-0.3％，离心，收集上清液；
e.加入十六烷基三甲基溴化铵和NaCl，该NaCl的质量百分比终浓度为0.1％-0.15％，离心，收集沉淀，溶解沉淀；
f.加入乙醇沉淀，该乙醇的体积百分比终浓度为70％-95％，收集沉淀，用注射水复溶，得复溶液；
g.将步骤f中所得的复溶液进行超滤，膜过滤，得到纯化的荚膜多糖。
2.根据权利要求1所述的一种从荚膜细菌发酵液纯化荚膜多糖的方法，其特征在于：步骤a中超滤浓缩上清液后，加入乙醇沉淀之前，还包括下列步骤：加入醋酸钠，使得该醋酸钠的质量百分比终浓度为1％-5％，然后调节pH值为4-6.5。
3.根据权利要求1所述的一种从荚膜细菌发酵液纯化荚膜多糖的方法，其特征在于：步骤a和步骤b之间还包括下列步骤：加入醋酸钠，使得该醋酸钠的质量百分比终浓度为5％-25％，然后调节pH值为4-6.5。
4.根据权利要求1所述的一种从荚膜细菌发酵液纯化荚膜多糖的方法，其特征在于：步骤c中的蛋白酶是蛋白酶K、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶中一种或多种。
5.根据权利要求1所述的一种从荚膜细菌发酵液纯化荚膜多糖的方法，其特征在于：步骤b和步骤c之间还包括下列步骤：加入Tris，使得其终浓度为10mM-500mM，调节pH到6-9。
6.根据权利要求1所述的一种从荚膜细菌发酵液纯化荚膜多糖的方法，其特征在于：步骤c得蛋白酶解液后，超滤蛋白酶解液之前，还包括下列步骤：搅拌后加入10mM-100mM PBS溶液。
7.根据权利要求1所述的一种从荚膜细菌发酵液纯化荚膜多糖的方法，其特征在于：步骤d和e中所加入的十六烷基三甲基溴化铵的质量百分比浓度是0.1％-2.0％。
8.根据权利要求1所述的一种从荚膜细菌发酵液纯化荚膜多糖的方法，其特征在于：步骤e中溶解沉淀使用浓度为0.2M-2.0M KCl、0.2M-2.0M NaCl或0.2M-2.0M CaCl2中的一种或多种溶解沉淀。
9.根据权利要求1所述的一种从荚膜细菌发酵液纯化荚膜多糖的方法，其特征在于：步骤e和步骤f之间还包括下列步骤：加入醋酸钠，使得该醋酸钠的质量百分比终浓度为5％-25％，然后调节pH值为4-6.5。
10.根据权利要求1所述的一种从荚膜细菌发酵液纯化荚膜多糖的方法，其特征在于：所述的荚膜细菌选自下列之一：B型流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏球菌或肺炎球菌。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120905 |