CN109837219B - 一种水解牛乳过敏源β-乳球蛋白蛋白酶的分离纯化及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水解牛乳过敏源β‑乳球蛋白蛋白酶的分离纯化及应用，提供一株生产水解牛乳过敏源β‑乳球蛋白蛋白酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis S7)，所述枯草芽抱杆菌S7经过发酵纯化后生成的蛋白酶可以有效的降解牛乳蛋白中的β‑乳球蛋白，蛋白酶的产量高，发酵方法简单，发酵培养基简单，发酵周期短，还能有效的消除其致敏性。

Description

一种水解牛乳过敏源β-乳球蛋白蛋白酶的分离纯化及应用

技术领域

本发明涉及一种水解牛乳过敏源β-乳球蛋白蛋白酶的分离纯化及应用，属于生物技术领域。

背景技术

奶中含有丰富的蛋白质，是人体生长重要营养品，但是食用牛奶也会引起人体的过敏反应。牛奶过敏主要是由特异IgE抗体介导的I型超敏反应，可引起呼吸道、消化道、皮肤或全身性过敏，主要表现为呕吐、腹痛和腹泻等肠胃不适，也有部分患儿发生血管水肿、荨麻疹、鼻炎、哮喘、过敏性昏厥等症状，对小肠粘膜和肝功能也有损伤，严重的影响婴幼儿对乳蛋白的吸收。

牛奶蛋白主要由酪蛋白和乳清蛋白组成，α-乳白蛋白和β-乳球蛋白是乳清蛋白的主要成分。β-乳球蛋白只存于牛奶而不存于人乳中，且能抗胃酸和抗蛋白酶水解，能直接通过胃肠道排出而进入血液循环，因此β-乳球蛋白被认为是牛奶中最主要的过敏原。

目前消除牛奶过敏源的主要方法有高温、高压等物理方法、糖基化反应、乳酸菌发酵和蛋白酶水解。通过使用专一性的酶对乳制品进行降解，降低或消除蛋白质过敏原，而且不会影响产物的营养价值是其他改性方法所不及的，还可以改进产物的功能性，越来越多的商业化乳清蛋白水解物是利用酶类来生产的。由于乳清蛋白过敏原表位的广泛存在，在众多蛋白酶中筛选出合理酶有一定的盲目性，需要特异性的酶来降解过敏原的抗原决定部位，酶的选择是乳清蛋白改性的关键。

目前市场上主要用作消除过敏源的酶主要为动物蛋白酶、植物蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等，但是它们对β-乳球蛋白的脱敏效果有限，最佳条件下的脱敏效果也只在50％以下，研究发现将这些酶结合起来利用时，水解乳清蛋白产生的水解物的过敏性比单独一种酶水解产生的要低，最佳脱敏效果能达到70％左右，但是几种不同来源的酶水解过程复杂且成本高，还可能产生苦味多肽，影响牛奶风味。

直至目前，筛选、发掘、研究生产有水解牛乳过敏原蛋白酶能力的微生物菌株，以及继续开发这些菌株产的有潜在工业、商业应用潜力的蛋白酶资源，仍是牛乳过敏原研究中的重要的、待解决的问题。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一株生产水解牛乳过敏源β-乳球蛋白蛋白酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis S7)，所述枯草芽抱杆菌S7，于2016年9月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号M2016532，保藏地址为武汉大学保藏中心，分类命名为Bacillus subtilis。

本发明第二个目的是提供一种水解牛乳过敏源β-乳球蛋白蛋白酶，所述蛋白酶是由草芽抱杆菌S7发酵生产，所述解牛乳过敏源β-乳球蛋白蛋白酶N端的十个氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明的第三个目的是提供一种水解牛乳过敏源β-乳球蛋白蛋白酶的发酵生产方法，具体步骤如下：

(1)将枯草芽抱杆菌S7接种至AM液体培养基或PDA液体培养基中，在35-39℃，180-260rpm培养10-16h得到种子液；

(2)将种子液按体积2-5％接种量接种于液体培养基PDA液体培养基所述中，在35-39℃，180-260rpm发酵10-16h得到发酵液；

(3)将发酵液离心，收集发酵液上清即为粗酶液。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基A为，所述培养基B为。

在本发明的一种实施方式中，AM液体培养基成分为：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，MgSO₄ 0.5g/L，KH₂PO₄ 2g/L，CaCl₂ 0.2g/L；所述PDA液体培养基成分为：葡萄糖20g/L，马铃薯200g/L。

本发明的第四个目的是提供一种水解牛乳过敏源β-乳球蛋白蛋白酶的分离纯化及应用，具体步骤如下：

(1)将枯草芽孢杆菌S7发酵培养获得的粗酶液；

(2)将粗酶液用质量分数为40-70％的硫铵酸梯度沉淀出一部分杂蛋白后，用磷酸缓冲液透析，用磷酸缓冲液平衡Q Sepharose fast-flow离子交换柱，上样，收集有酶活的蛋白峰，用磷酸缓冲液透析，磷酸缓冲液平衡凝胶柱，上样，洗脱，收集有酶活的组分，即得纯化后的蛋白酶。

在本发明的一种实施方式中，所述磷酸缓冲液为pH 6.0-9.0，40-60mM磷酸缓冲液。

在本发明的一种实施方式中，所述磷酸缓冲液为pH 8.0，50mM磷酸缓冲液。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供的菌株蛋白酶的产量高，发酵液蛋白酶酶活可达76.75U/mL，纯化后酶活可达11.36U/mL，发酵方法简单，发酵培养基简单，发酵周期短；

(2)蛋白酶的性能优于现有传统的酶，对β-乳球蛋白的脱敏效果好，脱敏率可达80％，对牛乳中其他过敏源如α-乳白蛋白、酪蛋白也有很好的水解效果，水解生成功能性多肽，水解液物苦涩口感。

(3)该蛋白酶分离纯化步骤简单，蛋白酶性质稳定。

生物材料保藏

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S7，于2016年9月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号CCTCC NO:M2016532，保藏地址为武汉大学保藏中心。

附图说明

图1：菌株筛选

图2：菌株S7生长曲线

图3：酶液的一般酶学性质，最适pH(a)，pH稳定性(b)，最适温度(c),温度稳定性(d)

图4：分离纯化的蛋白酶的SDS-PAGE检测图

图5：蛋白酶与日本天野公司商业酶A2SD对β-乳球蛋白处理效果

图6：ELISA检测日本天野的四个商业酶和本发明纯化的蛋白酶与β-乳球蛋白反应后的致敏性

图7：蛋白酶处理α-乳白蛋白、酪蛋白后SDS-PAGE电泳分析图

具体实施方式

蛋白酶的酶活测定方法：

参照我国现行GB 1886.174——2016《食品安全国家标准食品添加剂食品工业用酶制剂》蛋白酶测定方法进行测定。该法的原理是在一定的pH与温度条件下，蛋白酶水解酪蛋白底物，产生含有酚基的氨基酸，在碱性条件下还原福林酚试剂，生成钨蓝和钼蓝，用分光光度计测定溶液在波长680nm的光下的吸光度。酶活力与吸光度成比例，由此可以计算蛋白酶的酶活力。

(1)绘制标准曲线

L-酪氨酸标准溶液按表1-1配置。

表1-1 L-酪氨酸标准溶液

分别取上述溶液各1.00mL，加入5.00mL碳酸钠溶液(42.4g/L)，1.00mL福林酚试剂，摇匀，于40℃水浴20min显色，用10mm比色皿，分光光度计测定其在波长680nm的吸光度。做三组平行实验，以酪氨酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制曲线。

(2)测定酶活力

将酪蛋白溶液(10.0g/L)置于40℃水浴预热5min。取干净且干燥的试管，按表1-2中的顺序加试剂进行操作。

表1-2 蛋白酶检测方法

Table 1-2 Protease detection method

(3)酶活力计算

经标准曲线和酶活力定义得到酶活力的计算公式：

酶活力(E)＝(A×V×4×n)/10(1-1)

式中A——由标准曲线得出的酪氨酸含量(μg/mL)；

V——样品的体积(mL)；

4——反应体系的体积(mL)；

n——稀释倍数；

10——反应时间(min)。

培养基成分

AM液体培养基：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，MgSO₄ 0.5g/L，KH₂PO₄2g/L，CaCl₂ 0.2g/L。

PDA液体培养基：葡萄糖20g/L，马铃薯200g/L。

实施例1枯草芽孢杆菌的分离纯化

该发明所用的菌种筛自于无锡马山牧场，从泥土和水中获取了3000多株野生菌，然后以无脂牛奶培养基筛选得到了30株能够降解蛋白的菌株(图1)，然后再将菌株产的粗酶直接与β-乳球蛋白反应，最终确定Strain 7(S7)对β-乳球蛋白作用效果最为良好，然后通过16S rDNA和功能基因gyrA测序与校准，确定S7为Bacillus subtilis，于2016年9月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号M2016532，保藏地址为武汉大学保藏中心，分类命名为Bacillus subtilis。

实施例2枯草芽孢杆菌性能的测定

将菌株S7活化后按照2％(v/v)的接种量移接到每瓶装有50mL AM培养基的250mL三角瓶中，于220r/min，37℃摇床培养，前期每4h取样一次，后面每隔2h取一次样，用分光光度计测定600nm波长下的OD值，以时间为横坐标，OD₆₀₀值为纵坐标，绘制枯草芽孢杆菌S7的生长曲线，做三组平行实验(图2)。可以发现菌株在12h左右就能达到稳定期，生长十分迅速。

实施例3蛋白酶的生产及分离纯化

(1)将枯草芽抱杆菌S7单菌落用接种针接种至AM液体培养基中，37℃，220rpm培养12h；

(2)将AM液体培养基中的对数期种子液按体积2％接种量接种于PDA液体培养基中，37℃，220rpm培养12h培养基；

(3)离心发酵液，收集发酵液上清即为粗酶液，酶活为37.32U/mL。

(4)将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis S7发酵培养获得粗酶液，用质量分数为60％的硫铵酸梯度沉淀粗酶液后，用pH 8.0，50mM磷酸缓冲液重悬沉淀、透析，用pH 8.0，50mM磷酸缓冲液平衡Q Sepharose fast-flow离子交换柱，上样，收集有酶活的蛋白峰，用pH 8.0，50mM磷酸缓冲液透析，pH 8.0，50mM磷酸缓冲液平衡凝胶柱，上样，洗脱，收集有酶活的组分，即得纯化后的蛋白酶，酶活为0.97U/mL。

实施例4蛋白酶的分离纯化

具体步骤如下：

(1)将枯草芽抱杆菌S7单菌落用接种针接种至PDA液体培养基中，37℃，220rpm培养12h；

(2)将PDA液体培养基中的对数期种子液按体积2％接种量接种于PDA液体培养基中，37℃，220rpm培养12h培养基；

(3)离心发酵液，收集发酵液上清即为粗酶液,酶活为17.35U/mL。

(4)将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis S7发酵培养，获得粗酶液，用质量分数为70％的硫铵酸梯度沉淀粗酶液后，用pH 8.0，50m磷酸缓冲液重悬沉淀、透析，用pH 8.0，50mM磷酸缓冲液平衡Q Sepharose fast-flow离子交换柱，上样，收集有酶活的蛋白峰，用pH 8.0，50mM磷酸缓冲液透析，pH 8.0，50mM磷酸缓冲液平衡凝胶柱，上样，洗脱，收集有酶活的组分，即得纯化后的蛋白酶，酶活为3.06U/mL。

实施例5蛋白酶的分离纯化

具体步骤如下：

(1)将枯草芽抱杆菌S7单菌落用接种针接种至PDA液体培养基中，37℃，220rpm培养12h；

(2)将PDA液体培养基中的对数期种子液按体积2％接种量接种于PDA液体培养基中，37℃，220rpm培养12h培养基；

(3)离心发酵液，收集发酵液上清即为粗酶液，酶活为18.60U/mL。

(4)通过改变缓冲液的pH，以期找到最优纯化条件，当缓冲液的pH是9、7、6，最后纯化得到的酶液活性分别是2.35U/mL、2.47U/mL、1.46U/mL，当pH小于6时，蛋白已经无法吸附在阴离子柱上了。

实施例6蛋白酶发酵罐发酵及分离纯化

对菌种使用AM培养基进行发酵罐培养，3L罐中装液量为1.5L，接种量为5％，转速为500rpm溶解氧饱和度控制在5％-10％，发酵温度为37℃，发酵时间为12h,最后测得粗酶液酶活为76.75U/mL。

将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis S7发酵培养，获得粗酶液，用质量分数为70％的硫铵酸梯度沉淀粗酶液后，用pH 8.0，50m磷酸缓冲液重悬沉淀、透析，用pH 8.0，50mM磷酸缓冲液平衡Q Sepharose fast-flow离子交换柱，上样，收集有酶活的蛋白峰，用pH 8.0，50mM磷酸缓冲液透析，pH 8.0，50mM磷酸缓冲液平衡凝胶柱，上样，洗脱，收集有酶活的组分，即得纯化后的蛋白酶，酶活为11.36U/mL。

实施例7酶性能的测定

采用GB法(1％酪蛋白作为底物)测定粗蛋白酶的最适pH、pH稳定性、最适温度、温度稳定性，结果如附图4所示。可以看出酶液的最适pH、pH稳定性都在7-8左右，粗酶液的最适温度是50℃，当温度超过50℃时，其酶活骤然急降。

实施例8蛋白酶对β-乳球蛋白的降解作用

将纯化后的纯蛋白酶与日本天野公司商业酶Protease A“Amano”2SD的酶活调至同等水平(10U/ml)后，然后与β-乳球蛋白在37℃下反应，然后SDS-PAGE电泳分析图，分别与与β-乳球蛋白反应20min、40min、60min。

结果分析：图5中泳道1、2、3分别是蛋白酶与β-乳球蛋白反应20min、40min、60min，泳道4、5、6分别表示天野蛋白酶A2SD与β-乳球蛋白反应20min、40min、60min，泳道7是β-LG对照。本发明的蛋白酶在20min时，β-乳球蛋白已经基本分解完全，而商业酶ProteaseA“Amano”2SD在20min、40分钟时，β-乳球蛋白几乎没有分解，在60min中时，β-乳球蛋白才基本分解完全。可以看出本发明的蛋白酶比日本天野公司在售的商业酶能够更快更好的降解过敏源β-乳球蛋白。

实施例9

使用ELISA试剂盒检测日本天野公司的四个商业酶Protin SD-AY10(AY10)、ProtinSD-NY10(NY10)、THERMOASR PC10F(PC10F)、Protease A“Amano”2SD(2SD)和本发明纯化后的纯蛋白酶分别与β-乳球蛋白反应后的酶解液的致敏性，测定方法按照ELISA试剂盒说明书。

结果分析：如图6所示，AY10、NY10、PC10F、2SD、本发明蛋白酶的脱敏率分别为60％、48％、50％、44％、80％，因此，本发明的蛋白酶对β-乳球蛋白的脱敏效果好，且对β-乳球蛋白的脱敏效果明显强与天野公司的四种商业酶。

实施例10蛋白酶水解α-乳白蛋白、酪蛋白

纯化后的蛋白酶分别与α-乳白蛋白、酪蛋白反应，将蛋白酶酶活调节至4.2U/mL，蛋白酶和与α-乳白蛋白反应添加的体积比为1:3，，蛋白酶和与酪蛋白反应添加的体积比为1:3，在37℃下分别反应10min、20min、30min、40min、50min、60min。

结果分析：图7中，1、7分别是酪蛋白(28kDa)、α-乳球蛋白(14kDa),泳道2、3、4、5、6分别为蛋白酶与酪蛋白反应10min、20min、30min、40min、50min、60min的电泳结果，泳道7、8、9、10、11、12、13分别为蛋白酶与α-乳球蛋白反应10min、20min、30min、40min、50min、60min的电泳结果，可以看出蛋白酶处理酪蛋白40min后蛋白胶上几乎看不到酪蛋白的条带，说明酶已经将酪蛋白降解完全，而酶处理α-乳球蛋白50min后，α-乳球蛋白也几乎消失不见。因此，蛋白酶对牛乳过敏源α-乳白蛋白、酪蛋白也有较好的分解作用。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以，限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (7)

1.一株产蛋白酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S7，其特征在于，于2016年9月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号CCTCC NO:M2016532，保藏地址为武汉大学保藏中心。

2.应用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌S7发酵生产水解牛乳过敏源β-乳球蛋白的粗酶液的方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)将枯草芽孢杆菌S7接种至培养基中培养得到种子液；

(2)将种子液接种于培养基中发酵培养得到发酵液；

(3)将发酵液离心，收集发酵液上清即为粗酶液。

3.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)将枯草芽孢杆菌S7接种至AM液体培养基或PDA液体培养基中培养得到种子液；

(2)将种子液按体积2-5％接种量接种于PDA液体培养基中发酵培养得到发酵液；

(3)将发酵液离心，收集发酵液上清即为粗酶液。

4.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征在于，所述AM液体培养基成分为：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，MgSO₄ 0.5g/L，KH₂PO₄ 2g/L，CaCl₂ 0.2g/L；所述PDA液体培养基成分为：葡萄糖20g/L，马铃薯200g/L。

5.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征在于，所述步骤(1)中的培养为，在35-39℃，180-260rpm培养10-16h得到种子液。

6.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征在于，所述步骤(2)中的发酵培养为，在35-39℃，180-260rpm发酵10-16h得到发酵液。

7.权利要求2所述的粗酶液在消除牛奶过敏源中的应用。

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