JPH0632742A - カルシウムイオン可溶化剤の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】微生物の生産するガンマー・ポリグルタミン酸
のカルシウムイオン可溶化活性を高めたカルシウムイオ
ン可溶化剤を提供する。 【構成】微生物を培養して得られるガンマー・ポリグル
タミン酸を酸又はアルカリ処理してカルシウムイオン可
溶化剤を製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はカルシウムイオン可溶化
剤の製造法に関する。カルシウムイオン可溶化剤はカル
シウムイオンの腸管吸収促進剤として、医薬業及び食品
業で使用されるものである。

【０００２】

【従来の技術】食物として胃腸内に摂取されたカルシウ
ムイオンは、かなり複雑な機構で腸管から人体血液内に
吸収される。すなわち、腸管の上部では能動的吸収機構
で行われるが、その下部では受動的吸収機構で行われ
る。その能動的吸収機構はホルモンで制御されているの
で、加齡、閉経等とともにその活性は衰える。腸管が受
動的吸収機構でカルシウムイオンを腸管消化内容物から
血液中に吸収するためには、腸管下部においてカルシウ
ムイオンの濃度が高く保たれていることが必要である。

【０００３】腸管内のｐＨは約中性からアルカリである
ために、カルシウムイオンは腸管内でリン酸と錯化合物
を形成し、水に溶けにくい沈澱物を生ずる。その沈澱物
からカルシウムイオンは血液中に吸収されない。すなわ
ち、カルシウムイオンは、腸管内容物に溶けた状態で存
在しなければ、血液中に吸収されない。

【０００４】最近、社会問題になっている骨粗鬆症は、
カルシウムイオンの吸収と排泄のバランスが乱れること
から起きる病気である。それは、腸管上部におけるカル
シウムイオンの、前記した能動的吸収機構の活性が衰え
ることからきている。そのために、この病気の予防、治
療は、腸管下部においてカルシウムイオンを腸管内容物
に溶けた状態で、かつ高い濃度で存在させることである
とされている。

【０００５】そのような理由で、カルシウムイオンを溶
液中に溶けた状態で保つようにするカルシウムイオン可
溶化剤は、カルシウム腸管吸収促進剤として注目されて
いるわけである（斎藤安弘、ジャパンフードサイエン
ス、１巻、２１〜３２ページ、１９９０年）。

【０００６】現在、カルシウムイオン可溶化剤として、
ペプシンによるミルクカゼインの部分加水分解物である
ホスホペプチドが市販されている。しかし、このペプチ
ドは高価である上、アミノ酸のアルファー結合のポリペ
プチドであるために、それを服用した場合に、膵臓から
分泌されるカルボキシペプチダーゼ及び腸内微生物によ
り容易に分解されて、カルシウムイオン可溶化活性が約
１／２になるという欠点をもっていた。

【０００７】そこで、膵臓から分泌されるカルボキシペ
プチダーゼ及び腸内微生物により分解されにくく、安価
なカルシウムイオン可溶化剤の開発研究が行われた。そ
の結果、微生物により生産されるガンマー・ポリグルタ
ミン酸（以下、ＰＧＡと略称する）が俎上にあがってい
る（浅海康義、魚谷和道、武部英日、古川勇次、木村修
一：栄養食糧学会、１９９１年度大会講演要旨集、９２
ページ；特開平０３−３０６４８号公報）。このＰＧＡ
には以下のような特長があるのでカルシウムイオン可溶
化剤としては、その特長において極めて好ましい面をも
っている。しかしながら、また以下のような欠点もある
ために未だカルシウムイオン可溶化剤として使用される
にいたっていない。 （Ａ）特長： （１）グルタミン酸のガンマー結合のポリペプチドであ
るために、胃内のペプシン及び膵臓から分泌されるカル
ボキシペプチダーゼ並びに腸内微生物により分解されに
くい。 （２）微生物を培養することにより大量にかつ安価に生
産される。 （Ｂ）欠点： （１）活性が低い。 （２）微生物の培養条件によってカルシウムイオン可溶
化活性が著しくふれる。 （３）ＰＧＡを生産する微生物の種類、また微生物の培
養条件によって分子量が変化する（１千〜２００万）。 （４）（３）のような高分子である上、一本の細長いペ
プチドであるために、培養物より分離して乾かしたもの
は、それを水に再び溶かすことは非常にむずかしい。 （５）（４）と同じ理由で、ＰＧＡを含む溶液の粘度が
極めて高い。そのために製造されたものは、その後の取
り扱いが非常に難しい。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、この
ような欠点を克服して、微生物の生産するＰＧＡからカ
ルシウムイオン可溶化活性の高いカルシウムイオン可溶
化剤、すなわち腸管から血液への吸収効果の優れたカル
シウムイオン腸管吸収促進剤を提供することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の課題
を解決するために鋭意研究を重ねた結果、以下のような
知見を得て、その知見に基づいて本発明を完成させた：
微生物の生産するＰＧＡを酸又はアルカリで処理すれ
ば、処理して得られるＰＧＡは、処理する前のＰＧＡと
比較して次のような特長をもつようになる。 （１）カルシウムイオン可溶化活性は著しく高い。 （２）乾燥物は水によく溶ける。 （３）この処理されたＰＧＡを含む溶液の粘度は非常に
低い。 すなわち、本発明は、微生物の生産するＰＧＡを酸又は
アルカリ処理することを特徴とするカルシウムイオン可
溶化剤の製造法に関する。

【００１０】以下に、本発明について詳しく述べる。 （微生物によるＰＧＡの生産）本発明に使用するＰＧＡ
は、微生物が生産するものあればよい。その微生物とし
ては、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属し
ているＰＧＡの生産能をもつ微生物、すなわち、バチル
ス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ）、 バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウ
ム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｈｅｒｉｕｍ）、及び
バチルス・アントラシル（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒ
ａｃｉｓ）を挙げることができる。具体的にはバチルス
・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）
の中の市販納豆菌株の宮城野菌（宮城野納豆製造所
製）、成瀬菌（成瀬発酵化学研究所製）等が好適なもの
として挙げられる。

【００１１】そして、ＰＧＡは上記のような微生物を用
いて、例えば、以下のような固体培養法あるいは液体培
養法によって、この物質を培地に生成、蓄積させて、採
取することができる。

【００１２】（１）固体培養法。 固体培養の培地としては、例えば、加熱処理した穀類
を、通常そのまま用いることができる。この穀類として
は、大豆、蚕豆、インゲン豆、ウズラ豆、小豆、小麦、
大麦、米等が挙げられる。これらの穀類は単独、又は互
いに混合して使用される。更に、割砕したものを使用し
てもよいし、そのまま用いてもよい。また、穀類を割砕
したときに得られる種皮だけを使用してもよい。これら
の穀類に炭素源として、グルコース、シュクロース、フ
ルクトース等、窒素源として、ペプトン、酵母エキス、
グルタミン酸、グルタミン等を加えてもよい。これらの
ものは加熱処理して使用される。その処理には、１００
℃〜１３０℃、好ましくは１１５〜１２２℃で５〜６０
分、好ましくは２０〜４０分の条件での蒸煮法、あるい
は７０〜１００℃、好ましくは８５〜９５℃の熱湯を、
原料に対して５〜９０％（ｖ／ｗ）、好ましくは７０〜
８０％（ｖ／ｗ）の割合で散水する方法等がある。

【００１３】上記のようにして作られた培地にＰＧＡ生
産能をもつ菌を接種し、１０〜５０℃、好ましくは３５
〜４２℃、湿度は５０〜１００％、好ましくは８０〜９
２％等の条件下、２０〜８０時間、好ましくは２０〜３
０時間培養すればよい。菌の接種量は、１ｘ１０³〜１
ｘ１０⁶個の胞子／原料１g、好ましくは１ｘ１０⁴〜８
ｘ１０⁴個の胞子／原料１gである。このようにして、
０．５〜３％（ｗ／ｗ）のＰＧＡを含む固体培養物が得
られる。

【００１４】（２）液体培養法。 培地としては、グリセロール、グルコース、マルトー
ス、シュクロース、フルクトース、澱粉等の炭素源、硫
安、塩安、硝安等の無機窒素源、ペプトン、酵母エキ
ス、グルタミン酸、グルタミン等のアミノ酸類等の有機
窒素源、リン酸第一カリ、リン酸第二カリ、硫酸マグネ
シウム等の無機塩、鉄イオン、亜鉛イオン、マンガンイ
オン等の微量金属イオン類が、ＰＧＡの生産に適するよ
うに配合されているものであればよい。ｐＨは４〜１０
に、好ましくは６〜８に塩酸、硫酸等の無機酸、苛性カ
リ、苛性ソーダ、アンモニア等のアルカリで調節すれば
よい。培地殺菌の条件は、例えば、１００〜１３０℃、
５〜３０分、好ましくは１１５〜１２５℃、１０〜２０
分である。

【００１５】前記のようにして作られた培地に、固体培
養法と同様に、ＰＧＡ生産能をもつ菌を接種すればよ
い。培養方法は静置培養法、通気培養法どちらでもよ
い。通気培養の場合は、通気条件は０．５〜２ｖｖｍ、
好ましくは０．８〜１．２ｖｖｍである。静置、通気培
養のどちらの方法にしても、温度は３０〜５０℃、好ま
しくは３７〜４３℃である。培養時間は１５〜３０時
間、好ましくは１８〜２５時間である。このようにし
て、１〜１０％（ｗ／ｗ）のＰＧＡを含む液が得られ
る。

【００１６】（培養物からの分離精製法）次に、このよ
うにして得られたＰＧＡを含む固体培養物、又は液体培
養物を、そのまま酸又はアルカリ処理に使用してもよい
が、これらの培養物から分離、精製して得たＰＧＡを使
用する方が好ましい。この分離、精製方法には、例えば
以下の方法があるが、本発明にはどのような方法を採用
してもよい。 （１）固体培養物からの２０％以下の食塩水による抽出
分離法（特開平３−３０６４８）。 （２）硫酸銅による沈澱法（Ｔｈｒｏｎｅ．Ｂ．Ｃ．，
Ｃ．Ｃ．Ｇｏｍｅｚ，Ｎ．Ｅ．Ｎｏｕｅｓ ａｎｄ
Ｒ．Ｄ．Ｈｏｕｓｅｖｒｉｇｈｔ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ．，６８巻、３０７ページ、１９５４年）。 （３）アルコール沈澱法（Ｒ．Ｍ．Ｖａｒｄ，Ｒ．Ｆ．
Ａｎｄｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｆ．Ｋ．Ｄｅａｎ：Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅ
ｒｉｎｇ，５巻、４１ページ、１９６３年；沢 純彦、
村川武雄、村尾沢夫、大亦正次郎：農化、４７巻、１５
９〜１６５ページ、１９７３年、藤井久雄：農化，３７
巻、４０７〜４１２ページ、１９６３年）。 （４）架僑化キトサン成形物を吸着剤とするクロマトグ
ラフィー法（特開平３−２４４３９２号公報）。 （５）分子限外濾過膜を使用する分子限外濾過法。 （６）（１）〜（５）の方法の適当な組合せ。

【００１７】上記の分離精製法で得られるＰＧＡはナト
リウム、カリウム、カルシウム等の塩の形態で得られら
れる。その純度は、通常それらの塩として、（１）の方
法を採用した場合は６０〜９５％、それ以外の方法の場
合は９５％以上である。

【００１８】上記のようにして得られた粗製の、又は分
離精製されたＰＧＡはどのような生産菌、培養法、及び
分離精製法を使用してもそのカルシウムイオン可溶化活
性は低いものである。特に液体培養法によって得られた
ものは著しく低い。そのようなＰＧＡのカルシウムイオ
ン可溶化活性を高めるための酸又はアルカリ処理法は以
下の通りである。

【００１９】（酸又はアルカリによるＰＧＡの処理法）
本発明に使用する酸又はアルカリは、ＰＧＡのカルシウ
ムイオン可溶化活性を高めるのに効果のあるものであれ
ばどのようなものでもよいが、好ましくは、酸として
は、例えば塩酸、硫酸の無機酸類、ギ酸、酢酸の有機酸
類、アルカリとしては、例えば苛性ソーダ、苛性カリ、
水酸化カルシウムのアルカリ類を挙げることができる。
特に処理後、中和し易い塩酸、苛性ソーダ、苛性カリ、
水酸化カルシウム等が好ましい。

【００２０】本発明における、酸又はアルカリによるＰ
ＧＡの処理条件は、ＰＧＡを含む溶液を酸又はアルカリ
で処理して得られる溶液についての、ＰＧＡ分子の末端
アミノ基に起因するニンヒドリン発色反応（Ｅ．Ｗ．Ｔ
ｅｍｍ，Ｅ．Ｃ．Ｃｏｃｋｉｎｇ：Ａｎａｌｙｓｔ．，
８０巻、２０９ページ、１９５５年）の率で規定する。

【００２１】すなわち、ニンヒドリン発色反応率は次の
式のように定義する： ｛（Ａ_x−Ａ_B）／（Ａ_C−Ａ_B）｝ｘ１００（％） Ａ_C：ＰＧＡを含む溶液を最終濃度が６Ｎの塩酸で、１
００℃、４時間の条件で、完全加水分解して得られる溶
液について、ニンヒドリン試薬とＰＧＡ分子の末端遊離
アミノ基とで発色反応させ、その発色量を波長５６０ｎ
ｍで測定して得られる測定値。 Ａ_x：ＰＧＡを含む溶液を任意の条件の酸又はアルカリ
で処理して得られる液について、ＰＧＡ分子の末端遊離
アミノ基に起因する、前記同様のニンヒドリン発色反応
の発色量の測定値。 Ａ_B（ブランク値）：酸又はアルカリ処理を施さない、
ＰＧＡを含む溶液について前記同様のニンヒドリン発色
反応の発色量の測定値。

【００２２】ただし、上記のニンヒドリン反応に使用す
る、ＰＧＡを含む溶液においてＰＧＡ以外のポリペプタ
イドを含む場合は、その溶液のＰＧＡの正確な含有量と
その分子量を、後記の方法で、前以て測定する。その測
定結果に基づいて、供試の溶液に含まれるＰＧＡの分子
量及びそのＰＧＡ含有量が同じであるモデル溶液を、標
準品のＰＧＡで調製する。このモデル溶液について、種
々の条件で酸又はアルカリ処理し、上記と同様にして本
発明の目的に合った、ＰＧＡのニンヒドリン発色反応率
を求める。このようにして求められたニンヒドリン発色
反応率で規定された条件下に、酸又はアルカリ処理を行
う。

【００２３】本発明における酸又はアルカリの処理は、
上記のように定めたニンヒドリン発色反応率が０．４〜
６％、好ましくは２〜３％で行うのがよい。どのような
酸又はアルカリ処理においても、そのようなニンヒドリ
ン発色率になるようにその条件が設定されると、そのＰ
ＧＡのカルシウムイオン可溶化活性を著しく高めること
が出来る。すなわち、ニンヒドリン発色反応率が上記の
値の範囲に達しないような酸又はアルカリ処理を行った
場合は、本発明における目的のカルシウムイオン可溶化
活性値に達しない。またニンヒドリン発色反応率が上記
の範囲を超えるような酸又はアルカリ処理の場合は、か
えってカルシウムイオン可溶化活性は低下する。

【００２４】この酸又はアルカリ処理方法を更に具体的
に示すと、例えば次のとおりである。 （１）供試溶液のＰＧＡ濃度：０．５〜２％、好ましく
は０．８〜１．２％。 （２）酸、アルカリの最終添加濃度：０．０１〜１Ｎ、
好ましくは０．０８〜０．２Ｎ。 （３）処理温度：８０〜１００℃、好ましくは８５〜９
５℃。 （４）処理時間：３０分〜５時間、好ましくは５０分〜
２時間。 （１）〜（４）の条件の各々を適当に組合せて、ニンヒ
ドリン発色反応率が０．４〜６％，好ましくは２〜３％
になるように処理条件を設定して、ＰＧＡを含む溶液を
酸、アルカリで処理する。次いで、処理して得た液を、
必要なときには直ちに冷して、苛性カリ、苛性ソーダ、
塩酸、硫酸等で中和する。

【００２５】（カルシウムイオン可溶化剤の形状）上記
のようにして、酸又はアルカリ処理して得られる処理物
から、次のような形状の、カルシウムイオン可溶化活性
の高いＰＧＡ、すなわちカルシウムイオン可溶化剤を製
造することができる。

【００２６】（１）処理物をそのまま凍結、噴霧、熱
風、減圧等の乾燥をして粉末の形態にする。 （２）培養液より、分離精製されたＰＧＡを用いて、酸
又はアルカリ処理を行った場合は、中和液そのものを用
いてよい。 （３）分離、精製を行う：その際、前記した培養液より
のＰＧＡの分離精製方法をそのまま用いることができ
る。また、カルシウムイオン等の金属イオンとエタノー
ルを加えて、ＰＧＡを沈澱分離する方法（Ｒ．Ｆ．Ｐｅ
ｔｅｒｓｏｎ外、Ｊ．ｏｆＡｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，
８０巻、９５ページ、１９５８年）を採用てもよい。こ
れらの分離精製の方法においては、処理されたＰＧＡは
ナトリウム、カリウム、カルシウム等の塩の形態で得ら
れる。

【００２７】このようにして得られたカルシウムイオン
可溶化剤に、塩化カルシウム、澱粉、フラクタン、メチ
ルセルロース、デキストリン、グルコース、マルトース
等の賦形剤を加えるか、又は加えないで、通常の方法に
より粉末の形状、顆粒状、錠剤、又は、水等の溶媒に溶
かした溶液、又はゲル等の形状にする。

【００２８】（本発明におけるカルシウムイオン可溶化
剤の特長）前記のようにして、酸又はアルカリ処理で得
られる、本発明のＰＧＡのカルシウムイオン可溶化活性
値は、固体培養法から得られたものの場合、未処理もの
に比べて約１．２〜１．３倍になる。また、液体培養法
から得られたものの場合、未処理のものの活性が特に低
いこともあって、約１．７〜１．８倍にも達する。この
ように本発明の方法は、液体培養法で生産されるＰＧＡ
のカルシウムイオン可溶化活性を高めるのに最も効果が
ある。また、酸又はアルカリ処理された、本発明のＰＧ
Ａを含む溶液の粘度は、例えば、ＰＧＡとしての０．１
％溶液では（３０℃で測定して）、未処理のものに比較
して約１／１０〜１／２０に下がる。また水にもよく溶
ける。例えば、分離精製して得た、処理されたＰＧＡの
ナトリウム塩の凍結乾燥品１ｇを水１００ｍｌに溶かす
時間は１〜２分であるが、未処理のＰＧＡの場合では１
０分以上である。

【００２９】（用途）このようにして製造される本発明
のカルシウムイオン可溶化剤は、カルシウムイオン可溶
化活性が極めて高いので、生長期の児童のカルシウムイ
オン補強剤とか、老年期の骨粗鬆症等におけるカルシウ
ムイオンの吸収と排出のアンバランスに基づく病気を予
防、又は改善するカルシウムイオン腸管吸収促進剤とし
てそのまま利用できる。すなわち、本発明のカルシウム
イオン可溶化剤を毎日少量ずつ服用すればよい。その摂
取量は、例えばＰＧＡとして０．０５〜１．１ｇ／体重
１ｋｇ／日である。また、食品、特に果汁等の飲料に適
当量を加えて、健康食品としての利用ができる。その利
用の方法および形態はなんら制限されない。

【００３０】（各種測定法）なお、本発明において、Ｐ
ＧＡの定量、分子量測定、純度試験、粘度測定、及びカ
ルシウムイオン可溶化活性の測定とその可溶化活性値の
算出等は、次のように行れる。

【００３１】（１）定量法、並びに分子量測定法 ＰＧＡを含む溶液が不溶物を含む場合は、遠心分離法に
よりその不溶物を除いた後、必要なときは、その溶液を
適当に希釈し、ポリアクリルアミド平板電気泳動を行っ
て、分子量の大小順に分離させる。その後、ポリアクリ
ルアミド平板をメチレンブルー等の塩基性色素で通常の
方法により染色する。ＰＧＡはそれらの色素で染色され
るので、染色された部分をデンシトメリー的に測定す
る。一方前以て、標準品のＰＧＡについても上記同様の
電気泳動を行う。この標準品のＰＧＡの測定値と重量の
関係を示す直線、また、標準品のＰＧＡのアクリルアミ
ド平板上の電気泳動距離と分子量の関係を示す直線を描
いておいて、これらの直線を参照することにより、試料
中のＰＧＡの量、分子量を算出する（特願平４−２９８
９１参照）。

【００３２】（２）純度試験 ＰＧＡの各種塩の一定量（例えば１００ｍｇ〜３０００
ｍｇ）を蒸留水に溶かし、更に、最終濃度が６Ｎとなる
ように、濃塩酸を加えて、蒸留水で１００ｍｌに調製す
る。この溶液１ｍｌをガラスチューブに入れ、窒素ガス
置換下に封管する。このガラスチューブを１００℃で４
時間加熱する。このようにしてＰＧＡを完全加水分解し
て得られる溶液中のグルタミン酸をアミノ酸分析機（日
立Ｌ−８５００，日立株式会社製）で測定し、その測定
値に基づいて、ＰＧＡの塩の量を計算する。この際、前
記のポリアクリルアミド平板電気泳動法でＰＧＡの分子
量を前以て測定しておく。もし分子量が複数にわたると
きには算術的な平均分子量を計算する。そうすることに
より試料中のＰＧＡのグラム分子量（モル数）が、アミ
ノ酸分析機で測定したグルタミン酸量から算出できる。
そこで純度は、〔モル数ｘＰＧＡ又はその各種塩として
の分子量（ｇ）／分析に使用した重量〕ｘ１００（％）
で表わされる。

【００３３】（３）粘度の測定法 粘度は試料濃度０．１％（ＰＧＡとしての濃度）、３０
℃で、オストワルド粘度計を使用し、水を対照として測
定した。

【００３４】（４）カルシウムイオン可溶化活性の測
定、及びその活性値の算出 １０ｍＭ塩化カルシウム溶液１ｍｌと２０ｍＭリン酸カ
リウム緩衝液２ｍｌと各種濃度（反応液中、ＰＧＡして
最終濃度が０．０１〜０．０４％になる濃度）のＰＧＡ
を含む溶液１ｍｌを混合して（三者混合液）、３７℃で
２時間放置する。リン酸カルシウムの沈澱を十分に生成
させた後、３０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離でその沈
澱を除いて、その上清液の可溶性カルシウムイオン量を
原子吸光計で測定する。この上清液中の測定されたカル
シウムイオン量を以て、ＰＧＡのカルシウムイオン可溶
化活性とした。なお、上記測定において、２０ｍＭリン
酸カリウム緩衝液の代りに蒸留水を用いた場合の上清液
中のカルシウムイオン量（比較対照）を１００のカルシ
ウムイオン可溶化活性値として、試料の可溶化活性値を
算出する。すなわち、（試料溶液の測定値／比較対照の
溶液の測定値）ｘ１００（％）の式で算出する。

【００３５】

【実施例】次に本発明を実施例を以て具体的に説明す
る。しかし本発明における方法はこれらの実施例の態様
に限定されるものでない。 実施例１ 丸豆大豆７５０ｇを水道水で洗った後、この洗った大豆
を水道水３ｌに、２０℃で１８時間、浸漬した。この浸
漬大豆約１．５ｋｇをシャーレに小分けし、１２０℃、
２０分間オートクレーブで蒸した。この蒸した大豆の温
度が約９０℃になるまで冷して、ＰＧＡ高生産能をもっ
ている納豆菌（宮城野菌）の芽胞子を１ｘ１０⁴個／原
料大豆１ｇの割合で蒸煮大豆に接種した。次に温度４０
℃、湿度９０％の条件で２０時間培養して、ＰＧＡを生
産させた。ＰＧＡは、分子量が３０万で、０．０５ｇ／
原料丸豆大豆１ｇが生産されていた。

【００３６】得られた固体培養物１．５ｋｇに１０％食
塩水１０ｌを添加し、よく培養物と食塩水を混合した。
更に、次のようにしてこの混合液からＰＧＡを分離精製
した。ガーゼで固形物を除いた後、遠心分離をおこなっ
た。得た上清液をケイソウ土で濾過し、更に０．３μｍ
のポリビニールスルホン膜で濾過して菌体及び芽胞子を
除いた。得られた清澄液１０ｌから、分画分子量１０万
の限外濾過膜を用いてＰＧＡを分離精製した。すなわち
清澄液を限外濾過膜で５００ｍｌに濃縮した後、新たに
蒸留水５ｌを加えて、再度この限外濾過膜による濃縮を
行う操作（以下、本発明ではこの操作を脱塩濃縮精製操
作と称する）を５回繰り返した。それにより夾雑物質、
着色物質、匂い等の除去および脱塩を行なった。その結
果として、ＰＧＡのナトリウム塩を含む、無色透明、無
味無臭の溶液を得た。これを凍結乾燥して、得たＰＧＡ
のナトリウム塩の白色粉末は３０ｇであった。純度はＰ
ＧＡナトリウム塩として９５％（ＰＧＡして８０％）
で、分子量はＰＧＡとして３０万であった。０．１％
（ＰＧＡとしての濃度）水溶液の比粘度は１．４であっ
た。

【００３７】このようにして得られたＰＧＡのナトリウ
ム塩を、ＰＧＡとして１％の濃度（ナトリウム塩として
１．１６％の濃度）となるように蒸留水に溶かした。ま
た同時に最終濃度が０．０１Ｎとなるように５Ｎ塩酸を
加えた。この溶液について１００℃で９０分間の酸処理
を行なった。処理後直ちに冷して、０．１Ｎ苛性ソーダ
溶液を用いて中和した。この中和溶液１ｌについて、分
画分子量１０万の限外濾過膜で前記と同様な脱塩濃縮精
製操作を２回行なった後、凍結乾燥を行なって、酸処理
を受けたＰＧＡの白色粉末のナトリウム塩、すなわちカ
ルシウムイオン可溶化剤１０ｇを得た。純度はナトリウ
ム塩として９９％（ＰＧＡして８５％）で、ＰＧＡとし
ての分子量が１ー５万にわたるものの混合物であった。
なお、この場合、塩酸処理によるニンヒドリン発色反応
率は３％（Ａ_C＝１．２３４，Ａ_X＝０．９９１，Ａ_B＝
０．０６４）であった。

【００３８】この塩酸処理をして得たＰＧＡ（カルシウ
ムイオン可溶化剤）（本発明）、及び未処理のＰＧＡ
（対照）の各種濃度における、カルシウムイオン可溶化
活性値を表１に示す。なお、表１において、ＰＧＡの濃
度とは、前記カルシウムイオン可溶化活性値を測定する
際の反応液（三者混合液）中における、ＰＧＡの最終濃
度を、またカッコ内はナトリウム塩としての最終濃度を
意味する。

【００３９】 表１ ──────────────────────────────────── ＰＧＡの濃度（％） カルシウムイオン可溶化活性値（％） 活性増加 本発明 対照 本発明の値／対照の値 ──────────────────────────────────── ０．０１（０．０１２） ９３ ７７ １．２ ０．０２（０．０２３） ９９ ８０ １．２ ０．０３（０．０３５） ９９ ８１ １．２ ０．０４（０．０４７） １００ ８２ １．２ ０（コントロール） ０ ０ ──────────────────────────────────── 表１から、本発明の方法により得られたカルシウムイオ
ン可溶化剤は、その可溶化活性が対照に比較して極めて
高いことが分る。

【００４０】また、塩酸処理することによりＰＧＡの粘
度が下がるので、限外濾過膜を使用しての脱塩と濃縮の
操作は、非常に容易になった。また、酸処理されたＰＧ
Ａのナトリウム塩の、本実施例の乾燥粉末は、蒸留水１
００ｍｌにその１ｇを溶かす時間は１分で、水によく溶
けるようになったが、未処理のものでは１５分という長
い時間が必要であった。また、酸処理された、本実施例
のＰＧＡのナトリウム塩の、ＰＧＡとしての０．１％濃
度の水溶液の粘度は０．１で、未処理のものの粘度１．
４に比べると、１／１４に減少していた。このようにＰ
ＧＡを塩酸処理することによりＰＧＡの粘度が下がるの
で、限外濾過膜を使用しての脱塩と濃縮の操作は、非常
にやさしいものになった。

【００４１】実施例２ 丸豆大豆５ｋｇに５０ｌの水道水を加えて、１２５℃、
３０分間オートクレーブにて蒸煮した後、ガーゼで大豆
を除いて、大豆煮汁を得た。３０ｌ容ジャーファーメン
ターに１５ｌの大豆煮汁を入れて、ＰＧＡ生産能をもつ
納豆菌（宮城野菌）の芽胞子を１×１０⁴個／煮汁１ｍ
ｌの割合で接種した。次に、温度３７℃、通気量１ｖｖ
ｍ、及び攪拌数３００ｒｐｍの条件で、１８時間培養し
てＰＧＡを生産させた。培養後、最終濃度が５％となる
ように食塩を加えて粘度を下げた後、８０００ｒｐｍ、
３０分間の遠心分離操作により除菌して、上清液１２．
５ｌを得た。得られた上清液を２５ｌの９４％（ｖ／
ｖ）エタノール中に攪拌しながら注入して、粘塊の沈澱
を得た。これを再び蒸留水に溶かした後、セルローズ透
析チューブを用いて、蒸留水に対して透析し、低分子物
質を除いた。このエタノール沈澱と蒸留水に対する透析
の操作を５回繰り返した後、凍結乾燥して、ＰＧＡのナ
トリウム塩の白色粉末１５ｇを得た。なお、培養液に生
成したＰＧＡは１０ｇ／ｌで、ＰＧＡとしての分子量は
３０万であった。また、得られたＰＧＡのナトリウム塩
の純度はナトリウム塩として９５％（ＰＧＡとして８０
％）で、０．１％（ＰＧＡとしての濃度）水溶液の粘度
は１．４であった。

【００４２】このようにして得られたＰＧＡのナトリウ
ム塩の粉末をＰＧＡとして１％となるように蒸留水に溶
かした。また同時に最終濃度が０．０１Ｎとなるように
５Ｎ硫酸を加えた。この溶液について１００℃、１時間
の条件で硫酸処理を行なった。処理後直ちに冷して、
０．１Ｎ水酸化ナトリウムを用いて中和した。この中和
溶液１ｌについて、分画分子量１０万の限外濾過膜を用
いて、実施例１と同様な脱塩濃縮精製操作を２回行なっ
た後、凍結乾燥を行なった。酸処理されたＰＧＡのナト
リウム塩の白色粉末、すなわちカルシウムイオン可溶化
剤９．５ｇを得た。その純度はナトリウム塩として９８
％（ＰＧＡとして８４％）、分子量はＰＧＡとして２〜
４万にわたる混合物であった。

【００４３】なお、本実施例における酸処理のニンヒド
リン発色反応率は２．５％（Ａ_C＝１．２３６，Ａ_X＝
０．９４２，Ａ_B＝０．０６５）であった。また、前記
カルシウムイオン可溶化活性値を測定する際の反応液
（三者混合液）中における、酸処理されたＰＧＡの最終
濃度０．０１％（ＰＧＡとしての濃度）（ＰＧＡのナト
リウム塩としては０．０１２％の濃度）における、対照
（硫酸未処理）のＰＧＡのカルシウム可溶化活性値は５
６（％）であったが、酸処理された、本実施例の酸処理
されたＰＧＡすなわちカルシウムイオン可溶化剤の可溶
化活性値は９８（％）で、その増加は１．８倍であっ
た。

【００４４】また、酸処理された、本実施例のＰＧＡの
ナトリウム塩は実施例１と同様に水によく溶けるように
なり、更に、この物質の水溶液の比粘度も、硫酸未処理
のものに比較して実施例１と同様に著しく下がってい
た。

【００４５】実施例３ 実施例１で得られた酸未処理のＰＧＡナトリウム塩をＰ
ＧＡとして１％（ＰＧＡのナトリウム塩として１．１６
％）となるように蒸留水１ｌに溶かした。また同時に最
終濃度が０．５Ｎとなるように３０％水酸化ナトリウム
溶液を添加した。この溶液について１００℃、３０分間
の条件でアルカリ処理を行なった。処理後直ちに冷して
１Ｎ塩酸を用いて中和した。この溶液１ｌについて、実
施例１と同様に、分画分子量１０万の限外濾過膜で脱塩
濃縮精製を２回行なった後、凍結乾燥してアルカリ処理
されたＰＧＡのナトリウム塩の白色粉末、すなわちカル
シウムイオン可溶化剤９．７ｇを得た。純度はナトリウ
ム塩として９９％（ＰＧＡとして８５％の濃度）、分子
量はＰＧＡとして３〜５万にわっていた。

【００４６】なお、本実施例のアルカリ処理におけるニ
ンヒドリン発色反応率は２．８％（ＡC＝１．２４，Ａ_X
＝０．９３９，Ａ_B＝０．０７０）であった。０．０１
％濃度（ＰＧＡとしての濃度）（ＰＧＡのナトリウム塩
としては０．０１２％の濃度）における、対照（アルカ
リ未処理）のＰＧＡのカルシウムイオン可溶化活性値は
７５（％）であるのに、本実施例によって得られる、ア
ルカリ処理されたＰＧＡのカルシウムイオン可溶化剤の
その可溶化活性値は９２（％）で、その増加は１．２倍
であった。本可溶化剤０．１％（ＰＧＡとしての濃度）
の水溶液の比粘度は、０．１で未処理のＰＧＡに比べて
１／１４に下がっていた。またアルカリ未処理のＰＧＡ
のナトリウム塩の凍結乾燥品１ｇを蒸留水１００ｍｌに
溶かす時間は２０分を必要としたが、本実施例の可溶化
剤の場合では１分と短くなった。

【００４７】実施例４ 実施例１と同様にして得た未処理のＰＧＡのナトリウム
塩について、やはり実施例１と同様な酸処理を行って得
たＰＧＡを含む溶液を、水酸化カルシウムで中和して、
分画分子量１０万の限外濾過膜で脱塩濃縮を２回行なっ
た後、約５％のＰＧＡ濃度になるように水で調製した。
この溶液３００ｍｌに１５ｇのデキストリン（ＤＥ値８
〜１０）を加えて溶かした後、１分間あたり１２ｍｌの
送量でモービルマイナー型スプレードライヤーに投入し
た。１５０℃の熱風温度、９５℃の排風温度で噴霧乾燥
して、酸処理されたＰＧＡの含有量が５０％の粉末状の
カルシウムイオン可溶化剤８ｇを製造した。

【００４８】（応用例）次に本発明によって得られるカ
ルシウムイオン可溶剤の応用例を示す。５０％のりんご
濃縮果汁２．１ｇ，水あめ１０ｇ，クエン酸０．１５
ｇ，乳酸カルシウム１５．５ｇ，実施例３で得られたカ
ルシウムイオン可溶化剤（純度９９％のＰＧＡのナトリ
ウム塩）４ｇ、ビタミンＣ０．０４ｇを水に溶かして、
全量を２００ｇになるようにした。１３０℃，３分の条
件で加熱殺菌して、酸処理されたＰＧＡを含有するりん
ご清涼飲料を製造した。

【００４９】

【発明の効果】本発明は、上記に詳しく説明したよう
に、以下のような効果を奏する。すなわち本発明の方法
は：（１）カルシウムイオン可溶化活性が著しく高い、
（２）水によく溶ける、（３）安価である、（４）ＰＧ
Ａを酸又はアルカリ処理することにより粘度は著しく下
がるので、その処理されたものの溶液の取り扱いが極め
て容易である、カルシウムイオン可溶化剤を製造でき
る。

フロントページの続き (72)発明者 湯浅 克己 千葉県野田市野田339番地 キッコーマン 株式会社内 (72)発明者 茂田井 宏 千葉県野田市野田339番地 キッコーマン 株式会社内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 微生物の生産するガンマー・ポリグルタ
   ミン酸を酸又はアルカリで処理することを特徴とするカ
   ルシウムイオン可溶化剤の製造法。