CN117186395A - 一种聚谷氨酸钙的制备方法及其应用 - Google Patents
一种聚谷氨酸钙的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种聚谷氨酸钙的制备方法及应用,通过调整工艺参数,可以制备得到不同分子量的聚谷氨酸钙,钙的质量分数为10%~12%,可作为人体膳食钙补充剂,其中聚谷氨钙的分子量优选400 kDa~1000 kDa。本发明制备得到的聚谷氨酸钙安全高效,能够显著促进肠细胞对钙的吸收利用。
Description
技术领域
本发明属于食品营养技术领域,具体涉及一种聚谷氨酸钙的制备工艺及其应用。
背景技术
钙是人体的必需元素之一,主要以钙离子的形式存在于人体中。钙具有促进凝血、强化骨骼、维持神经和肌肉活动、调节酶的活性等功能。通过膳食补钙剂补充钙缺失对国民身体健康具有重要的意义。
目前补钙剂已经历了三个发展阶段:第一阶段是无机补钙剂,以碳酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙为主要原料,尽管钙含量高,但生物利用度在30~40%左右;第二阶段是有机钙,包括葡萄糖酸钙、柠檬酸钙、乳酸钙、醋酸钙等,生物利用度在50%作用;第三阶段是螯合钙,主要包括氨基酸钙、多肽钙等,生物利用度可达70%以上。当前安全高效的螯合钙依然是食品研发的主要热点。
发明内容
发明目的:本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足,提供一种安全高效的聚谷氨酸钙的制备方法,能够显著促进肠细胞对钙的吸收利用。
为了解决上述技术问题,本发明公开了一种聚谷氨酸钙的制备方法,包括如下步骤:
(1)将聚谷氨酸发酵液过滤除菌,获得澄清发酵滤液,优选地通过0.22μm的陶瓷膜进行过滤除菌;
(2)向发酵滤液中加入1/5~1/4体积的质量分数为30%~40%的硫酸铜溶液,充分搅拌,析出蓝色沉淀,即为聚谷氨酸-铜复合沉淀;优选地,加入1/5体积的质量分数为40%的硫酸铜溶液,充分搅拌,析出蓝色沉淀,即为聚谷氨酸-铜复合沉淀;
(3)将析出的聚谷氨酸-铜复合沉淀用过滤离心机洗涤,至离心液无色,除去发酵液中的可溶性盐等杂质,然后继续离心脱水;
(4)将洗涤脱水后的沉淀溶于2~2.5倍质量(相对于沉淀的质量)的草酸溶液,充分搅拌反应6~12小时,使聚谷氨酸重新溶解,铜离子则与草酸结合形成新的沉淀,得到蓝色悬浮液;
(5)用沉降式离心机对蓝色悬浮液进行分离,保留清液,弃掉蓝色的草酸铜沉淀;
(6)将离心清液再通过过滤进一步除去不溶性颗粒,优选地利用0.22滤膜进行过滤,得到无色滤液;
(7)向无色滤液中边搅拌边加入氢氧化钙,至滤液pH为3.5~4.0,将反应液过滤,优选地,使用0.22滤膜过滤,除去反应生成的不溶的草酸钙沉淀,得到无色透明滤液,即为聚谷氨酸溶液;
(8)向聚谷氨酸溶液中继续边搅拌边加入氢氧化钙,至滤液pH为7.0~7.5,使聚谷氨酸中的羧基与钙离子充分结合,将反应液再通过过滤,如通过0.22滤膜过滤,除去溶液中的不溶物,如氢氧化钙不溶物,得到无色透明滤液,即为聚谷氨酸钙溶液;
(9)将聚谷氨酸钙溶液通过喷雾干燥器干燥,得到白色粉末,即为制备的聚谷氨酸钙。
其中,为了制备得到不同分子量的聚谷氨酸钙,所述聚谷氨酸发酵液中,聚谷氨酸重均分子量不低于1800kDa。在一个具体的实施例中,可以采用枯草芽孢杆菌(纳豆芽孢杆菌Bacillus subtilis natto XK-01(CCTCC NO:M2022599)为生产菌株进行发酵得到聚谷氨酸,所述菌株的详细信息披露于CN202310412834.2中。
具体地,经过步骤(4)处理后,通过调整草酸质量分数和反应时间,制备不同分子量的聚谷氨酸钙。
其中,洗涤脱水后的沉淀溶于2.5倍质量的草酸溶液,草酸质量分数为2%~6%。
更进一步地:
(1)当草酸质量分数为6%,反应时间为6~8小时,最终制备的聚谷氨酸钙分子量在100kDa~300kDa;
(2)当草酸质量分数为6%,反应时间为8~10小时,最终制备的聚谷氨酸钙分子量在10kDa~100kDa;
(3)当草酸质量分数为6%,反应时间为10~12小时,最终制备的聚谷氨酸钙分子量在5kDa~10kDa;
(4)草酸质量分数为4%,反应时间为6~8小时,最终制备的聚谷氨酸钙分子量在800kDa~1000kDa;
(5)草酸质量分数为4%,反应时间为8~10小时,最终制备的聚谷氨酸钙分子量在600kDa~800kDa;
(6)草酸质量分数为4%,反应时间为10~12小时,最终制备的聚谷氨酸钙分子量在300kDa~600kDa;
(7)草酸质量分数为2%,反应时间为8~10小时,最终制备的聚谷氨酸钙分子量在1300kDa~1600kDa;
(8)草酸质量分数为2%,反应时间为10~12小时,最终制备的聚谷氨酸钙分子量在1000kDa~1300kDa。
优选地,制备的聚谷氨酸钙中,钙的质量分数为10%~12%。
优选地,制备得到的聚谷氨酸钙的分子量范围为400kDa~1000kDa,更优选地,制备得到的聚谷氨酸钙的分子量范围为500-700kDa。
本发明进一步公开了通过上述制备方法制备得到的聚谷氨酸钙在制备膳食补钙剂上的应用。
具体地,所述聚谷氨酸钙进入胃肠道后,可减缓膳食抑制因子对钙离子的钝化作用,促进钙离子在肠道中的溶解度,提高肠道细胞对钙离子的吸收;其中所述的膳食抑制因子为磷酸盐、草酸、植酸、单宁中的任意一种或几种的组合。
优选地,所述聚谷氨酸钙的剂型为固体钙片或液体补钙剂。
有益效果:本发明制备的聚谷氨酸钙进入胃肠道后,可减缓膳食抑制因子(如磷酸盐、草酸、植酸、单宁等)对钙离子的钝化作用,促进钙离子在肠道中的溶解度,提高肠道细胞对钙离子的吸收。同时,本申请的聚谷氨酸钙的制备方法简单,重复性好,避免了传统聚谷氨酸纯化过程中乙醇的大量使用,节约了原料成本。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明,本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为等温滴定法测定γ-PGA结合钙的热力学参数;
图2为γ-PGA与Ca2+的螯合后的结构表征;
图3为PGA-Ca复合物体外模拟胃肠道消化过程中的变化;(a)钙的释放率,(b)PGA-Ca复合物消化前后的分子量变化;
图4为膳食抑制因子存在下,聚谷氨酸钙对Ca2+细胞吸收的促进作用;
图5为聚谷氨酸钙对Ca2+跨细胞转运的影响;
图6为不同处理组小鼠的表观钙吸收率;
图7为不同处理组的小鼠血清钙含量(a),血清磷含量(b),血清碱性磷酸酶活性(c)。不同字母表示组间差异显著(P<0.05);
图8为不同钙处理对小鼠骨小梁微结构的影响。
具体实施方式
实施例1:聚谷氨酸发酵液的制备。
参照专利CN202310412834.2,以枯草芽孢杆菌(纳豆芽孢杆菌Bacillus subtilisnatto XK-01(CCTCC NO:M2022599)为生产菌株进行发酵可以生产γ-聚谷氨酸,具体为:
(1)菌种活化:将保藏的菌种划线于固体平板培养基,32.5℃培养24h进行活化。固体培养基组成为:蛋白胨10g/L,牛肉膏3g/L,NaCl 5g/L,琼脂20g/L,pH 6.8-7.0;
(2)种子液培养:将活化后的菌种接入种子培养基进行扩培,用恒温振荡培养箱于220rpm下37℃培养16h,获得种子液。种子培养基组成为:葡萄糖20g/L,酵母膏5g/L,K2HPO4·3H2O2 2g/L,MgSO4 0.25g/L,L-谷氨酸10g/L,pH7.0。
(3)发酵培养:以2%接种量将种子液转移到发酵培养基中,发酵罐为1000L,装液量为750L,通气量为1.2vvm,搅拌转速为400rpm,于37℃培养48h。发酵培养基配方为:葡萄糖为50g/L,味精40g/L,酵母膏5g/L,K2HPO4·3H2O 2g/L,MgSO4 0.6g/L,MnSO4 0.3g/L,初始pH 7.0。
按照上述工艺生产的γ-聚谷氨酸产量为45g/L,重均分子量为1950kDa,本申请中聚谷氨酸分子量采用凝胶色谱柱法测定,具体参考标准《γ-聚谷氨酸QB/T5189-2017》中的方法进行测定。
实施例2:不同分子量聚谷氨酸钙的制备。
取10L实施例1制备的聚谷氨酸发酵液为原料,制备聚谷氨酸钙,具体工艺如下:
(1)将聚谷氨酸发酵液通过0.22μm的陶瓷膜过滤除菌,获得澄清发酵滤液;
(2)向发酵滤液中加入1/5体积的质量分数为40%的硫酸铜溶液,充分搅拌,析出蓝色沉淀;
(3)将析出的蓝色沉淀用过滤离心机洗涤,至离心液无色,然后继续离心脱水;
(4)将洗涤脱水后的沉淀溶于2.5倍质量的草酸溶液(质量分数为2%~6%),充分搅拌反应6~12小时,得到蓝色悬浮液;
(5)用沉降式离心机对蓝色悬浮液进行分离,保留清液,弃掉蓝色沉淀;
(6)将离心清液再通过0.22滤膜,进一步除去不溶性颗粒,得到无色滤液;
(7)向无色滤液中边搅拌边加入氢氧化钙,至滤液pH为4.0,将反应液过0.22滤膜,除去反应生成的不溶沉淀,得到无色透明滤液;
(8)向滤液中继续边搅拌边加入氢氧化钙,至滤液pH为7.0,将反应液再通过0.22滤膜,除去溶液中的不溶物,得到无色透明滤液;
(9)将得到的无色透明滤液通过喷雾干燥器干燥,得到白色粉末,即为制备的聚谷氨酸钙。
通过调整步骤(4)中草酸质量分数和反应时间,最终可以制备不同分子量的聚谷氨酸钙,具体结果如下表所示:
草酸质量分数 | 反应时间 | 制备的聚谷氨酸钙平均分子量 |
6% | 12h | 5kDa |
6% | 9 h | 56kDa |
6% | 8h | 100kDa |
4% | 11h | 460kDa |
4% | 10.5h | 530kDa |
4% | 9h | 690kDa |
4% | 7.5h | 840kDa |
4% | 6h | 1000kDa |
2% | 11h | 1180kDa |
2% | 9h | 1470kDa |
实施例3:不同分子量聚谷氨酸钙对钙吸收的影响。
为了评估不同分子量聚谷氨酸钙(PGA-Ca)对体内钙吸收的影响,通过灌胃的方式对C57BL/6小鼠(3月龄)进行研究。将小鼠分为碳酸钙组(CaCO3)、PGA-Ca1组(5kDa)、PGA-Ca2组(56kDa)、PGA-Ca3组(100kDa)、PGA-Ca4组(460kDa)、PGA-Ca5组(530kDa)、PGA-Ca6组(690kDa)、PGA-Ca7组(840kDa)、PGA-Ca8组(1000kDa)、PGA-Ca9组(1180kDa)、PGA-Ca10组(1470kDa),日常饲喂钙含量为0.1%的低钙饲粮,饮用去离子水,连续饲喂4周。其中,碳酸钙组每日灌胃0.5mL CaCO3溶液(17.5mg/mL);PGA组每日灌胃0.5mL PGA-Ca溶液(63.1mg/mL,PGA-Ca中钙含量为11.1%)。
饲养的第4周进行钙平衡试验,连续3天,每天记录摄食量,收集粪便。粪便在550℃灰化6h,灰化样品经硝酸溶液(1+1)溶解,粪便中钙含量用电感耦合等离子发射光谱仪(ICP)测定。表观钙吸收率计算如下:
摄入钙=饲粮钙+灌胃钙
不同处理组的钙表观吸收率如表1所示,与碳酸钙组相比,不同分子量的聚谷氨钙都能对小鼠的钙吸收起到一定的促进作用。但分子量低于400kDa及分子量高于1000kDa时,钙表观吸收率增加不明显。当聚谷氨酸钙分子量在400kDa~1000kDa时,对钙吸收的促进作用尤为显著。
表1不同处理组小鼠的钙表观吸收率
实施例4:聚谷氨酸与Ca2+的螯合常数测定
使用ITC200型量热仪测定聚谷氨酸(γ-PGA,分子量为530kDa)与Ca2+的螯合常数。将γ-PGA溶解于超纯水中配制成浓度为0.36μM的反应液。分别向ITC200的反应池和参照池注入γ-PGA溶液和超纯水。用18mM的CaCl2溶液进行滴定,所有溶液在37℃下真空脱气10min。每次以2μL CaCl2溶液进行滴定,共滴定20次。滴定过程中,连续两次注射间隔600s,实验的搅拌速度设定为300rpm。采用ITC200提供的Origin 7.0软件进行数据分析,并选择独立的绑定模型。
如图1所示,得到了热量随时间变化的典型剖面。结果表明,CaCl2溶液分散20次后吸热峰逐渐降低,达到热力学稳定状态,表明γ-PGA与Ca2+的结合达到了饱和。ITC数据与单位点模型最吻合,反应化学计量值(N)为970±56.5,表明γ-PGA具有970个功能钙结合位点。根据γ-PGA的相对分子质量不难计算出每3.6个谷氨酸单位可以螯合Ca2+。根据焓变(ΔH)和熵变(ΔS),可以计算出吉布斯自由能(ΔG)为负,即ΔG=ΔH-TΔS,表明在37℃(310K)下,钙与γ-PGA的反应是自发的。γ-PGA与Ca2+的亲和力K值为6.50±2.47×104M-1,位于钙结合蛋白(1×105-7M-1)和磷酸盐(1×103-4M-1)之间(Ohnson et al.,Plos One,2016,11(7),e0160168;Marsh&Sass,Biochemistry,1984,23(7),1448-1456)。因此,PGA-Ca螯合物确保钙既不会被磷酸盐等膳食抑制剂竞争,又能够被钙结合蛋白运输和吸收。
实施例5:聚谷氨酸钙的结构表征。
为了揭示聚谷氨酸钙(PGA-Ca)的结构特性,以530kDa分子量PGA-Ca作为研究对象,分别采用紫外光谱、zeta电位、红外光谱对PGA-Ca螯合物进行表征。紫外光谱结果如图2a所示,在UV波长范围内(190-240nm),γ-PGA(530kDa)和PGA-Ca的吸收峰分别出现在193nm和195nm处,说明钙螯合并没有明显改变γ-PGA在UV下的特征吸收波长。但γ-PGA与钙结合后吸收强度的增加可能与手性空间结构(羰基和羧基)和发色团(氨基)的变化有关。Zeta点位表征结果如图2b所示,与未螯合Ca2+相比,PGA-Ca的zeta电位绝对值从24.61mV下降到13.88mV(P<0.01),说明钙离子的引入促进了γ-PGA分子的聚集。这种聚集可能是由于Ca2+作为桥梁使不同的γ-PGA分子聚集在一起形成微絮体,这意味着不同的γ-PGA分子之间可能发生钙螯合作用。红外光谱表征结果如图2c所示,γ-PGA与Ca2+螯合后,波数从3294.6cm-1移至3308.5cm-1,从1580.7cm-1移至1587.0cm-1,从1409.8cm-1移至1416.17cm-1。其中3294.9cm-1的峰是由N-H拉伸引起的,1580.7cm-1的峰是由酰胺II的N-H拉伸引起的,1409.8cm-1的峰是由COO-拉伸引起的。结果表明,γ-PGA的羧基键、氨基键和酰胺键参与了钙离子的螯合作用。圆二色谱(CD)表征结果如图2d、2e所示。通常,在222nm和208nm处出现双负峰,190nm附近出现一个正峰,表明α-螺旋结构的存在;在217~218nm处出现一个负峰,在195~198nm处出现一个强正峰,表明存在β-折叠结构;如果在198nm附近有一个负峰,而在220nm附近有一个小但宽的正峰,则存在无规则卷曲结构。PGA-Ca的CD谱发生了明显变化,尤其是α-螺旋结构明显转变为β-折叠结构。通过Circular Dichroism网站分析,对于PGA-Ca复合物,与γ-PGA相比(图2e),α-螺旋、β-转角、无规则卷曲分别减少了10%、1%、8%,而β-折增加了19%。这些结构变化可归因于钙离子导致分子内氢键衰变。图2f、2g为用SEM扫描的γ-PGA和PGA-Ca的表面形貌。γ-PGA表面光滑,呈网状结构;而PGA-Ca表面粗糙多孔,呈片状结构。这可能是由于Ca2+的引入打破了γ-PGA分子之间松散而有序的氢键网络,使γ-PGA分子紧密聚集,形成相对无序但致密的结构。
实施例6:聚谷氨酸钙的模拟消化实验
用去离子水配制2mg/mL PGA-Ca(分子量为530kDa)溶液10mL,再加入等体积人工胃液(pH 2.0,含0.5%胃蛋白酶)模拟胃消化。在37℃下孵育90min。在反应期间,分别于10、30、60、90min时抽取1mL消化液检测游离钙含量。模拟胃消化完成后,将pH值调至6.8,与等容量人工肠液(pH 6.8,含0.5%胰酶)混合,继续模拟肠道消化。在37℃振荡下将混合物孵育90min。分别于30、60、90min抽取1mL消化液检测游离钙含量。游离钙含量采用ICP进行测定。另取与PGA-Ca复合物中含钙量相同的CaCl2,按照上述方法进行体外消化,作为阳性对照组。消化后γ-PGA和PGA-Ca的相对分子质量变化,在HPLC上采用GPC色谱柱进行测定(色谱柱为2根Shodex OHpak SB-806M HQ柱,柱温30℃,流动相为0.2M Na2SO4,pH 4.5,紫外检测器在210nm波长处检测峰值信号)。
在本实施例中,检测了模拟胃肠道消化液中PGA-Ca复合物对可溶性Ca2+的保留率。如图3a所示,CaCl2和PGA-Ca复合物在模拟胃液环境中保持了较高的可溶性钙含量,分别达到99.6%和99.8%,这可能是由于胃液的酸性环境有利于钙的溶解。CaCl2进入模拟肠液后溶解度迅速下降,消化90min后可溶性钙在肠液中的保留率仅为26.15%。这可能是由于在模拟肠液中存在磷酸盐,导致形成不溶性磷酸钙沉淀。然而,PGA-Ca在肠液中保持了较高的溶解度,消化90min后可溶性钙的保留率为80%,表明磷酸盐难以从PGA-Ca中竞争Ca2+。这是因为γ-PGA与Ca2+的结合常数大于磷酸盐与Ca2+的结合常数。
本实施例同时检测了PGA-Ca在模拟胃肠道消化过程中的稳定性。如图3b所示,PGA-Ca的分子量和浓度在消化前后没有明显变化,说明PGA-Ca在消化后保持相对稳定,有利于钙离子在肠道内的持续释放。
实施例7:膳食抑制因子存在下,聚谷氨酸钙对Ca2+细胞吸收的促进作用。
将Caco-2细胞以1×105cell/well接种于24孔培养板上7d。用HBSS缓冲液洗涤细胞3次后,将Fluo-4 AM(钙离子荧光探针,2.5μM)加入HBSS缓冲液(pH 7.4)中,于37℃、5%CO2培养箱中避光孵育30min。随后,在每孔中分别添加5mmol/L不同的膳食因子(草酸Oxalate、植酸Phytate和单宁Tannin)和PGA-Ca(分子量为700kDa),使草酸/钙或植酸/钙或单宁/钙=1:1),1h后进行钙吸收测定,CaCl2为对照组。用胰蛋白酶消化细胞,1000rpm离心5min,用HBSS重悬混匀。Caco-2细胞内Ca2+利用荧光酶标仪检测胞内荧光强度进行测定。
结果如图4所示,经过膳食抑制因子处理后,无论对于PGA-Ca还是CaCl2,细胞对Ca2 +的吸收率显著降低。但与CaCl2组相比,在膳食抑制因作用下,PGA-Ca对钙吸收的影响显著上调,加入草率、植酸、单宁后,PGA-Ca组的钙吸收效率较CaCl2组分别提高了21.41%、16.27%、17.73%。这表明,聚谷氨钙可显著缓解膳食抑制因子对钙吸收的钝化作用。
实施例8:聚谷氨酸钙对Ca2+跨肠细胞转运的促进作用。
首先建立Caco-2单层细胞模型。具体方法为:将Caco-2细胞(第40-60代)培养于100mm细胞培养皿中,在37℃、5% CO2的细胞培养箱中进行常规培养;在生长密度达到80%时,用含有0.25% EDTA的胰蛋白酶分离Caco-2细胞,通过血球计数板计数细胞悬浮液;然后将细胞悬浮液以1×105cell/Well接种到含有聚碳酸酯膜的12孔Transwell培养小室上,同时向基底侧(BL)和顶端侧(AP)的分别添加DMEM培养基1.5mL和0.5mL;每隔一天更换两侧培养基,持续培养21天,完成模型建立。
在本实施例中,成功地构建了Caco-2单层细胞模型来研究PGA-Ca(分子量为530kDa)对钙转运的影响。如图5所示,在120min范围内,钙吸收呈时间依赖性增加。PGA-Ca处理中的钙通量始终显著高于CaCl2处理。在120min时,PGA-Ca处理的钙通量达到最大值104.35μg/孔,而CaCl2处理的钙通量达到68.51μg/孔,增加了52.3%。结果表明,PGA-Ca比CaCl2更有利于促进钙的转运和吸收。
实施例9:聚谷氨酸钙对老龄小鼠钙吸收及骨微结构的影响
为了评估聚谷氨酸钙(PGA-Ca,分子量为530kDa)对体内钙吸收的影响,通过灌胃的方式对C57BL/6老龄鼠(12月龄)进行研究。将小鼠分为空白对照组(BC)、碳酸钙组(CaCO3)、高剂量PGA-Ca组(H-PGA-Ca)和低剂量PGA-Ca组(L-PGA-Ca),日常饲喂钙含量为0.1%的低钙饲粮,饮用去离子水,连续饲喂4周。其中,空白对照组每日灌胃0.5mL的去离子水;碳酸钙组每日灌胃0.5mL CaCO3溶液(17.5mg/mL);高剂量PGA-Ca组每日灌胃0.5mLPGA-Ca溶液(63.1mg/mL,PGA-Ca中钙含量为11.1%);低剂量PGA-Ca组每日灌胃0.5mL PGA-Ca溶液(31.55mg/mL)。
饲养的第4周进行钙平衡试验,连续3天,每天记录摄食量,收集粪便。粪便在550℃灰化6h,灰化样品经硝酸溶液(1+1)溶解,粪便中钙含量用电感耦合等离子发射光谱仪(ICP)测定。表观钙吸收率计算如下:
摄入钙=饲粮钙+灌胃钙
在灌胃4周后,各组小鼠均禁食过夜。眼眶采血,血液装入1.5mL无菌无酶的离心管中,室温静置30min,3000rpm、4℃离心10min。取淡黄色液体,-20℃保存,用于血清指标的测定。采用试剂盒检测血清钙、磷和碱性磷酸酶(ALP)水平。
采血完成后,用颈椎脱位法处死小鼠,解剖其股骨。使用Micro-CT分析小鼠右侧股骨骨微结构。扫描分析后,小鼠右股骨在575℃下干燥8小时,然后将灰化样品溶解在盐酸溶液(1+1)中,使用电感耦合等离子发射光谱仪(ICP)测量骨钙含量。
如图6所示,为不同处理组小鼠的表观钙吸收率,与空白对照组相比,灌胃CaCO3、H-PGA-Ca和L-PGA-Ca显著提高小鼠的表观钙吸收率。当补充CaCO3时,钙表观吸收率从16.30±6.44%增加到40.93±7.10%,;补充L-PGA-Ca,表观钙吸收增加至38.60±9.73%;补充H-PGA-Ca,表观钙吸收增加至58.44±4.13%。因此,小鼠饲喂实验表明,聚谷氨酸钙可以促进钙的吸收。
研究表明,血清钙、磷、碱性磷酸酶(AKP)可作为骨生长相关生化指标和评价肠道钙吸收的关键指标。如图7a所示,空白对照组与CaCO3组血清钙含量无明显差异,分别为1.23±0.02mmol/L、1.24±0.03mmol/L,两组小鼠均处于钙缺乏状态。这说明CaCO3不能缓解机体血清钙低水平的状况,这可能是老龄鼠机体健康状态导致长期低钙吸收的缘故。与CaCO3相比,补充H-PGA-Ca和L-PGA-Ca均能显著提高老龄鼠血清钙水平,血清钙含量分别为1.39±0.01mmol/L、1.32±0.03mmol/L,与表观钙吸收结果一致。说明PGA-Ca在一定程度上缓解了血清钙低水平状况,可能是由于PGA-Ca促进肠道钙吸收,提高了钙的生物利用度。这表明PGA-Ca与无机钙相比更易吸收。钙磷协调可以促进钙和磷的吸收和骨的生长。如图7b所示,各组间血清磷水平没有明显的变化,但是血清磷含量处于高水平,与血清钙含量比值约2:1,比例失调。表明,CaCO3、H-PGA-Ca和L-PGA-Ca钙制剂并不能改善血清磷水平,这可能是由于老龄鼠长期钙缺乏引起骨钙的释放,从而导致血清磷含量保持过高。碱性磷酸酶作为成骨细胞分泌的标志性酶,其活性的变化在一定程度上反映了骨代谢情况。在骨生长较快时,活跃的成骨细胞分泌大量的AKP,血清AKP活性显著上升。当体内钙摄入量严重不足时,为维持机体钙平衡,骨钙流出。这使得成骨细胞极其活跃,合成大量AKP并释放到血液中,导致血清AKP高于正常机体。如图7c所示,空白对照组(BC)血清AKP活性明显高于CaCO3组、H-PGA-Ca组和L-PGA-Ca组,表明补充钙制剂可降低血清AKP含量。BC组血清AKP含量为4.95±0.63金氏单位/100mL,补充CaCO3使得血清AKP下降至4.07±0.79金氏单位/100mL,这表明补充CaCO3一定程度上可以改善小鼠的骨代谢。与CaCO3相比,补充L-PGA-Ca并没有显著变化,补充H-PGA-Ca血清AKP含量下降幅度更大(3.57±0.70金氏单位/100mL),表明PGA-Ca中的钙更容易吸收和骨矿化。
机体长期钙摄入量不足,为了维持血钙平衡会导致骨钙流失,损害骨质量,最终导致骨质疏松等疾病。目前,在骨组织研究领域,Micro CT可以很好地研究骨结构和骨密度的微细改变。通过Micro CT扫描,可以得到股骨内部骨小梁的生物学特性和形态结构,以此探究不同处理下小鼠骨微结构的差异。如图8所示,三维显微CT图像清晰地显示了BC组、CaCO3组、H-PGA-Ca组和L-PGA-Ca组骨小梁微结构的差异。BC组和CaCO3组的小鼠骨小梁结构松散且缺损严重,提示有骨质疏松的发生。补充H-PGA-Ca和L-PGA-Ca组的小鼠骨小梁结构明显恢复,呈现出紧凑和相对完整的网络结构,表明PGA-Ca具有改善老龄鼠骨微结构恶化的潜力。
本发明提供了一种聚谷氨酸钙的制备思路及方法,具体实现该技术方案的方法和途径很多,以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (10)
1.一种聚谷氨酸钙的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)将聚谷氨酸发酵液过滤除菌,获得澄清发酵滤液;
(2)向发酵滤液中加入1/5~1/4体积的质量分数为30%~40%的硫酸铜溶液,充分搅拌,析出蓝色沉淀,即为聚谷氨酸-铜复合沉淀;
(3)将析出的聚谷氨酸-铜复合沉淀用过滤离心机洗涤,至离心液无色,然后继续离心脱水;
(4)将洗涤脱水后的沉淀溶于2~2.5倍质量的草酸溶液,充分搅拌反应6~12小时,得到蓝色悬浮液;
(5)用沉降式离心机对蓝色悬浮液进行分离,保留清液,弃掉沉淀;
(6)将离心清液再通过过滤进一步除去不溶性颗粒,得到无色滤液;
(7)向无色滤液中边搅拌边加入氢氧化钙,至滤液pH为3.5~4.0,将反应液过滤,除去沉淀,得到无色透明滤液,即为聚谷氨酸溶液;
(8)向聚谷氨酸溶液中继续边搅拌边加入氢氧化钙,至滤液pH为7.0~7.5,将反应液再通过过滤,除去溶液中的不溶物,得到无色透明滤液,即为聚谷氨酸钙溶液;
(9)将聚谷氨酸钙溶液通过喷雾干燥器干燥,得到白色粉末,即为制备的聚谷氨酸钙。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述聚谷氨酸发酵液中,聚谷氨酸重均分子量不低于1800 kDa。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,经过步骤(4)处理后,通过调整草酸质量分数和反应时间,制备不同分子量的聚谷氨酸钙。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,洗涤脱水后的沉淀溶于2.5倍质量的草酸溶液,草酸质量分数为2%~6%。
5.根据权利权利要求4所述的方法,其特征在于,
(1)当草酸质量分数为6%,反应时间为6~8小时,最终制备的聚谷氨酸钙分子量在100kDa~300 kDa;
(2)当草酸质量分数为6%,反应时间为8~10小时,最终制备的聚谷氨酸钙分子量在10kDa~100 kDa;
(3)当草酸质量分数为6%,反应时间为10~12小时,最终制备的聚谷氨酸钙分子量在5kDa~10 kDa;
(4)草酸质量分数为4%,反应时间为6~8小时,最终制备的聚谷氨酸钙分子量在800 kDa~1000 kDa;
(5)草酸质量分数为4%,反应时间为8~10小时,最终制备的聚谷氨酸钙分子量在600kDa~800 kDa;
(6)草酸质量分数为4%,反应时间为10~12小时,最终制备的聚谷氨酸钙分子量在300kDa~600 kDa;
(7)草酸质量分数为2%,反应时间为8~10小时,最终制备的聚谷氨酸钙分子量在1300kDa~1600 kDa;
(8)草酸质量分数为2%,反应时间为10~12小时,最终制备的聚谷氨酸钙分子量在1000kDa~1300 kDa。
6.根据权利要求1所述的一种聚谷氨酸钙的制备工艺,其特征在于,制备的聚谷氨酸钙中,钙的质量分数为10%~12%。
7.根据权利要求1所述的一种聚谷氨酸钙的制备工艺,其特征在于,制备得到的聚谷氨酸钙的分子量范围为400 kDa~1000 kDa,更优选地,制备得到的聚谷氨酸钙的分子量范围为500-700 kDa。
8.权利要求1-5任一项所述的权利要求制备得到的聚谷氨酸钙在制备膳食补钙剂上的应用。
9.权利要求1-5任一项所述的权利要求制备得到的聚谷氨酸钙在缓膳食抑制因子对钙离子的钝化、促进钙离子在肠道中的溶解度、提高肠道细胞对钙离子的吸收上的应用;其中所述的膳食抑制因子为磷酸盐、草酸、植酸、单宁中的任意一种或几种的组合。
10.根据权利要求8或9所述的应用,其特征在于,所述聚谷氨酸钙的剂型为固体钙片或液体补钙剂。
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