CN113069591A - 一种壳聚糖-聚谷氨酸钙生物敷料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于精细化学品领域,提供了一种壳聚糖‑聚谷氨酸钙生物敷料及其制备方法,该制备方法是将聚谷氨酸溶于水,特定条件下螯合钙离子得聚谷氨酸钙,然后于微酸性条件下与壳聚糖静电相互作用后浓缩、冷冻干燥、粉碎、灭菌,壳聚糖‑聚谷氨酸钙生物敷料产品;本发明获得的生物敷料具有快速止血、抑菌、促进伤口愈合的作用,且制备方法简单快捷、成本低、得率高,具有生物相容性、对环境无污染,对人体无副作用,适合产业化生产。
Description
技术领域
本发明属于精细化学品领域,提供了一种壳聚糖-聚谷氨酸钙生物敷料及其制备方法。
背景技术
壳聚糖是甲壳素部分脱乙酰化的产物,与人体具有很好的亲和性和生物相容性,其携带的正电荷可以促进红细胞聚集和增加血小板粘附,促进血液凝固;此外,携带的正电荷还可以吸附细菌或真菌带负电荷的细胞壁,在细胞表面形成一层高分子膜,从而改变细胞的通透性,干扰细菌或真菌的正常代谢,起到抑菌杀菌的作用,从而有效抑制创面感染,促进伤口愈合。目前,含单一壳聚糖成分的止血材料已上市,然其对于广泛出血创面的止血效果不甚理想,对创伤组织的粘附性差,促进凝血的过程用时较长,使用不便的同时难以满足大面积创伤及快速止血需求。
γ-聚谷氨酸是一种具有生物可降解性、无毒性、成膜性的高分子物质,以其为原料制备的膜具有保水性、渗透性好等特点。曾被报道利用交联的方式制备生物胶,用于人体的渗血和密封切口,但是其残余的交联剂会对人体产生不利影响。已知钙离子作为人体凝血机制的一个重要凝血因子,在伤口部位的存在有助于促进凝血,能缩短止血时间约54%,故考虑在聚谷氨酸上引入钙离子,保证对人体无害的前提下加速内源性凝血因子的激活,达到伤口的快速止血。然而对单纯的聚谷氨酸钙进行抗菌性实验发现,其抗菌效果不明显。
创伤出血是各类事故现场的最常见伤情之一,不可控的出血及感染是导致伤情恶化的重要原因。因此现场对伤员出血进行及时、有效控制是抢救成功的重要环节之一。及时控制出血并起到抑菌、杀菌作用的生物敷料是现在本领域技术人员研究的重点。
发明内容
本发明针对上述技术存在的不足,提供一种壳聚糖-聚谷氨酸钙生物敷料及其制备方法,该制备方法是将聚谷氨酸溶于水,特定条件下螯合钙离子得聚谷氨酸钙,然后于微酸性条件下与壳聚糖静电相互作用后浓缩、冷冻干燥、粉碎、灭菌,制得壳聚糖-聚谷氨酸钙生物敷料产品;本发明获得的生物敷料具有快速止血、抑菌、促进伤口愈合的作用,且制备方法简单快捷、成本低、得率高,具有生物相容性、对环境无污染,对人体无副作用,适合产业化生产。
根据上述发明人发现的单纯的聚谷氨酸钙进行抗菌性实验发现,其抗菌效果不明显,发明人考虑将单纯的聚谷氨酸钙与壳聚糖联用,经过大量实验最终获得了本申请的具体技术方案如下:
一种壳聚糖-聚谷氨酸钙生物敷料,其中聚谷氨酸钙质量为壳聚糖质量的15%-30%;
其中所述的壳聚糖,脱乙酰化程度为50%-90%,分子量范围10kDa-100kDa;脱乙酰程度在上述范围内的壳聚糖其抗菌活性较之脱乙酰化程度较低的壳聚糖有明显的增加;同时经过发明人的前期实验和分析,发现当壳聚糖分子量范围为10kDa-100kDa时针对大肠杆菌的抑菌性能明显较好;
所述的聚谷氨酸钙采用如下方法制备获得:
首先将聚谷氨酸溶于去离子水中,搅拌,使其充分溶解混匀,控制聚谷氨酸的质量浓度为0.1%-3.5%,之后向其中缓慢加入溶解好的钙盐溶液,于45-80℃下螯合1-5h;
其中更进一步优选聚谷氨酸的质量浓度为1.0%~3.0%;
向上述聚谷氨酸钙溶液加入2-4倍乙醇,搅拌混匀,离心,去上清,重复2-4次;使用去离子水溶解沉淀,然后该溶解液-80℃预冻,利用真空冷冻干燥机将其冻干,粉碎过40目筛;
上述的钙盐为氯化钙、乳酸钙、醋酸钙的一种或其混合物,钙盐用量为:反应前钙元素质量为聚谷氨酸质量的3.2%-32%;
其中由于乳酸钙溶于热水,且其与聚谷氨酸的反应是在加热状态下进行故而可以顺利进行;
经过反应最终制备的聚谷氨酸钙中钙元素质量为聚谷氨酸质量的1.6%-16%,浓度过高会对机体产生刺激,故而选择上述反应前的钙盐用量,用以确保反应后最终制备的产品中钙含量达到上述范围;
上述制备获得的聚谷氨酸钙止血性能较好,且对机体无刺激,对肌肤粘附性较好,在止血使用部位使用此材料后无需二次包扎。
根据反应条件不同,螯合效率在50%-90%之间不等;
聚谷氨酸钙中钙的范围为1.6%-16%,查阅相关资料发现当钙含量大于4%时可能会对机体产生刺激,但是本申请中,发明人发现其与壳聚糖络合后,钙元素比例又明显降低,使得最终产品对机体无刺激。
基于上述技术方案,发明人又提供了所述壳聚糖-聚谷氨酸钙生物敷料的制备方法,包含以下步骤:
1)将壳聚糖溶于去离子水中,加酸、搅拌,使其充分溶解并混匀;
其中加酸控制溶液pH小于6.0,以便壳聚糖充分溶解;
2)将聚谷氨酸钙粉末溶于去离子水中,使其质量浓度为0.1%-2.0%,然后缓慢将其滴加至壳聚糖溶液中,聚谷氨酸钙的质量为壳聚糖质量的15%~30%,室温搅拌2-10h,得壳聚糖-聚谷氨酸钙溶液;
3)将上述壳聚糖-聚谷氨酸钙溶液用减压蒸馏装置进行浓缩,浓缩至原体积的5%-20%;然后进行冷冻干燥后粉碎过40目筛,得到固体壳聚糖-聚谷氨酸钙粉末;
4)将壳聚糖-聚谷氨酸钙粉末包装后,60Co辐照灭菌;总辐照剂量为5-20kGy。
其中步骤(1)中所用壳聚糖脱乙酰化程度为50%-90%,分子量范围10kDa-100kDa;
所用酸为乙酸、乳酸的一种或两种,使用量为壳聚糖的1/10-1/4(ml/g);
步骤(1)获得的壳聚糖溶液浓度在0.1%-3.0%,在该浓度范围内,络合效果最佳;通过上述方案制备获得的敷料,遇液体(包括血液)后可以短时间内成膜,且粘附于皮肤上,不需要二次包扎;其除止血外,兼具抗菌、促进伤口愈合的功效,且其贴合性强,不需要纱布包扎,使用简单、方便;
为了方便后续的处理,在步骤(2)中还可以在反应完成后,利用透析的方式去除未结合的小分子聚合物;
本发明所提供的技术方案以天然产物为原料,制备获得了具有优良功效的生物敷料,集合壳聚糖、聚谷氨酸及钙离子的优点于一身,兼具快速止血、抗菌、促进伤口愈合的作用,且该敷料吸湿性强,遇液体即成膜,膜薄而透明,粘附性强,方便使用。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容做进一步的详细说明,但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围,下述实施例中,除特殊说明外所述百分比均为重量百分比。
实施例1
一种壳聚糖-聚谷氨酸钙生物敷料及其制备方法,其包含以下步骤:
称取脱乙酰度50%~90%、分子量为10kDa~100kDa的壳聚糖1.0g溶于100mL去离子水中,加0.15mL醋酸搅拌,使其充分溶解并混匀备用;
称取3.0g聚谷氨酸溶于90mL去离子水中,搅拌混匀;称取0.50g氯化钙溶于10mL去离子水中,混匀;将氯化钙溶液缓慢加入聚谷氨酸溶液中,于60℃搅拌3h;
冷却后加入3倍体积的乙醇,搅拌5min,2000rpm离心10min,去上清,重复1次后加入35mL去离子水溶解,于-80℃冰箱预冷冻12h,转移至冷冻干燥机反应40h,得到聚谷氨酸钙粉碎过40目筛备用;
称取0.15g上述获得的聚谷氨酸钙溶于100mL水后,缓慢滴加至上述的壳聚糖溶液中,搅拌4h反应完成后,利用透析方式去除未结合的小分子聚合物,得壳聚糖-聚谷氨酸钙溶液;
利用减压蒸馏装置进行浓缩至原体积的5%,放置于-80℃冰箱预冻12h,利用真空冷冻干燥机冷冻干燥60h,取出粉碎,过40目筛,钴60辐照灭菌得固体壳聚糖-聚谷氨酸钙生物敷料。
实施例2
一种壳聚糖-聚谷氨酸钙生物敷料及其制备方法,其包含以下步骤:
称取脱乙酰度50%~90%、分子量为10kDa~100kDa的壳聚糖1.0g溶于1000mL去离子水中,加0.20mL醋酸搅拌,使其充分溶解并混匀备用;
称取2.0g聚谷氨酸溶于90mL去离子水中,搅拌混匀;称取0.40g氯化钙溶于10mL去离子水中,混匀;将氯化钙溶液缓慢加入聚谷氨酸溶液中,于45℃搅拌3h;
冷却后加入3倍体积的乙醇,搅拌5min,2000rpm离心10min,去上清液,重复2次后加入20mL去离子水溶解,于-80℃冰箱预冷冻12h,转移至冷冻干燥机反应40h,得到聚谷氨酸钙粉碎过40目筛备用;
称取0.3g聚谷氨酸钙溶于200mL水后缓慢滴加至壳聚糖溶液中,搅拌6h反应完成后透析去除未结合的小分子聚合物,得壳聚糖-聚谷氨酸钙溶液;
利用减压蒸馏装置进行浓缩至原体积的5%,放置于-80℃冰箱预冻12h,利用真空冷冻干燥机冷冻干燥60h,取出粉碎,过40目筛,钴60辐照灭菌得固体壳聚糖-聚谷氨酸钙生物敷料。
实施例3
一种壳聚糖-聚谷氨酸钙生物敷料及其制备方法,其包含以下步骤:
称取脱乙酰度50%~90%、分子量为10kDa~100kDa的壳聚糖2.0g溶于200mL去离子水中,加0.50mL醋酸搅拌,使其充分溶解并混匀备用;
称取3.0g聚谷氨酸溶于150mL去离子水中,搅拌混匀;称取0.80g氯化钙溶于50mL去离子水中,混匀;将氯化钙溶液缓慢加入聚谷氨酸溶液中,于80℃搅拌1h;
冷却后加入3倍体积的乙醇,搅拌5min,2000rpm离心10min,去上清液,重复3次后加入40ml去离子水溶解,后于-80℃冰箱预冷冻12h,转移至冻干机反应40h,得到聚谷氨酸钙粉碎过40目筛备用;
称取0.4g聚谷氨酸钙溶于50mL水后缓慢滴加至壳聚糖溶液中,搅拌8h反应完成后,透析去除未结合的小分子聚合物,得壳聚糖-聚谷氨酸钙溶液;
利用减压蒸馏装置进行浓缩至原体积的10%,放置于-80℃冰箱预冻12h,利用真空冷冻干燥机冷冻干燥60h,取出粉碎,过40目筛,钴60辐照灭菌得固体壳聚糖-聚谷氨酸钙生物敷料。
实验例1
参考最小抑菌浓度实验,以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌模式菌株为实验菌株,以实施例3方法制得的生物敷料为被测试材料,空白对照内不添加任何材料,对照组为实施例3制备过程中获得的聚谷氨酸钙粉末,无菌条件下进行抗菌性能测试实验,结果如表1所示。
表1壳聚糖-聚谷氨酸钙最小抑菌浓度测定
注:“+”表示菌株正常生长。
上述实验过程为:将实验材料其加入灭菌完成的液体培养基中,制成含不同浓度抗菌敷料或单纯聚谷氨酸钙的培养基,然后接入实验菌株,37℃条件下培养18~24h,观察菌株生长情况发现;
结果如上表所示,针对大肠杆菌,实施例3制备获得的医用敷料的最小抑菌浓度为1.2%(g/ml);针对金黄色葡萄球菌,该医用敷料的最小抑菌浓度为0.28%(g/ml);而只含聚谷氨酸钙的培养基细菌生长茂盛,OD600同空白对照无明显区别,即未有明显抑菌作用;表明壳聚糖-聚谷氨酸钙医用敷料的抗菌效果明显,表明其对于后期伤口的细菌感染具有有效的抑制作用。
实验例2
止血性能测试实验
取成年大鼠40只,雌雄不限,随机分4组(a医用脱脂纱布空白对照组;b市售壳聚糖组;c聚谷氨酸钙组;d壳聚糖-聚谷氨酸钙组(以实施例3方法制得的生物敷料),每组10只,制备股动脉出血模型。
全部动物腹腔注射3%戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉大鼠,将其仰式固定于木板上;在受试区脱毛、消毒,沿股内侧切一切口,剥离股动脉,并将动脉横向剪开一切口,擦去喷出的血液,将不同止血材料分别覆盖股动脉,然后观察创面出血情况,直至出血停止,记录止血时间,结果如表2所示。
表2止血性能测试
组别 | 动物只数/只 | 平均止血时间/s |
A | 10 | >120 |
B | 10 | 68±12 |
C | 10 | 54±13 |
D | 10 | 42±10 |
上述实验结果表明壳聚糖-聚谷氨酸钙医用敷料的止血效果明显优于医用脱脂纱布、单纯的壳聚糖粉、单纯的聚谷氨酸钙粉,可知壳聚糖-聚谷氨酸钙的止血效果更好,作为一种医用敷料,市场前景广阔。
Claims (8)
1.一种壳聚糖-聚谷氨酸钙生物敷料,其特征在于:其中聚谷氨酸钙质量为壳聚糖质量的15%-30%;其中所述的壳聚糖,脱乙酰化程度为50%-90%,分子量范围10kDa-100kDa。
2.根据权利要求1所述的壳聚糖-聚谷氨酸钙生物敷料,其特征在于:
所述的聚谷氨酸钙采用如下方法制备获得:
首先将聚谷氨酸溶于去离子水中,搅拌,使其充分溶解混匀,缓慢加入溶解好的钙盐溶液,于45-80℃下螯合1-5h;
向上述聚谷氨酸钙溶液加入2-4倍乙醇,搅拌混匀,离心,去上清,重复2-4次;使用去离子水溶解沉淀,然后溶解液-80℃预冻,利用真空冷冻干燥机将其冻干,粉碎;
上述的钙盐为氯化钙、乳酸钙、醋酸钙中的一种或其混合物,钙盐用量为反应前钙元素质量为聚谷氨酸的3.2%-32%。
3.根据权利要求2所述壳聚糖-聚谷氨酸钙生物敷料,其特征在于:控制聚谷氨酸的质量浓度为0.1%-3.5%。
4.一种壳聚糖-聚谷氨酸钙生物敷料的制备方法,其特征在于:包含以下步骤:
1)将壳聚糖溶于去离子水中,加酸、搅拌,使其充分溶解并混匀;
2)将聚谷氨酸钙粉末溶于去离子水中,使其质量浓度为0.1%-2.0%,然后缓慢将其滴加至壳聚糖溶液中,聚谷氨酸钙的质量为壳聚糖质量的15%~30%,室温搅拌2-10h,得壳聚糖-聚谷氨酸钙溶液;
3)将上述壳聚糖-聚谷氨酸钙溶液用减压蒸馏装置进行浓缩,浓缩至原体积的5%-20%;然后进行冷冻干燥后粉碎过40目筛,得到固体壳聚糖-聚谷氨酸钙粉末。
5.根据权利要求4所述的壳聚糖-聚谷氨酸钙生物敷料的制备方法,其特征在于:其中步骤(1)中所用壳聚糖脱乙酰化程度为50%-90%,分子量范围10kDa-100kDa。
6.根据权利要求4所述的壳聚糖-聚谷氨酸钙生物敷料的制备方法,其特征在于:其中步骤(1)中所用酸为乙酸、乳酸的一种或两种,使用量ml/g为壳聚糖的1/10-1/4,步骤(1)获得的壳聚糖溶液浓度在0.1%-3.0%。
7.根据权利要求4所述的壳聚糖-聚谷氨酸钙生物敷料的制备方法,其特征在于:其中步骤(1)中加酸控制溶液pH小于6.0。
8.根据权利要求4所述的壳聚糖-聚谷氨酸钙生物敷料的制备方法,其特征在于:其步骤还包括:
4)将壳聚糖-聚谷氨酸钙粉末包装后,60Co辐照灭菌;总辐照剂量为5-20kGy。
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