KR101114495B1

KR101114495B1 - 2단계 방식에 의한 기능성 강화 가공발효녹용 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR101114495B1
Application number: KR1020090057299A
Authority: KR
Inventors: 정용진; 장세영; 신경아; 박난영; 유철재; 김재화
Original assignee: (주)비오티
Priority date: 2009-06-25
Filing date: 2009-06-25
Publication date: 2012-03-09
Also published as: KR20100138664A

Abstract

본 발명은 2단계 방식에 의한 기능성이 강화된 가공발효녹용 및 그 제조방법에 관한 것으로, 1단계 가수분해에서는 proteAX와 KFEN2 효소를 사용하여 녹용의 특성을 변화시키고 2단계 발효에서는 Bacillus subtilis N2 균주에 의하여 녹용발효의 특성을 변화시키므로 녹용의 기능성을 현저히 강화시킨 맞춤형 가공발효녹용을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

proteAX 효소, KFEN2 효소, Bacillus subtilis N2, 기능성 강화, 가공발효녹용, 맞춤형 녹용

Description

2단계 방식에 의한 기능성 강화 가공발효녹용 및 그 제조방법{A functional deer antlers Product produced by two-step process and method for preparing thereof}

본 발명은 2단계 방식에 의한 기능성이 강화된 가공발효녹용 및 그 제조방법에 관한 것으로 더욱 상세하게는, 국내외 최초로 녹용에 효소를 처리하여 녹용특성의 변화를 유도한 다음 신규한 균주 특성을 가지는 Bacillus subtilis N2균주를 접종하여 녹용 발효 특성을 변화시켜서 얻는 맞춤형 가공발효녹용 제품에 관한 것이다. 본 발명 발효 녹용제품은 pH 7.19(종래제품 pH 7.58)이며, 유리아미노산, 콜라겐, 황산화-글리코스아미노글리칸(Sulfated-GAGs) 및 시알산(Sialic acid) 함량이 높고, 혈전용해능 발현, 항산화 활성 및 당도가 높아 기능성이 강화된 녹용의 특징을 가진다.

녹용은 사슴의 각질화되지 않은 어린 뿔로 우리나라를 비롯한 동북아 지역에서 식용 및 약용으로 널리 이용되어왔다. 지금까지 알려진 녹용의 약리작용으로는 단백질과 핵산 합성 촉진, 조혈 촉진, 면역증강, 성기능 증강, 심혈관계에 대한 영 향, 항 스트레스, 항 노화, 항 위궤양 작용 등이 있다. 그러나 이러한 효능은 사슴의 품종, 발육 상태, 사육 지역, 채취 시기, 부위 및 가공 방법에 따라 성분 및 효과가 차이가 있는 것으로 알려져 있으며 아직까지 녹용의 다양한 생리활성을 나타내는 대표적인 성분은 밝혀지지 않고 있다. 최근 녹용의 약리작용 발현에 기여하는 유효성분에 관한 국내 연구를 살펴보면 헥소사민(hexosamine, 육탄 단당류의 아미노당), 우론산(uronic acid), 시알산(sialic acid), 육탄당(hexose), 오탄당(pentose) 등의 수용성 성분과 지방산(fatty acid), 글리세리드(glycerides), 인지질(phospholipids) 및 강글리오시드(gangliosides) 등의 지용성 성분의 존재가 확인되었다.

녹용의 복용법은 주로 다른 한약재와 함께 달여 탕제로 복용하는 것이 보편적이나 일반 한약재를 달이는 조건에서는 녹용의 유효성분이 충분히 추출되지 않는 문제점이 있어 추출효율 개선이 요구되고 있다. 녹용 성분의 가용화에 관한 연구로는 알코올 추출법 및 노르말 헥산, 클로로포름 및 에탄올 추출법 등 녹용의 유용성분 추출에 관한 다양한 연구가 보고되었고, 녹용 분해 미생물을 이용한 발효 녹용의 생리활성 검색 연구도 있으나 각각의 추출법에 따라 유효성분의 함량에 차이가 있으며 발효녹용의 경우 실질적인 제품화를 위한 제조 공정 마련이 요구되어진다.

최근 소득수준의 향상으로 건강기능식품의 수요가 증가함에 따라 녹용의 활용이 증가하고 있어 유효성분이 고농도로 농축되어 있고, 저장안정성이 뛰어난 새로운 형태의 녹용제품의 개발이 시급하다.

따라서 본 발명자들은 녹용을 제품화함에 있어 상기와 같은 종래의 문제점을 극복하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과 1단계 효소처리 가수분해, 2단계 Bacillus subtilis N2균주를 이용한 발효에 의한 가공발효녹용을 제조함으로써 본 발명에 이르게 되었다.

본 발명의 목적은 상기와 같은 점들을 감안하여 안출한 것으로 특정 효소에 의한 1단계 가수분해, 특정 미생물에 의한 2단계 발효에 의한 맞춤형 녹용제품을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 2단계 방식을 통하여 녹용의 특정 성분을 강화시킨 가공 녹용제품을 제공하는데 있다.

상기와 같은 본 발명의 목적은 녹용을 분말화하는 단계; 상기 분말화된 녹용을 효소처리하여 가수분해하는 1단계 가수분해단계; 상기 1단계 가수분해한 녹용을 추출하는 단계; 상기 1단계 가수분해한 녹용 추출물을 미생물을 이용하여 발효시키는 2단계 발효단계; 상기 2단계 발효 녹용을 살균하는 단계; 및 상기 살균된 2단계 발효 녹용을 여과하는 단계를 포함하여 가공발효녹용을 제조함으로써 달성되었다.

본 발명은 2단계 방식에 의한 기능성 강화 가공발효녹용 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 2단계 방식에 의한 기능성 강화 가공발효녹용의 제조방법은,

녹용을 입도 1.0㎜이하로 분쇄하여 분말화하는 단계;

정제수에 상기 녹용분말 5%(w/v)를 첨가하고 효소제 proteAX(protese: Amano Enzyme INC., 일본)와 복합효소 KFEN2^？(glucoamylase : (주)계명푸덱스산, 대구)를 각각 0.5%(w/w)첨가하여 60℃ 진탕수욕조에서 100rpm으로 5시간 반응시켜 분해하는 1단계 가수분해단계;

상기 1단계 가수분해한 녹용을 121℃에서 60분간 추출하는 단계;

상기 1단계 가수분해한 녹용 추출물에 Bacillus subtilis N2 균주 ((주)계명푸덱스분양미생물)배양액 2.0%(v/v)를 접종하여 37℃에서 24시간 발효시키는 2단계 발효단계;

상기 2단계 발효 녹용을 95℃에서 10분간 살균하는 단계; 및

상기 살균된 2단계 발효 녹용을 8000rpm에서 20분간 여과하는 단계

를 포함한다.

또한, 본 발명은 상기의 방법으로 제조된 맞춤형 가공발효녹용을 제공한다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 2단계 방식에 의한 기능성 강화 가공발효녹용은 분말화된 녹용을 효소처리하여 1단계 가수분해후 추출하여 그 추출물을 Bacillus subtilis N2 균주 ((주)계명푸덱스분양미생물)를 이용하여 2단계 발효후 살균 및 여과과정을 거침으로써 혈전용해능 발현, 항산화 활성 및 유리아미노산, 콜라겐, 황산화-글리코스아미노글리칸(Sulfated-GAGs), 시알산(Sialic acid) 등 유효성분이 고농도로 농축되는 효과가 있으므로 가공식품산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

본 발명에 따른 녹용을 분말화하는 단계에 있어서, 상기 녹용은 뉴질랜드산 건조 녹용 중대 절편을 분쇄기로 1.0 mm 체를 통과할 수 있는 입자로 분쇄하여 -20℃에서 보관하면서 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 상기 분말화된 녹용을 효소처리 가수분해하는 1단계 가수분해단계에 있어서, 녹용분말 5%(w/v)를 정제수에 첨가하고 효소제 proteAX(protese: Amano Enzyme INC., 일본)와 복합효소 KFEN2^？(glucoamylase : (주)계명푸덱스산)를 각각 0.5%(w/w)첨가하여 60℃ 진탕수욕조에서 100rpm으로 5시간 반응시키는 것이 바람직하다.

효소제는 일본아마노 효소(주)의 단백가수분해 효소제 proteAX(1,400 units/g)와 (주)계명푸덱스가 시판하는 복합효소제 KFEN2(glucoamylase, 3,000 units/g)를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 proteAX효소의 최적 처리조건은 PH 6-9에서 60℃이며, KFEN2의 경우에도 PH 6-9에서 60℃이다.

즉, 효소제를 첨가하지 않은 대조구와 1단계 가수분해단계에서 농도 및 시간 등의 조건은 동일하게 하되, 효소제 proteAX를 첨가한 1단계 녹용 가수분해물, 효소제 protease A amino를 첨가한 1단계 녹용 가수분해물의 pH, 당도, 가용성 고형분 함량 및 단백질 함량을 비교한 결과는 [표 1]과 같다.

pH는 proteAX 처리구가 대조구와 protease A amino 처리구에 비해 낮게 나타났다. 당도는 대조구에 비해 효소처리구에서 더 높게 나타났으며 특히 proteAX 처리구는 1.8 °Brix로 대조구의 0.9 °Brix보다 2배 가량 높게 나타났다. 가용성 고형분 함량도 대조구에 비해 효소처리구에서 높게 나타났으며 proteAX 처리구에서 1.17 %로 가장 높게 나타났다. 효소제 종류에 따른 단백질 분석 결과에서도 대조구에 비해 효소처리구에서 높게 나타났으며 proteAX 처리구는 499.9 mg%로 대조구 257.7 mg%에 비해 2배 가량 높게 나타났다. 위의 결과 proteAX를 처리한 1단계 가수분해 녹용의 특성이 가장 뛰어난 것으로 확인되었다.

또한, 효소제를 첨가하지 않은 대조구와 1단계 가수분해 단계에서 정제수에 녹용분말 5%(w/v)를 첨가하여 효소제 proteAX를 0.1, 0.5, 1.0%(w/w) 각각 첨가하여 60℃ 진탕수욕조에서 100 rpm으로 5시간 반응시켜 1단계 가수분해 녹용의 pH, 당도, 가용성 고형분 함량 및 단백질 함량을 비교한 결과는 [표 2]와 같다.

pH는 0.5%(w/w), 1.0%(w/w)에서 조금 낮게 나타났다. 당도는 효소농도 0.5%(w/w)까지 증가하였으나 1.0%(w/w)에서는 차이가 없었다. 가용성 고형분 함량도 효소농도가 증가함에 따라 점차 증가하는 경향이었으며, 0.5%(w/w)와 1.0%(w/w)는 큰 차이가 없었다. 단백질 함량은 대조구와 0.1%(w/w)는 큰 차이가 없었으나 0.5%(w/w)에서 급격히 증가하여 442.2 mg%로 나타났고 1.0%(w/w)에서는 468.5 mg%로 0.5%(w/w)와 1.0%(w/w)는 큰 차이가 없었다. 이상의 결과 proteAX 농도는 0.5%(w/w)가 바람직한 것으로 확인되었다.

또한, 1단계 가수분해단계에서 정제수에 녹용분말 5%(w/v)를 첨가하여 효소제 proteAX를 0.5%(w/w) 첨가하여 60℃ 진탕수욕조에서 100 rpm으로 2, 5, 8시간 반응시켜 pH, 당도, 가용성 고형분 함량 및 단백질 함량을 조사한 결과는 [표 3]과 같다.

pH는 효소처리 시간이 길어짐에 따라 낮아지는 경향이었다. 당도, 가용성 고형분 및 단백질은 5시간 처리구까지 증가하다가 이후에는 차이가 없었다. 따라서, 1단계 녹용가수분해물 제조를 위한 적정 효소처리 시간은 5시간이 바람직한 것으로 확인되었다.

또한, 1단계 가수분해단계에서 농도 및 시간 등의 조건은 동일하게 하되, 효소제 proteAX를 첨가한 1단계 녹용가수분해물, 효소제 KFEN2를 첨가한 1단계 녹용가수분해물 및 proteAX 와 KFEN2 의 복합효소제를 첨가한 1단계 녹용가수분해물의 pH, 당도, 가용성 고형분 함량 및 단백질 함량을 비교한 결과는 [표 4]와 같다.

pH는 proteAX 와 KFEN2 의 복합처리구에서 조금 낮게 나타났다. 당도는 KFEN2 처리구에서 0.5 °Brix로 가장 낮게 나타났고 proteAX 와 KFEN2 의 복합처리구는 1.8 °Brix로 proteAX 처리구 1.2 °Brix에 비해 더 높게 나타났다. 가용성 고형분도 KFEN2 처리구가 0.75 %로 가장 낮았으며 proteAX 와 KFEN2 의 복합처리구는 1.90 %로 가장 높게 나타났다. 단백질 함량도 당도 및 가용성 고형분 결과와 유사한 경향이었으며 proteAX 와 KFEN2 의 복합처리구에서 682.8 mg%로 가장 높았다. 따라서 proteAX와 KFEN2를 복합처리하여 1단계 녹용가수분해물을 제조하는 것이 바람직한 것으로 확인되었다.

본 발명에 따른 1단계 가수분해한 녹용을 추출하는 단계에 있어서, 온도는 121℃에서 시간은 60분간 추출하는 것이 바람직하다.

즉, 1단계 가수분해 녹용을 상압조건과 가압조건으로 나누어 상압조건은 95℃에서 6, 12, 20시간 가압조건은 121℃에서 15, 30, 60분간 추출한 후 pH, 당도, 가용성 고형분 함량, 단백질 함량을 분석한 결과는 [표 5]와 같다.

pH는 상압조건과 가압조건 모두 추출시간이 길어짐에 따라 조금씩 높아지는 경향이었으며 추출조건에 따른 큰 차이는 없었다. 당도는 상압조건에서 6시간 추출했을 때 2.0 °Brix였으며 12시간 추출했을 때에는 2.2 °Brix로 조금 증가하였고 20시간 추출은 12시간 추출과 차이가 없었다. 가압조건에서는 15분 추출했을 때 2.3 °Brix로 나타나 상압조건에서 20시간 추출한 것보다 높았으며 60분 추출했을 때 2.7 °Brix로 가장 높게 나타났다. 가용성 고형분은 상압조건과 가압조건 모두 추출 시간이 길어짐에 따라 증가하였으며 추출시간 대비 상압조건보다 가압조건에서 추출했을 때 가용성 고형분 함량이 더 높게 나타났다. 단백질 함량은 상압조건과 가압조건 모두 추출시간이 길어짐에 따라 증가하는 경향이었고 상압조건으로 20 시간 추출할 때와 가압조건으로 60분 추출할 때의 단백질 함량이 유사하게 나타났다. 따라서, 추출시간이 더 짧은 가압추출이 1단계 녹용가수분해 추출물 제조에 더 효율적인 것으로 판단되며 적합한 추출조건은 온도 121℃, 시간 60분인 것이 바람직한 것으로 확인되었다.

본 발명에 따른 효소제에 의해 처리하는 1단계 가수분해 녹용 추출물을 Bacillus subtilis N2 균주 ((주)계명푸덱스분양미생물)를 이용하여 발효시키는 2단계 발효단계에 있어서, 상기 Bacillus subtilis N2 균주 배양액 2.0%(v/v)를 접종하여 37℃에서 24시간 발효시키는 것이 바람직하다.

본 발명에 사용한 공시 균주는 홍삼청국장에서 분리한 Bacillus subtilis N2를 (주)계명푸덱스로부터 분양받아 사용하였으며, 1단계 가수분해 녹용액을 121℃에서 15분간 멸균한 후 Bacillus subtilis N2를 10%(v/v) 접종하여 항온배양기(HB-102L, Korea)에서 37℃, 24시간 배양한 후 배양액으로 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용하는 Bacillus subtilis N2 균주는 nutrient agar plate에 37℃, 24시간동안 배양하여 Analytical Profile Index(API) CHB kit(bioMerieux Co, France)를 이용하여 49개의 탄소원에 대한 이용성을 조사하여 간이 동정하여 Bacillus subtilis N2 균주의 균학적 특성은 하기 [표 6] 및 [표 7]과 같다.

1단계 가수분해 녹용액을 121℃에서 60분간 추출한 후 Bacillus subtilis N2 균주 배양액을 0.5, 1.0, 1.5, 2.0%(v/v) 각각 접종하여 37℃에서 48시간 동안 발효시키면서 12시간 간격으로 pH, 당도, 생균수를 조사하여 [표 8] 및 [표 9]과 같은 결과를 얻었다.

pH는 발효기간이 길어짐에 따라 점차 낮아졌으며 균 접종량에 따른 차이는 없었다. 당도는 균접종량 및 발효기간에 따른 차이가 나타나지 않았다. 생균수를 조사한 결과는 [표 9]과 같이 균 접종 직후에는 접종량에 따라 1.9×10⁵～7.5×10⁵로 거의 동일하였으며 발효가 진행됨에 따라 점차 증가하여 발효 24시간째에 균접종량 2%(v/v) 발효녹용물의 균수량이 1.4×10⁷CFU/mL로 최대치를 나타내었다. 발효 36시간째에는 모든 구간에서 최대치에 도달하였으며 이후 다시 감소하는 경향을 나타내었다. 본 발명에서는 청국장에서 분리한 Bacillus subtilis N2를 이용하여 녹용의 발효 가능성을 확인하였으며 2단계 발효단계에 적합한 발효조건으로 균주 2.0%(v/v) 접종 후 24시간 발효하는 것이 바람직하다.

생균수는 시료 1 mL을 멸균 생리식염수 9 mL에 희석하고 잘 섞은 후 단계별로 희석한 다음 1 mL을 취하여 nutrient agar plate에 접종하고 37℃에서 24시간 배양한 후 생성된 집락수를 계측하고 희석배수를 곱하여 배양액 당 mL당 생균수를 산출하였다.

본 발명에 따른 2단계 발효 녹용을 살균하는 단계에 있어서, 온도는 95℃에서 10분간 살균하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 상기 살균된 2단계 발효 녹용을 여과하는 단계에 있어서, 8000rpm에서 20분간 여과하는 것이 바람직하다.

본 발명은 또한 상기의 방법으로 제조되어 유리아미노산, 콜라겐, 황산화-글 리코스아미노글리칸(Sulfated-GAGs) 및 시알산(Sialic acid) 함량이 높고, 혈전용해능 발현, 항산화 활성 및 당도가 높고 기능성이 강화된 특징을 가지는 가공발효녹용을 제공한다.

이하에서 본 발명의 바람직한 실시형태를 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 하지만 본 발명의 범위가 이러한 실시예에만 제한되지 아니하고 이를 변경한 당업자의 모방제품에도 그 권리범위가 미치는 것은 물론이다.

실시예 1 : 본 발명에 따른 1단계 가수분해 및 2단계 발효방식에 의한 가공발효녹용의 제조

본 발명의 방법에 따라 1단계 가수분해 및 2단계 발효방식에 의한 맞춤형 가공발효녹용을 제조하였다.

1단계 녹용가수분해 추출물(B)은 정제수에 입도 1.0㎜이하로 분쇄하여 분말화한 녹용 5%(w/v)를 첨가하여 효소제 proteAX와 복합효소 KFEN2를 각각 0.5%(w/w)첨가하여 60℃ 진탕수욕조에서 100 rpm으로 5시간 가수분해 반응시킨 후 121℃에서 60분간 추출하여 제조하였으며,

본 발명 가공발효녹용(C)은 1단계 녹용가수분해 추출물(B)에 Bacillus subtilis N2 배양액을 2.0%(v/v) 접종하여 37℃, 24시간 발효시키는 2단계 발효과정을 거친 후, 95℃에서 10분간 살균하여, 8000rpm에서 20분간 여과하여 제조하였다.

비교예 1 : 종래 녹용추출물의 제조방법

종래 녹용추출물(A)은 정제수에 녹용 5%(w/v)를 첨가하여 121℃에서 60분간 추출하여 제조하였다.

하기 비교예 1 및 실험예 1에서 제조한 종래 녹용추출물(A), 1단계 녹용가수분해 추출물(B) 및 본 발명 가공발효녹용(C)은 6,000 rpm 10분간 원심분리한 후 상등액을 취하여 2℃에서 보관하면서 유리아미노산 함량, 콜라겐 함량, 황산화-글리코사미노글리칸 함량, 시알산 함량, 혈전용해능, DPPH free radical 소거활성, superoxide radical 소거활성 등을 분석하였다.

실험예 1 : pH , 당도, 색도, 가용성 고형분 함량, 단백질 함량 실험결과

종래의 녹용추출물(A)과 본 발명에 의한 방법으로 제조한 1단계 녹용가수분해 추출물(B) 및 본 발명 가공발효녹용(C)의 pH, 당도, 색도, 가용성 고형분 함량, 단백질 함량 실험결과를 [표 10]에 나타내었다.

실험방법중 pH는 pH meter(Metrohm 691, Swiss)를 사용하여 측정하였으며, 당도는 굴절당도계 (PR-101, Atage Co. Ltd., Japan)를 사용하여 측정하였다. 또한, 색도는 UV-visible spectrometer(UV-1601, Shimadzu, Japan)를 사용하여 측정하였다. 또한, 가용성 고형분 함량은 항량한 수기에 시료액 2 mL을 취하여 105℃에서 증발 건조시킨 후 무게를 측정하여 시료액에 대한 건물량(%)으로 나타내었다. 또한, 단백질 함량은 Lowry법으로 측정하였으며 표준물질은 소혈청알부민(bovine serum albumin)을 사용하여 750 nm에서 흡광도 값을 측정하여 추출액에 대한 함량을 나타내었다.

그 결과 pH는 종래의 녹용추출물(A)이 7.58로 가장 높았고 1단계 녹용가수분해 추출물(B)은 좀 더 낮은 7.28이었으며 본 발명 가공발효녹용(C)은 7.19로 가장 낮게 나타났다. 당도는 종래의 녹용추출물(A)이 2.2 °Brix로 가장 낮았고 1단계 녹용가수분해 추출물(B)과 가공발효녹용(C)은 모두 2.8 °Brix로 1단계 가수분해과정에서 증가한 이후 당도 변화는 없는 것으로 나타났다. 색도 L값은 1단계 녹용가수분해 추출물(B)이 87.4로 종래의 녹용추출물(A)과 가공발효녹용(C)에 비해 높았으며 색도 a값은 종래의 녹용추출물(A)에 비해 1단계 녹용가수분해 추출물(B)과 가공발효녹용(C)의 값이 낮게 나타났으나 1단계 녹용가수분해 추출물(B)과 가공발효녹용(C)은 큰 차이가 없었다. 색도 b값은 시료 간 큰 차이가 없었다. 가용성 고형분은 종래의 녹용추출물(A)은 1.76%로 나타났으나 1단계 녹용가수분해 추출물(B)과 가공발효녹용(C)은 각각 2.12%, 2.19%로 종래의 녹용추출물(A)에 비해 증가하였다. 단백질 함량은 종래의 녹용추출물(A)이 754.2 mg%, 1단계 녹용가수분해 추출물(B)은 911.0 mg%로 1단계 가수분해과정에서 단백질 함량이 증가하였으며 가공발효녹용(C)의 단백질 함량은 922.1 mg%로 나타나 가장 높음을 확인하였다.

실험예 2 : 유리아미노산 함량 실험결과

종래의 녹용추출물(A)과 본 발명에 의한 방법으로 제조한 1단계 녹용가수분해 추출물(B) 및 본 발명 가공발효녹용(C)의 유리아미노산 함량 실험결과를 [표 11]에 나타내었다.

실험방법은 시료 20 g에 에탄올(ethanol) 80 mL을 가한 후 80℃ 수욕조에서 1시간 환류 냉각시켜 유리 아미노산을 추출하였다. 추출액을 여과지(Whatman No. 1, England)로 여과하여 감압 농축시킨 후 증류수로 50 mL이 되게 정용하였다. 시료 50 mL에 25% TCA 용액 50 mL 가하여 1시간 동안 냉장 보관 후 3,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 단백질을 제거하여 상등액을 취하였다. 상등액에 디에틸에테르(diethyl ether) 100 mL을 가하여 3회 반복 추출하여 지질, 색소 및 지용성 물질을 제거한 수용액 층을 40℃에서 감압농축시켜 0.2 N 리튬 구연산염 완충 제(lithium citrate buffer; pH 2.2) 10 mL로 용해하고 막필터(membrane filter; 구멍사이즈(pore size) 0.2 μm, Advantec MFS, Japan)로 여과한 후 아미노산 자동분석기(Biochem 20, Pharmacia Biotech. Ltd., England)로 분석하였다. 결과값은 추출물에 대한 mg% 단위로 나타내었다.

그 결과 종래의 녹용추출물(A)은 유리아미노산 성분 중 글리신(glycine)의 함량이 1.97 mg%로 가장 높았고 글루타민산(glutamic acid) 1.89 mg%, 알라닌(alanine) 1.88 mg%, 프롤린(proline) 1.13 mg% 순으로 함량이 높았으며 트립토판(tryptophan)을 제외한 7종의 필수아미노산이 골고루 존재하는 것으로 확인하였다.

1단계 녹용가수분해 추출물(B)은 류신(leucine)의 함량이 24.60 mg%로 가장 높았으며 다음으로 페닐알라닌(phenylalanine), 발린(valine)이 각각 15.07 mg%, 12.58 mg% 함유되어 있는 것으로 확인하였다. 종래의 녹용추출물(A)에서 함량이 낮았던 필수아미노산의 함량이 크게 증가되어 1단계 녹용가수분해 추출물(B)의 필수아미노산 함량은 종래의 녹용추출물(A)의 필수아미노산 함량보다 약 17배 증가된 76.55 mg%였으며, 총 유리아미노산은 157.25 mg%의 함량을 나타내었다.

본 발명 가공발효녹용(C)은 류신(leucine)의 함량이 40.54 mg%로 특히 많았으며 이소류신(isoleucine) 33.71 mg%, 발린(valine) 16.64 mg%, 글루타민산(glutamic acid) 18.89 mg% 순으로 높은 함량을 나타냈다. Bacillus subtilis N2를 이용한 2단계 발효과정에서 글루타민산(glutamic acid), 발린(valine), 류신(leucine) 등의 필수아미노산의 함량이 증가하여 가공발효녹용(C)의 필수아미노 산 총량은 132.16 mg%로 나타났으며 총 유리아미노산 함량은 종래의 녹용추출물(A)의 총 유리아미노산 함량 17.92 mg%에 비해 약 13배 증가한 242.91 mg%임을 확인하였다.

실험예 3 : 콜라겐 함량 실험결과

종래의 녹용추출물(A)과 본 발명에 의한 방법으로 제조한 1단계 녹용가수분 해 추출물(B) 및 본 발명 가공발효녹용(C)의 콜라겐 함량 실험결과를 [표 12]에 나타내었다.

실험방법은 콜라겐 함량은 추출물 시료 2 g을 삼각 플라스크에 취한 다음 황산용액 15 mL을 첨가하고 뚜껑을 덮은 후 105℃ 오븐건조기(dry oven)에서 16시간 가열하여 가수분해하였다. 가수분해물을 250 mL로 정용한 후 여과하였으며, 그 중 20 mL을 취하여 100 mL로 희석한 다음 시험관에 희석액 2 mL을 넣고 옥시던트(Oxidant) 용액 1 mL을 첨가한 후 실온에서 20분간 정치시켰다. 발색제 1 mL을 넣고 혼합한 다음 60℃의 중탕냄비(water bath)에서 15분간 반응시킨 후 냉각시키고 UV-visible spectrometer(UV-1601, Shimadzu, Japan)를 사용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선으로부터 hydroxyproline양을 측정하였고 콜라겐 함량은 hydroxyproline 함량에 상수 8을 곱하여 계산하였다.

그 결과 종래의 녹용추출물(A)은 200.6 mg%의 함량을 나타내었고 1단계 녹용가수분해 추출물(B)은 240.0 mg%로 종래의 녹용추출물(A)에 비해 높았다. 본 발명 가공발효녹용(C)은 243.4 mg%로 종래의 녹용추출물(A)에 비해 높았다. 콜라겐은 녹용 단백질이 주요 구성 물질을 이루고 있으며 일반적으로 그 아미노산 서열은 Gly-X-Y의 구조를 갖는 3중 나선구조이다. 본 발명에서 1단계 녹용가수분해 추출물(B) 및 가공발효녹용(C)의 콜라겐 함량이 증가한 것은 녹용의 1단계 가수분해과정에서 효소가 활성화되어 콜라겐 분자사이의 공유결합이 끊어짐으로서 콜라겐의 용해도가 증가됨을 확인할 수 있었다.

실험예 4 : 황산화 -글리코스아미노글리칸( Sulfated - GAGs ) 함량 실험결과

종래의 녹용추출물(A)과 본 발명에 의한 방법으로 제조한 1단계 녹용가수분해 추출물(B) 및 본 발명 가공발효녹용(C)의 황산화-글리코스아미노글리칸(Sulfated-GAGs) 함량 실험결과를 [표 13]에 나타내었다.

실험방법은 먼저 염화나트륨(NaCl) 1.185 g, 글리신(glycine) 1.52 g, dimethylmethylene blue(DMB) 0.008 g과 36% 염화수소(HCl) 0.47 mL을 500 mL 증류수에 녹여 DMB dye 용액을 제조하였으며 제조한 용액은 525 nm에서 약 0.34의 흡광도 값을 가진다. 시료 0.2 mL을 DMB 용액 8 mL과 혼합한 후 525 nm에서 흡광도를 측정하였으며 시료 중의 황산화-글리코스아미노글리칸(sulfated-GAGs) 함량은 chondroitin 4-sulfate를 이용한 검량곡선을 사용하여 계산한 후 추출물에 대한 mg% 단위로 나타내었다.

그 결과 종래의 녹용추출물(A)은 9.3 mg%이었고 본 발명에 의한 방법으로 제 조한 1단계 녹용가수분해 추출물(B) 및 본 발명 가공발효녹용(C)은 각각 10.3 mg%, 13.2 mg%로 발효 과정에서 함량이 증가하는 것으로 나타났다. 글리코스아미노글리칸(glycosaminoglycan)은 동물 점조직이나 결합조직에 필수성분으로 알려져 있으며 황산화-글리코스아미노글리칸은 단백질과 연결되어 프로테오글리칸(proteoglycan)의 형태로 존재하는데, 관절 속의 활액이 연골에 머물도록 도와주는 역할과 피부, 탯줄 등 각종 결합조직에 함유되어 각 조직 중에 수분과 영양분을 축척하는 역할을 한다. 또한 본 발명에서 황산화-글리코스아미노글리칸 함량 분석의 표준물질로 사용한 chondroitin-4-sulfate는 골형성 과정에서 이온 교환체(ion exchanger)로서 글리코스아미노글리칸의 주요한 성분으로 보고되고 있다. 본 발명에서 1단계 가수분해과정 및 2단계 발효과정을 통해 황산화-글리코스아미노글리칸 함량이 증가됨을 확인할 수 있었다.

실험예 5 : 시알산( Sialic acid ) 함량 실험결과

종래의 녹용추출물(A)과 본 발명에 의한 방법으로 제조한 1단계 녹용가수분해 추출물(B) 및 본 발명 가공발효녹용(C)의 시알산(Sialic acid) 함량 실험결과를 [표 14]에 나타내었다.

실험방법은 시료 2 g에 0.1 N 황산(H₂SO₄) 용액 15 mL를 가하여 80℃에서 1시간 동안 가수분해한 후 여과하였다. 여과한 가수분해 시료 0.6 mL에 0.25 M HCl로 제조한 0.25 M periodate solution 0.3 mL을 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시킨 후 0.32 M sodium thiosulfate 용액을 1.0 mL 첨가하여 과량의 periodate를 환원시켰다. 0.1 M TBA 용액을 2.5 mL 첨가한 후 100℃에서 15분간 발색시켜 상온에서 냉각한 다음 5% 12 N HCl을 포함하는 부탄올(butanol) 용액으로 반응액을 추출하여 549 nm에서 흡광도를 측정한 후 N-acetylneuraminic acid를 이용하여 작성한 검량곡선으로 계산하여 추출물에 대한 mg% 단위로 나타내었다.

그 결과 종래의 녹용추출물(A)은 4.6 mg%의 함량을 나타냈으며 1단계 녹용가수분해 추출물(B)은 5.1 mg%, 가공발효녹용(C)은 5.8 mg%로 종래의 녹용추출물(A)보다 함량이 높음을 확인하였다.

시알산은 녹용의 새로운 지표물질로 알려져 있는 강글리오사이드(Ganglioside)의 종류를 결정하는 주성분으로 세포의 신호 전달계에서 중요한 역할을 하며 특히 성장, 분화 및 부착과 같은 세포의 일련 과정에서 중요하다. 강글리오사이드(Ganglioside)는 복잡한 글리코스핑고리피드 (glycosphingolipid)의 하나로 수개의 당 단위가 결합된 극성의 머리부분을 가지고 있으며 한 개 이상의 시 알산(sialic acid)을 포함하고 있다. 강글리오사이드(gangliosides)는 세포막의 유동성과 물질 이동에 관여하고, 단백질의 인산화를 조절하여 생체 내 신호전달체계에 관여하는 것으로 알려져 있다.

실험예 6 : 혈전용해능 실험결과

종래의 녹용추출물(A)과 본 발명에 의한 방법으로 제조한 1단계 녹용가수분해 추출물(B) 및 본 발명 가공발효녹용(C)의 혈전용해능 실험결과를 [표 15]에 나타내었다.

실험방법은 혈전용해효소 활성은 fibrin plate method의 일종인 Astrup and Mullertz method을 사용하여 측정하였다. 대조구로는 정제된 혈전용해제인 플라스민(plasmin; 1 unit/mL)을 사용하였으며, 균주 배양액의 혈전용해 효소 활성은 아래와 같은 방법으로 구하였다.

혈전용해효소활성(%)=

×100

그 결과 종래의 녹용추출물(A)과 1단계 녹용가수분해 추출물(B)은 혈전용해 활성을 나타내는 투명환이 나타나지 않았고 가공발효녹용(C)은 직경 8.5 mm의 투명환이 생성되어 50.3%의 혈전용해능을 나타내었다. 본 발명에서 Bacillus subtilis N2 균주로 녹용을 발효하는 과정에서 높은 혈전용해능이 발현된 것으로 판단되며 혈전용해 활성이 뛰어난 기능성 강화 녹용제품 제조가 가능함을 확인하였다.

실험예 7 : α,α＇- diphenyl -β- picrylhydrazyl ( DPPH ) 라디칼 소거활성 실험결과

종래의 녹용추출물(A)과 본 발명에 의한 방법으로 제조한 1단계 녹용가수분해 추출물(B) 및 본 발명 가공발효녹용(C)의 α,α＇-diphenyl-β-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거활성 실험결과를 [표 16]에 나타내었다.

실험방법은 DPPH 12 mg을 absolute ethanol 100 mL에 용해한 후, 50% ethanol 용액을 대조구로 하여 517 nm에서 DPPH용액의 흡광도가 약 1.0이 되도록 희석하여 사용하였다. 시료는 시료 1 g을 ethanol 1 g에 30분간 교반한 후 8,000 rpm, 10분간 원심분리하여 상등액 1 mL에 DPPH용액 4 mL을 혼합하여 정확히 30초 동안 반응시킨 후 UV-visible spectrophotometer(UV-1601, Shimadzu, Japan)로 517 nm에서 흡광도의 변화를 측정해 아래의 식으로부터 DPPH 라디칼 소거활성을 계산하였다.

DPPH free radical 소거활성(%)= (1-

)×100

As: 시료 첨가구의 흡광도

Ac: 시료 무첨가구의 흡광도

그 결과 종래의 녹용추출물(A)은 36.0%의 활성을 나타냈으며 1단계 녹용가수분해 추출물(B) 및 가공발효녹용(C)은 종래의 녹용추출물(A)에 비해 크게 증가하여 47.4%의 활성을 나타냈다.

DPPH 실험은 안정화된 상태로 존재하는 DPPH free radical에 전자를 공여하여 산화를 억제하는 능력을 평가하는 방법으로 항산화 활성 검토에 자주 사용되는 방법 중 하나이다. 즉, 본 발명의 1단계 가수분해과정 및 2단계 발효과정에 의해 항산화가 활성화된 녹용제품 제조가 가능함을 확인하였다.

실험예 8 : 슈퍼옥사이드 라디칼 ( Superoxide radical ) 소거활성 실험결과

종래의 녹용추출물(A)과 본 발명에 의한 방법으로 제조한 1단계 녹용가수분해 추출물(B) 및 본 발명 가공발효녹용(C)의 슈퍼옥사이드 라디칼(Superoxide radical) 소거활성 실험결과를 [표 17]에 나타내었다.

실험방법은 슈퍼옥사이드 라디칼(Superoxide radical;(O2?-1) 소거활성은 xanthine-xanthine oxidase cytochrome C 환원법으로 측정하였다. 녹용추출물 0.2 mL에 50 mM 인산완충액(pH 7.8) 1.2 mL, 1 mM 크산틴(xanthine) 0.2 mL, 0.05 mM 시토크롬(cytochrome) C 0.2 mL 및 550 nm에서 분당 흡광도 변화가 0.02가 되도록 희석한 xanthine oxidase 0.2 mL를 가하여 혼합한 다음 정확히 3분 동안 반응시킨 후 UV-visible spectrophotometer(UV-1601, Shimadzu, Japan)를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하여 아래의 식으로부터 슈퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical) 소거활성으로 나타내었다.

?O₂ ^-소거활성(%)= (1 -

) × 100

As : 시료 첨가구의 흡광도

Ac : 시료 무첨가구의 흡광도

그 결과 종래의 녹용추출물(A)은 36.4%의 활성을 나타냈으며, 본 발명에 의한 방법으로 제조한 1단계 녹용가수분해 추출물(B) 및 본 발명 가공발효녹용(C)은 44.3%로 종래의 녹용추출물(A)에 비해 활성이 높았다. 크산틴산화효소(Xanthine oxidase)가 생물 조직에 산화적 손상을 일으켜 의해 생성된 슈퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical)은 염증, 동맥경화, 암 및 노화 등의 주요 발병 인자이므로 크산틴산화효소(xanthine oxidase) 활성저해를 통한 free radical 생성 억제는 항산화, 노화방지 및 항암 등과 연관되어 생물학적으로 중요한 의의를 가진다. 본 발명에서 효소적 가수분해 처리과정과 미생물 발효과정을 통해 녹용제품의 슈퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical) 소거활성이 증가되어 항산화능이 뛰어난 녹용제품 제조가 가능함을 확인하였다.

이상 설명한 바와 같이 본 발명은 효소에 의한 가수분해 및 미생물을 이용한 발효의 2단계 처리방식을 통하여 녹용의 특정성분을 강화시킨 기능성 가공식품인 맞춤형 발효녹용제품을 제공할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 가공식품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

도 1은 본 발명에 사용한 녹용 및 녹용분말을 촬영한 사진도이다.

도 2는 본 발명의 2단계 방식에 의한 기능성이 강화된 맞춤형 가공발효녹용의 제조방법을 개략적으로 나타낸 공정도이다.

Claims

삭제
녹용을 입도 1.0㎜이하로 분쇄하여 분말화하는 단계;

정제수에 상기 녹용분말 5%(w/v)를 첨가하고 효소제 proteAX(protease: Amano Enzyme INC., 일본)와 복합효소 KFEN2^？(glucoamylase : (주)계명푸덱스산, 대구)를 각각 0.5%(w/w)첨가하여 60℃ 진탕수욕조에서 100rpm으로 5시간 반응시켜 분해하는 1단계 가수분해단계;

상기 1단계 가수분해한 녹용을 121℃에서 60분간 추출하는 단계;

상기 1단계 가수분해한 녹용 추출물에 Bacillus subtilisN2 균주 ((주)계명푸덱스분양미생물)배양액 2.0%(v/v)를 접종하여 37℃에서 24시간 발효시키는 2단계 발효단계;

상기 2단계 발효 녹용을 95℃에서 10분간 살균하는 단계; 및

상기 살균된 2단계 발효 녹용을 8000rpm에서 20분간 여과하는 단계

를 포함함을 특징으로 하는 가공발효녹용의 제조방법.
제2항 기재의 방법으로 제조되어 pH 7.19±0.03, °Brix 2.8±0.1 인 것을 특징으로 하는 가공발효녹용.