KR102520365B1

KR102520365B1 - 폴리감마글루탐산 함유 발효 산물의 제조방법

Info

Publication number: KR102520365B1
Application number: KR1020180031439A
Authority: KR
Inventors: 공인수; 김장호; 이종민; 장원제
Original assignee: 부경대학교 산학협력단
Priority date: 2018-03-19
Filing date: 2018-03-19
Publication date: 2023-04-10
Also published as: KR20190109853A

Abstract

본 발명은 바실러스 속 균주로 파래를 발효한, 폴리감마글루탐산을 함유하는 파래 발효 산물에 관한 것으로, 파래를 전처리 없이 균주 바실러스 속 SJ-10 JCM 15709 (KCCM90078)이 발효 및 분해하여 폴리감마글루탐산을 포함하는 파래 발효 산물을 생산하고 이로부터 폴리감마글루탐산을 분리할 수 있으며, 본 발명의 최적 발효 조건으로 발효를 수행하면 종래의 폴리감마글루탐산 제조방법에 비해 현저한 비용절감 효과가 있다.

Description

폴리감마글루탐산 함유 발효 산물의 제조방법{METHOD OF PRODUCING POLY GAMMA GLUTAMIC ACID-CONTAINING FERMENTED PRODUCT}

본 발명은 폴리감마글루탐산 함유 발효 산물의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로, 바실러스 속 균주로 파래를 발효한, 폴리감마글루탐산을 함유하는 파래 발효 산물에 관한 것이다.

폴리감마글루탐산은 D, L-글루탐산이 감마-글루타밀(-glutamyl) 결합된 중합체인 점액성 물질로, 바실러스 서브틸리스 등의 몇몇 바실러스 속 균주의 배양 시에 세포 밖으로 분비되는 발효 생산물이다. 폴리감마글루탐산은 사람과 환경에 독성이 전혀 없고, 수용성이며 생분해 가능한 고분자로 알려져 있다. 이런 특징 때문에 폴리감마글루탐산은 식용, 수용성, 음이온성 및 생분해성 고분자물질로 침전농축장치, 습윤제, 동결방지제, 약물 담체(drug carrier), 생분해성 섬유, 사료첨가제, 흡습제, 보습제 및 화장품의 원료물질 등의 다양한 분야에서 이용이 가능하며, 식품, 화장품, 의약 등의 산업에서 많은 관심을 가지고 있는 고부가가치 바이오소재로 인식되어 오고 있다.

최근, 폴리감마글루탐산의 생산과 이용에 관하여 난분해성 중합체의 대체상품 소재, 에스테르화 반응에 의한 내열성 플라스틱의 개발과 수용성 섬유 및 막생산 등에 관심을 둔 연구가 선진공업국을 중심으로 활발히 진행되고 있다. 또한, 폴 리감마글루탐산에 감마선 조사시 야기되는 물성변화 연구 및 가교결합제에 의한 수화젤(Hydrogel)의 개발 및 산업화 연구가 추진되고 있다. 수화젤은 바실러스 서브틸리스 청국장이 발효 생산하는 재생산 가능한 바이오폴리머인 폴리감마글루탐산를 원료로 하여, 분자간 혹은 동일 분자내에 가교 결합시켜 합성한 흡수성, 생분해성 및 가소성을 특징으로 하는 환경친화 소재이다. 가교법에는 감마선이나 전자선 등의 방사선 조사나 에폭시 수지 등을 이용한 화학 가교제 처리 방법 등이 있다. 수용액에 방사선을 조사하면 폴리감마글루탐산의 분자간에 가교반응이 일어나고, 흡수성, 생분해성 및 가소성을 특징으로 하는 폴리감마글루탐산 수지가 얻어진다. 폴리감마글루탐산의 조성, 폴리감마글루탐산 생산에 미치는 망간 이온의 영향, 초음파 분해에 의한 수용성 중합체로의 이용에 대한 연구 및 에스테르 유도체의 합성에 의한 저 수용성 플라스틱의 개발에 관한 연구(참조: Biosci, Biote chnol, Biochem, 60(8):1239-1242, 1996) 등이 보고되고 있다. 이외에, 수계의 인 함량을 감소시켜 수질오염을 감소시키는 효과(참조: 유럽특허 제838160호)와, 방사선 조사에 의한 고 겔화성, 흡수성을 가진 생분해성 흡착성 수지를 제조하여 기저귀 등의 위생용품, 식품, 원예산업에의 응용(참조: 일본특허공개 平10-251402호) 및 활용(참조: 일본특허공개 平7-300522호, 일본특허공개 平6-322358호)등에 관한 보고가 있다. 또한, 폴리감마글루탐산의 용해, 침전 및 건조에 의한 고형화 생분해성 섬유나 필름 및 필름 성형체로서의 이용(참조: 일본특허공개 平7-138364호, 일 본특허공개 平5-117388호), 약물담체용 폴리머(참조; 일본특허공개 平6-92870호, 일본특허공개 平6-256220호)등에 대한 보고도 있다. 폴리감마글루탐산 수화젤(이하, PGA 수화젤)은 높은 흡수성과 보습성을 가지므로, 이를 화장품에 사용하는 연구가 진행되어 왔다(미국특허공개 2008/0070993, 미국특허공개 2006/0153785).

본 발명에서는 파래를 전처리 없이 균주 바실러스 속 SJ-10 JCM 15709 (KCCM90078)이 발효 및 분해하여 폴리감마글루탐산을 포함하는 파래 발효 산물을 생산하고 이로부터 폴리감마글루탐산을 분리할 수 있음을 확인함으로써, 상기 균주와 파래 기질을 이용하여 폴리감마글루탐산을 함유하는 발효 산물 및 폴리감마글루탐산을 제조하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적의 달성을 위해, 본 발명은 폴리감마글루탐산 함유 파래 발효 산물의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 폴리감마글루탐산을 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 폴리감마글루탐산 함유 파래 발효 산물 또는 이로부터 분리한 폴리감마글루탐산을 제공한다.

또한, 본 발명은 폴리감마글루탐산 함유 파래 발효 산물 또는 이로부터 분리한 폴리감마글루탐산을 포함하는 식품 조성물을 제공한다

아울러, 본 발명은 폴리감마글루탐산 함유 파래 발효 산물 또는 이로부터 분리한 폴리감마글루탐산을 포함하는 사료 조성물을 제공한다.

본 발명의 제조방법은 기질인 파래의 전처리 없이 파래 발효 산물 또는 폴리감마글루탐산의 제조가 가능하며, 본 발명의 최적 발효 조건으로 발효를 수행하면 종래의 폴리감마글루탐산 제조방법에 비해 현저한 비용절감 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 발효 기질로 사용한 파래 시료의 계통을 동정한 계통수이다.
도 2는 무처리 파래, 오토클레이브한 파래 및 바실러스 속 SJ-10 JCM 15709 (KCCM90078) 균주로 발효한 파래의 세포벽을 확인한 도이다.
도 3은 바실러스 속 SJ-10 JCM 15709 (KCCM90078) 균주로 파래를 발효하여 생성된 에탄올-추출된 다당류(ethanol-extracted polysaccharide) (폴리감마글루탐산)의 투명한 영역을 확인한 도이다.
도 4는 바실러스 속 SJ-10 JCM 15709 (KCCM90078) 균주로 파래를 발효한 발효 산물로부터 분리한 폴리감마글루탐산의 분자량을 확인한 도이다:
1: 8% 염화나트륨 조건으로 생산된 폴리감마글루탐산 표준품; 및
2: 본 발명의 파래 발효 산물로부터 분리된 폴리감마글루탐산.
도 5는 바실러스 속 SJ-10 JCM 15709 (KCCM90078) 균주로 파래를 발효한 발효 산물로부터 분리한 폴리감마글루탐산의 L형 및 D형을 확인한 도이다:
1: D-글루탐산;
2: L-글루탐산;
3: 상업용 폴리감마글루탐산; 및
4: 파래 발효 산물로부터 분리된 폴리감마글루탐산.
도 6은 One factor at a time 방법을 이용한 최적 UP, L- 글루탐산 및 염화나트륨의 농도와 배양 시간을 나타낸 도이다.
도 7은 파래 파우더(UP), L- 글루타민산 및 염화나트륨과 γ-PGA 생산 수율 간의 상호 작용을 나타낸 3D 표면 플롯이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (w/w) %, 고체/액체는 (w/v) %, 그리고 액체/액체는 (v/v) %이다.

본 발명에서 사용된 용어 파래 "발효 산물"이란 균주를 이용하여 파래(Enteromorpha), 파래 파우더 또는 이를 포함하는 배지 또는 조성물을 발효하여 얻은 산물을 칭하는 것으로 발효 전 또는 후에 추가로 추출하여 추출물의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "추출물(extract)"이란 천연물로부터 분리된 활성성분 즉, 목적하는 활성을 보이는 물질을 의미한다. 상기 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매를 이용하는 추출과정으로 획득할수 있으며, 추출물 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함한다. 또한, 상기 추출물에는 상기 추출과정을 거친 추출물을 분획한 것도 포함된다. 추출물의 추출 방법은 특별히 제한되지 않으며, 예컨대 교반 추출, 진탕 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 방법으로 추출될 수 있다. 추출 용매로는 물, C₁-C₄의 저급 알코올과 같은 극성 용매나 헥산, 클로로 포름, 디클로로메탄 또는 에틸아세테이트와 같은 비극성 용매, 또는 이들 중 2 이상의 혼합물을 사용할 수도 있다.

일 측면에서, 본 발명은 기탁번호 KCCM90078의 바실러스 속 균주로 파래(Ulva sp.)를 포함하는 기질을 발효하는 단계를 포함하는, 폴리감마글루탐산(poly γ-glutamic acid, γ-PGA, PGA) 함유 파래 발효 산물의 제조방법 및 이릉 통해 수득한 파래 발효 산물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 파래는 파래를 건조하여 분쇄한 분쇄물, 파래를 추출한 뒤 동결건조한 분말 또는 파래 추출물일 수 있으며, 파래를 탈염 및 동결건조하여 분쇄한 파래 파우더인 것이 가장 바람직하다.

일 구현예에서, 기질은 파래 30 내지 60g/L, L-글루탐산 4 내지 10g/L 및 염화나트륨 30 내지 80g/L을 포함하는 기질을 발효할 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 파래 발효 산물은 폴리감마글루탐산을 4 내지 10g/L으로 함유할 수 있으며, 폴리감마글루탐산의 D-폴리감마글루탐산 및 L-폴리감마글루탐산 비율이 5:5 내지 9:1일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "파래 발효 산물"은 파래만을 기질로 이용하여 기탁번호 KCCM90078의 바실러스 속 균주가 발효한 산물, 파래를 포함하는 기질을 이용하여 기탁번호 KCCM90078의 바실러스 속 균주가 발효한 산물을 모두 포함한다.

통상적으로 균주로부터 생산되는 폴리감마글루탐산은 균주 및 기질에 따라 D/L의 비율이 서로 다르다고 알려져 있으며, 본 발명의 파래 발효 산물에 함유된 폴리감마글루탐산의 D/L 비율은 기탁번호 KCCM90078의 바실러스 속 균주 SJ-10가 파래 파우더를 포함하는 기질을 발효하여 생산한 폴리감마글루탐산에서만 도출될 수 있는 결과이다.

일 구현예에서, 본 발명의 균주는 산 가수 분해 또는 효소 처리와 같은 전처리 없이 파래의 세포벽을 직접 분해하여 γ-PGA을 생산할 수 있으며, 생산된 γ-PGA는 에탄올-추출된 다당류(ethanol-extracted polysaccharide)의 투명한 영역을 형성하므로, γ-PGA의 정제 단계 중 하나인 에탄올 침전 부분에서의 불순물이 감소되는 효과가 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 파래 발효 산물은 평균 분자량(MW) 약 400 kDa의 폴리감마글루탐산을 함유할 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 기탁번호 KCCM90078의 바실러스 속 균주로 파래(Ulva sp.)를 포함하는 기질을 발효하는 단계; 발효물로부터 상기 균주를 제거하는 단계; 에탄올과 혼합하여 원심분리하는 단계; 침전물을 증류수에 용해한 뒤 가열하는 단계; 및 탈염하는 단계를 포함하는, 폴리감마글루탐산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, 기질은 파래 30 내지 60g/L, L-글루탐산 4 내지 10g/L 및 염화나트륨 30 내지 80g/L을 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 생산된 폴리감마글루탐산의 D-폴리감마글루탐산 및 L-폴리감마글루탐산의 비율이 5:5 내지 9:1일 수 있다.

일 구현예에서, 파래를 기질로 사용함으로써, 종래의 다른 탄소원을 사용한 것보다 L-글루탐산 및 염화나트륨의 사용량이 현저히 감소하여 폴리감마글루탐산의 생산 비용이 50 내지 75% 감소할 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 체내 칼슘 흡수 촉진 및 면역 증강 효과가 있는 폴리감마글루탐산 또는 이를 함유하는 파래 발효 산물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어, "면역 증강"은 본 발명의 조성물의 투여로 면역력이 증가되는 모든 행위를 의미한다. 즉. 면역세포에서의 사이토카인 분비를 증가시킴으로써 면역 반응을 촉진하는 기능, 또는 면역계의 세포 (예를 들어, NK Cell: natural killer cell)의 활성을 증대시킴으로써 면역을 강화하는 기능을 포함한다.

본 발명의 면역 증강용 약학적 조성물은 이의 면역 증강 효과를 통해 면역 질환의 예방 또는 치료용도로 사용될 수 있다. 상기 면역 질환은 감기, 천식, 폐렴, 알러지성 비염, 알러지성 결막염, 아토피성 피부염, 알러지, 류마티스 관절염, 알츠하이머병, 자가면역성 갑상선 질환, 염증성 장질환, 재생불량성 빈혈, 홍반성 루푸스 또는 건선일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

일 구현예에서, 상기 약학 조성물은 경구형 제형, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 및 분무제를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형일 수 있다.

본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack PublishingCo.에 기술되어있다.

본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 단백질을 0.0001 내지 10 중량 %로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량 %를 포함한다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 0.0001 ~ 10 ㎎/㎖이며, 바람직하게는 0.0001 ~ 5 ㎎/㎖이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 조성물의 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 다양한 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 함께 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다.

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 파래 발효 산물 또는 이로부터 분리한 폴리감마글루탐산을 포함하는 식품 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 본 발명의 식품 조성물은 체내 칼슘 흡수 촉진 및 면역 증강 효과가 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "식품"이란 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성식품 및 음료를 모두 포함하는 의도이다.

본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 통상의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 통상의 기술분야에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 건강기능식품은 항암제의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.

또한, 본 발명의 조성물이 사용될 수 있는 건강식품의 종류에는 제한이 없다. 아울러 본 발명의 파래 발효 산물 또는 이로부터 분리한 폴리감마글루탐산을 활성성분으로 포함하는 조성물은 당업자의 선택에 따라 건강기능식품에 함유될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림 류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 추출물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다.

본 발명의 파래 발효 산물은 식품에서 분리한 균주로 일반 식품인 파래를 발효하였고, 발효 과정에서 생산된 폴리감마글루탐산이므로, 약학적 조성물 또는 식품 조성물로 사용할 경우에도 일반적인 합성 화합물에 비하여 부작용이 덜할 수 있으므로, 안전하게 약학적 조성물 및 건강기능식품에 포함되어 유용하게 사용될 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 파래 발효 산물 또는 이로부터 분리한 폴리감마글루탐산을 포함하는 사료 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 사료 조성물은 어분일 수 있다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 균주 분리 및 최적화

오징어 젓갈로부터 호염성 균주를 분리하여 분리하였으며, 16S rRNA 유전자 염기서열을 통한 계통분석 결과 바실러스 속(Bacillus sp.)이었으며 Bacillus sp. SJ-10으로 명명하여 이를 한국 미생물 보존센터에 기탁하였다 (SJ-10 JCM 15709, KCCM90078). 본 균주는 NaCl 0~14%, 20~55℃ 및 pH 5~8에서 성장하였으며, 35±5℃, pH 7 및 5% NaCl에서 최적으로 성장하였다. 주요 지방산 조성은 anteiso-C15:0 (44.70%), anteiso-C17:0 (15.76%) 및 C16:0 (13.91%)이었고, menaquinone은 MK-7이었으며, DNA G+C 함량은 50.58 ㏖%였다.

HM 아가 플레이트에서 성장한 바실러스 SJ-10를 50ml 플라스크의 HM 액체 배지 (g/L glucose, 5g/L, proteose peptone, 5g/L yeast extract, 50g/L sodium chloride pH 7.2 ± 0.1 포함) 3ml에 접종하고 하룻밤 동안 배양하였다. 그 후, 250ml 플라스크에 1% (v/v)로 옮기고 37.5℃에서 160rpm으로 16h 동안 호기적으로 교반배양하였다.

실시예 2. 파래 기질 준비

파래 (Ulva sp.)는 부산의 다대포에서 수집하였다 (35°03'24.5"N 128°58'27.5"E). 수집한 시료를 물로 세척하여 기생충 및 염분을 제거한 뒤, 동결건조하여 무균 블렌더로 분쇄하여 파래 파우더 (UP)를 제조하였다. 수집한 파래의 계통을 동정하기 위해, Dneasy Plant Mini Kit (QIAGEN, Valencia, Calif., USA)로 총 DNA를 추출한 뒤, 이를 주형으로 프라이머 ITS1 (5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3') 및 ITS4 (5'-TCC TCC GCT GC-3')로 PCR을 수행하였다. PCR은 94℃에서 45초 변성, 55℃에서 60초 어닐링 및 72℃에서 60초 연장하는 조건으로 35 사이클 동안 수행된 뒤, 4℃에서 종료되었다. PCR 산물은 Big Dye Terminator Cycle Sequencing ki(Applied Biosystems, USA)로 분리한 뒤 3730xl DNA Analyzer (Applied biosystems, USA)로 시퀀싱되었다. 시퀀싱 결과는 NCBI 데이터베이스에서 확인한 뒤, 이를 기초로 BioEdit 및 MEGA 7.0를 이용하여 neighbor-joining 방법으로 계통수(phylogenetic tree)를 작성하였다 (도 1). 그 결과, 본 발명에서 수집하여 기질로 이용한 파래가 U. prolifera (JN845568.1)와 U. flexuosa (KF908033.1)의 진화 체계에 거의 가까운 Ulva sp.임을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 바실러스 속 SJ-10의 파래 기질 발효

상기 실시예 2에서 제조한 파래 파우더 (UP)를 상기 실시예 1의 균주 바실러스 속 SJ-10 JCM 15709 (KCCM90078)의 기질로 이용하여 발효하고 파래의 세포벽 분해를 SEM 및 콩고 레드 분석으로 확인하였다. 구체적으로, 균주를 처리하지 않은 파래 파우더 (UP), 오토클레이브한 파래 파우더 및 파래 파우더에 균주를 1% (v/v)로 처리하여 2일 동안 37.5℃에서 160rpm으로 교반 배양하여 발효한 시료를 동결 건조하였다. 그 후, Low Vacuum Scanning Electron Mircroscope & CL (JEOL Japan,　JSM-6490 LV Gatan　(U.K)　mono CL3+)로 파래 세포벽의 조직학적 변화를 관찰하였다. 또한, 콩고 레드 아가 방법 (Congo red agar method) (Teather and Wood, 1982)을 이용하여 세포벽 성분의 분해를 확인하였다.

그 결과, 오토클레이브로 인해 조직(세포벽) 표면이 변화된 것과 달리 (도 2b), 발효에 의해 조직 표면에서 구멍과 박테리아 및 이의 대사 산물이 관찰되어 (도 2c), 일반적으로 단당류를 이용하는 바실러스 속 SJ-10이 전처리 없이도 파래 파우더의 세포벽 성분을 이용하는 것으로 나타났다. 이를 통해, 바실러스 속 SJ-10은 종래의 해조류를 이용한 발효 과정에서 산 가수 분해 또는 효소 처리와 같은 전처리 과정 없이도, 파래 파우더의 다당류가 풍부한 세포벽을 분해하여 기질로 사용할 수 있는 것으로 나타났다. 또한, 콩고 레드 분석 결과에 따르면, 본 발명의 SJ-10 균주가 파래 파우더를 발효하여 분해함으로써 에탄올-추출된 다당류(ethanol-extracted polysaccharide)의 투명한 영역을 형성한 것을 확인할 수 있었다 (도 3). 상기 결과를 통해, γ-PGA의 정제 단계 중 하나인 에탄올 침전 부분에서의 불순물이 감소될 것임을 알 수 있었다.

실시예 4. γ-PGA 추출 및 특성 확인

4-1. γ-PGA 추출

상기 실시예 3에서 바실러스 속 SJ-10로 파래 파우더를 발효한 시료를, 4℃에서 7,000rpm으로 10분 동안 원심분리하여 박테리아 세포들을 분리하고, γ-PGA를 함유하는 상등액을 1:3의 부피비로 에탄올과 혼합하여 4℃에서 12시간 동안 방치하였다. 그 후, 4℃에서 7,000rpm으로 20분 동안 원심분리하여 침전물을 수득한 뒤, 이를 증류수에 용해시켰다. 상기 수용액을 30분 동안 가열하여 단백질을 변성시킨 뒤, 4℃에서 7,000rpm으로 20분 동안 원심분리하여 조 γ-PGA 용액을 수득하였다. 조 γ-PGA 용액을 투석하여 탈염시키고 (분자량 cutoff 12 내지 14kD), 동결건조하여 γ-PGA를 수득하였다. 수득한 γ-PGA의 양은 동결건조된 정제 산물의 건조 중량 및 총 당함량을 이용하여 하기 수학식 1로 계산되었다. 건조 산물의 총 당함량은 건조 산물 시료 100ul 및 5% 페놀 100ul을 혼합하고 10분간 방치한 후, 500ul의 황산을 첨가하여 혼합한 뒤 15 분 후에 495nm에서 OD 값을 측정함으로써 확인하였다.

4-2. γ-PGA 특성 확인

4-2-1. 분자량 분석

상기 실시예 4-1에서 SJ-10 균주로 파래 파우더를 발효한 뒤 수득한 γ-PGA의 분자량을 6% 아크릴 아미드 겔에서 SDS-PAGE로 확인하였다. 전기영동 후, Coomassie Brilliant Blue로 염색하고 탈염색 용액으로 탈염색한 뒤, 메틸렌 블루가 포함된 3% 아세트산 용액으로 염색하여 γ-PGA의 분자량을 표준 γ-PGA (400 kDa)과 비교하였다.

그 결과, 본 발명에서 파래 파우더를 기질로 바실러스 속 SJ-10 균주로 생산한 γ-PGA의 평균 분자량(MW)은 약 400 kDa인 것으로 나타났다 (도 4).

4-2-2. 아미노산 분석

상기 실시예 4-1에서 SJ-10 균주로 파래 파우더를 발효한 뒤 수득한 γ-PGA 산물을 6N HCl로 100℃에서 6시간 동안 가수분해하였다. 아미노산 함량 및 D,L-글루탐산의 존재 여부를 TLC(thin layer chromatography)를 이용하여 확인하였고, TLC는 Chiralplate (Macherey-Nagel)에서 메탄올-물-아세토나이트릴 (1:1:4, v/v) 이동상으로 수행되었다. 아미노산은 0.2% 닌하이드린(ninhydrin) 아세톤 용액에 감궈서 검출하였다. TLC 이미지는 'imageJ' software (Version 1.6.0, NIH, USA)로 분석하여 거울상이성질체(enantiomeric)의 비율을 측정하였다.

가수분해된 γ-PGA를 TLC로 분석한 결과, 각각 D-글루탐산 (Rf 0.70) 및 L-글루탐산 (Rf 0.74)인 두 개의 위치에 스팟으로 나타나, 가수분해된 γ-PGA이 poly-γ-DL-글루탐산임을 나타냈다 (도 5). ImageJ로 D-글루탐산 및 L-글루탐산의 비율을 확인한 결과, 본 발명의 SJ-10 균주로 파래 파우더를 발효하여 생산한 γ-PGA의 D/L 비율은 약 7:3 (중량비)로 나타났다.

실시예 5. γ-PGA 생산 최적 조건 수립

5-1. One factor at a time 방법을 이용한 최적화

파래 파우더를 기질로 이용한 본 발명의 SJ-10 균주의 γ-PGA 생산 최적 조건을 도출하기 위해, One factor at a time method (Jian et al., 2005)를 이용하여 최적 기질 조성 [파래 파우더 (UP), L-글루탐산(L-glutamic acid) 및 염화나트륨(sodium chloride)의 농도] 및 배양 시간 범위를 확인하였다. 구체적으로, 파래 파우더 (UP) 10 내지 60g/L, L-글루탐산 2 내지 9g/L, 염화나트륨 10 내지 50g/L 및 배양 시간 24 내지 94h을 제외한 조건은 실시예 3과 동일한 조건으로 고정하여 각 인자별 SJ-10 균주의 γ-PGA 생산 최적 조건을 확인하였다.

그 결과, SJ-10 균주의 γ-PGA 수율은 UP, L- 글루탐산 및 염화나트륨의 농도와 배양 시간에 의해 실질적으로 증가되었으며, 최적 조건은 파래 파우더 50g/L, L-글루탐산 5g/L, 염화나트륨 50g/L 및 배양 시간 72h로 나타났다 (도 6).

이를 통해, 각 요인에 대한 γ-PGA 최대 수율의 근사 효과를 확인할 수 있었으며, 이 결과를 이용하여 중심합성계획법(Central Composite Design, CCD) 범위를 설정하였다.

5-2. 중심합성계획법 을 이용한 최적화

상기 결과에 기초하여, γ-PGA 생산 최적화를 위한 파래 분말, 글루탐산 및 염화나트륨의 정확한 최적 농도를 확인하기 위해 CCD 분석이 수행되었다. 구체적으로, CCD의 경우, 상기 실시예 5-1의 결과를 바탕으로 실험 중심점 및 세 인자의 농도 (UP 10 내지 60g/L, L-글루탐산 2 내지 9g/L 및 염화나트륨 10 내지 50g/L)를 설정하고, 2³개의 완전한 요인 설계, 6 축, 6 중심점 (레벨 0)에서 3회 수행되어, 총 20 가지의 조건을 도출하였다. 중심점으로부터 축까지의 거리는 α = 2^n/4 = 1.682 (n = 인자 수, n = 3)로 주어졌다. 최적화를 위해 선택된 독립 변수는 파래 파우더 (UP), L- 글루탐산 및 염화나트륨이며, 회귀 분석은 상기 CCD 분석으로부터 얻어진 데이터를 사용하여 수행되었다. 변수의 부호화는 하기 수학식 2에 따라 이루어졌다. 또한, 독립 변수 및 반응의 효과는 하기 수학식 3으로 계산되었다. 부호값(coded value), 각 인자의 수준 및 실제 값을 포함하는 CCD 매트릭스는 하기 표 1에 나타냈으며, X₁, X₂ 및 X₃는 파래 파우더(UP), L-글루탐산 및 염화나트륨의 부호값이다. 수학적 모델을 결정하기 위해, 2차 다항식 계수를 소프트웨어 패키지 'Design Expert'소프트웨어 (버전 11 Stat-Ease Inc., Minneapolis, USA)를 사용하여 계산하였으며, 예측된 최적점을 얻기 위해 이 방정식을 사용하여 3D 표면 플롯 작업 및 수치 최적화가 수행되었다. 모델 적합성은 ANOVA를 통해 분석되었다.

χ_i: 독립 변수의 무한 값(dimensionless value);

X_i: 독립 변수의 실제 값;

Xcp: 중심점에서 독립 변수의 실제 값; 및

ΔX_i: 변수 i의 무한 값에 대한 단위의 변화량에 해당하는 변수 I의 실제 값의 변화.

Y: 예측 반응;

β₀: 상수;

β_i: 선형 계수;

β_ii: 제곱 계수;

β_ij: 교차곱 계수; 및

k: 인자 수.

그 결과, 2차 회귀 모델의 ANOVA가 유의적인 모델로 나타났다 (P < 0.05) (표 2). 일차 항 X₁ 및 X₂이 γ-PGA 생산에 있어 5% 수준에서 현저한 효과를 가지나, X₃는 유의적이지 않은 것으로 나타났다.

5-3. 이차 모델 방정식 도출

R²로 모델 적합성을 확인한 경우, R² 값은 R²= 0.9820, Adj R² = 0.9657이며, 이는 모델 방정식을 통해 변동 조건의 응답이 설명 가능한 것으로 나타났다. 변수의 분석 후에 얻은 회귀 방정식은 γ-PGA 생산에 대한 파래 파우더, L-글루탐산 및 염화나트륨의 효과로서 나타나며, 부호화된 인자에 대해 얻은 회귀 방정식은 하기 수학식 4와 같다. 하기 방정식은 최적점(optimal point)을 예측하는데 사용되며 등고선 도표로 표시된다.

Y: γ-PGA 수율 (g/L),

X₁, X₂ 및 X₃는 UP, L-glutamic acid 및 sodium chloride의 부호값.

상기 결과로부터 도출된 2차 모델은 RSM을 이용한 본 발명의 모델로 사용되기에 적합하다.

5-4. 3D 표면 플롯(3D surfaceplot) 작성

회귀 방정식을 그래프적으로 나타내 파래 파우더(UP), L- 글루타민산 및 염화나트륨과 γ-PGA 생산 수율 간의 상호 작용을 시각적으로 확인하기 위해, 3D 표면 플롯을 작성하였다 (도 7). 3D 표면 플롯은 세 가지 인자 중 하나를 고정하여 γ-PGA 수율의 다른 두 인자에 대한 결합 효과를 나타내는 방식으로 생성하였으며, 가장 유의적인 상호 관계를 나타낸 그래프를 도 7에 나타냈고, 고정 인자는 중심점 값으로 설정하였다. 구체적으로, 도 7a는 염화나트륨 농도가 45g/L인 경우의 파래 파우더(UP) 및 L- 글루타민산을 나타낸 그래프이고, 도 7b는 L-글루탐산이 7g/L 인 경우 파래 파우더 및 염화나트륨을 나타낸 그래프이며, 도 7c는 파래 파우더가 40g/L일 때 글루타민산 및 염화나트륨을 나타낸 그래프이다. 이를 통해, 도 7a가 가장 높은 곡률을 가지고 있고, 도 7b가 가장 적은 영향을 주는 것을 알 수 있었다.

5-5. γ-PGA 생산 조건 최적화

RSM을 사용하여 얻은 회귀 방정식을 사용하여 숫자 최적화(numeric optimization)를 수행하였다. 경제적인 생산을 위해 수율이 최우선 순위로 설정되었고 γ-PGA 최적 수율 예상값은 파래 파우더 42.1g/L, L-글루탐산 6.8g/L 및 염화나트륨 40.5g/L 조건에서 6.59g/L로 나타났으며, 상기 조건을 이용한 실제 수율은 6.29 ± 0.34g/L로 나타나, 예측 값과 실제 값의 차이 결과는 약 5%로 나타났다.

실시예 6. 종래 방법과의 비용 비교

본 발명의 바실러스 종 SJ-10 균주를 이용하여 기존의 수크로즈(sucrose)를 기질로 사용하여 (30 g/L sucrose,30g/LL-glutamic acid, 30 g/L, sodium chloride, 50 g/L K₂HPO₄, 0.5 g/L MgSO₄·7H₂O, 0.15 g/L, CaCl₂·2H₂O, 0.15 g/L MnSO₄·4H₂O 및 0.04 g/L FeCl₃·7H₂O) γ-PGA (2.92 g/L)를 생산하는데 드는 비용과 본 발명의 파래 파우더를 기질로 사용하여 동일한 양의 γ-PGA를 생산하는데 드는 비용을 비교하였다. 파래 파우더는 소비자 가격으로 적용하였다.

그 결과, 바실러스 종 SJ-10 균주의 기질로 파래 파우더를 사용한 경우 비용이 총 69.94% 감소하는 것으로 나타났다 (표 3).

한국미생물보존센터(국외)

KCCM90078

20080814

Claims

기탁번호 KCCM90078의 바실러스 속 균주로 파래(Ulva sp.)를 포함하는 기질을 발효하는 단계를 포함하는, 폴리감마글루탐산(poly γ-glutamic acid, γ-PGA) 함유 파래 발효 산물의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 파래는 탈염 및 동결건조하여 분쇄한 파래 파우더인, 폴리감마글루탐산 함유 파래 발효 산물의 제조방법.
제 1항에 있어서, 파래 30 내지 60g/L, L-글루탐산 4 내지 10g/L 및 염화나트륨 30 내지 80g/L을 포함하는 기질을 발효하는, 폴리감마글루탐산 함유 파래 발효 산물의 제조방법.
제 1항에 있어서, D-폴리감마글루탐산 및 L-폴리감마글루탐산의 비율이 5:5 내지 9:1인, 폴리감마글루탐산 함유 파래 발효 산물의 제조방법.
제 1항의 제조방법을 통해 수득한, 폴리감마글루탐산 함유 파래 발효 산물.
제 5항의 폴리감마글루탐산 함유 파래 발효 산물을 포함하는 식품 조성물.
제 5항의 폴리감마글루탐산 함유 파래 발효 산물을 포함하는 사료 조성물.
기탁번호 KCCM90078의 바실러스 속 균주로 파래(Ulva sp.)를 포함하는 기질을 발효하는 단계;
발효물로부터 상기 균주를 제거하는 단계;
에탄올과 혼합하여 원심분리하는 단계;
침전물을 증류수에 용해한 뒤 가열하는 단계; 및
탈염하는 단계를 포함하는, 폴리감마글루탐산을 제조하는 방법.
제 8항에 있어서, 기질은 파래 30 내지 60g/L, L-글루탐산 4 내지 10g/L 및 염화나트륨 30 내지 80g/L을 포함하는, 폴리감마글루탐산을 제조하는 방법.
제 8항에 있어서, 폴리감마글루탐산의 D-폴리감마글루탐산 및 L-폴리감마글루탐산의 비율이 5:5 내지 9:1인, 폴리감마글루탐산을 제조하는 방법.