KR100710275B1 - 바실러스속 미생물을 이용한 대두피 또는 흑두피 발효방법,그리고 및 대두피 또는 흑두피 발효물을 함유하는 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 35~55℃, pH 5.5~8.5 및 통성 혐기적인 발효 조건에서, 그리고 대두피 또는 흑두피 0.1~20.0 중량%를 포함하는 배양액 조성 하에서, 바실러스속 미생물을 이용하여 대두피를 액상 발효하여 대두피 발효물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 대두피 또는 흑두피 발효물, 및 이를 함유하는 조성물, 그리고 상기 대두피 또는 흑두피 발효물의 생산성이 우수한 균주로서 신규한 바실러스속 CBI- 720 균주에 관한 것이다.
대두피, 흑두피, 액상 발효, 대두피 발효물, 흑두피 발효물, 바실러스속 ＣＢＩ- 720 균주, 고분자 물질, γ-폴리글루타메이트, 폴리푸룩탄
Description
도 1은 바실러스속(Bacillus sp .) CBI-720 균주의 내생포자형성을 나타내는 현미경 사진이다.
도 2은 대두피 발효물 및 흑두피 발효물의 보습력 시험 결과를 나타내는 그래프이다. (◆, 대조군; ■, 대두피 발효물; △, 대두 발효물; ×, 히알루론산; ◇, 베타글루칸; 및 ●, 흑두피 발효물)
도 3a~3e는 대두피 발효물의 항히스타민 효과를 나타내는 현미경 사진으로서, a는 정상세포, b는 C48/80 처리 15분 후 대조군, c는 C48/80 처리 15분 후 대두피 발효물 처리군, d는 C48/80 처리 30분 후 대조군, e는 C48/80 처리 30분 후 대두피 발효물 처리군이다.
도 3f는 대두피 발효물 및 흑두피 발효물의 항히스타민 효과를 나타내는 그래프이다. (■, 대두피 발효물; ◇, 크로몰린; 및 ●, 흑두피 발효물)
도 4는 대두피 발효물 및 흑두피 발효물의 세포활성화 효과를 나타내는 그래프이다. 도 4a는 각 물질 첨가에 따른 인간 각질형성세포의 생육도를 NR assay를 통하여 측정한 것이며, 도 4b는 각 물질 첨가에 따른 인간 각질형성세포의 대사활성도를 MTT assay를 통하여 측정한 것이다. (◆, 대조군; ■, 대두피 발효물; ◇, 셀플러스; 및 ●, 흑두피 발효물)
본 발명은 바실러스속( Bacillus sp .) 미생물을 이용한 대두피 또는 흑두피 발효방법, 대두피 또는 흑두피 발효물을 함유하는 조성물, 그리고 대두피 또는 흑두피 발효물의 생산성이 우수한 균주로서 신규한 바실러스속 CBI- 720 균주에 관한 것이다.
청국장 및 낫도(natto)는 대표적인 발효식품으로 고초균에 의해 대두를 발효하여 생산한다. 균체와 함께 더불어 식용하면 위염 및 장염 등에 효과가 있으며, 실제로 위염 등에는 발효대두의 고분자 물질이 효능을 나타내는 것이라고 알려져 있다(Yuhobika, March 1998; Mainichi News morning edition, July 25, 1994).
대두 발효시 생산되는 고분자 물질은 γ-폴리글루타메이트(γ-polyglutamate)와 폴리푸룩탄(polyfructan) 등 크게 두 가지로 나눌 수 있다. γ-폴리글루타메이트는 보습, 항염증 및 세포활성화 기능을 하는 것으로 알려져 있기 때문에 화장품 원료로서 사용될 수 있으며, 의약산업에서는 택솔(taxol) 등 함암제와 함께 사용하면 약제의 효과를 높여주기 때문에 매우 유용한 고분자 물질이라 할 수 있다. 폴리푸룩탄은 γ-폴리글루타메이트와 함께 존재하면서 보습 및 항염증 등 의 기능을 증폭시키는 역할을 한다. 레반(levan)이라는 미생물성 폴리푸룩탄은 다이어트용 식이섬유로써 인체에 섭취되었을 때, 포만감을 주어 식욕을 억제할 수 있으며, 장내에서 유해 세균의 증식을 억제하고 유산균의 증식에 도움을 준다고 보고되는 등 (Journal of Applied Microbiology, 92. 5, p958-963) 화장품 및 식품업계에서 각광 받는 고분자 물질로 사용되고 있다.
현재까지 대두피를 발효하여 산업에 이용하고자 한 예로는 한국특허등록 제0003751호(농산폐기물을 이용한 발효사료의 제조방법) 등이 있으나, 대두피에 관련된 기술은 사료분야에 국한되어왔다.
또한, 대두를 이용한 화장품 원료에 관련된 기술로는, 대두를 비피도박테리움(Bifidobacterium)으로 발효하여 감마-아미노부틸산과 식물성 에스트로젠을 강화한 한국특허등록 제0451631호, 그리고 피부외용제에 관한 한국특허공개 제2001-0083876호 및 제2003-0061447호 등이 있다.
일반적인 대두 발효로 대두단백 또는 대두분말을 액상에서 발효하는 경우가 있다. 이에 의해 고분자 물질을 분해하여 펩타이드를 생산함으로써 항암효과 등을 나타내는 기능성 식품을 제공하는 것이다. 또한, 상기 경우에서의 액상 발효는 발효 온도, pH, 산소 요구성 및 배양액의 조성 등이 본 발명과 완전히 상이하다.
그리고, 청국장 또는 낫도 등 기존의 대두 발효법으로 고분자 물질을 생산하는 경우에는 대두를 수화시켜, 삶은 후 고체발효법으로 물질을 생산한다. 고체발효의 경우, 균체의 증식과 함께 균체가 이동하면서 발효를 진행할 수 없기 때문에 종자(seed) 접종을 매우 많이 하여야 하며, 그렇지 못할 경우 국한된 부분에서만 발 효가 진행되기 때문에 발효 생산성이 낮다는 문제점이 있다. 또한, 고체 발효의 경우 생산된 고분자 물질을 추출하는 과정이 필요하다는 문제점이 있다.
또한, 화장품 산업에서는 γ-폴리글루타메이트 및 폴리푸룩탄이 주성분인 발효대두 추출물을 사용하고 있으나, 그 독특한 냄새로 인한 거부감과 추출물 제조 시 작은 입자들이 많아져서 여러 단계의 제거공정이 필요하기 때문에 가격이 비싸다는 단점이 있다.
흑두피와 관련하여 그 발효법 및 상품화된 발효물은 현재 보고되어 있지 않았으므로 비교 또는 단점을 거론할 수 없으나 대두피와 마찬가지로 흑두피 또한 그의 발효법이 개발되고 그 발효물의 효능이 확인된다면 충분히 산업적 이용가능성이 있다고 기대된다.
본 발명은 상기한 바와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명자들은 이전까지 보고된 바 없는 대두피 및 흑두피의 액상 발효를 시도하여 생산성이 우수하고 특별한 추출과정이 필요없는 대두피 및 흑두피 발효법을 제공하는 데 목적이 있다.
또한, 본 발명의 목적은 그러한 대두피 또는 흑두피 발효법을 이용한 대두피 또는 흑두피 발효물의 제공에 있으며, 상기 대두피 또는 흑두피 발효물을 함유하는 화장료 조성물, 피부 외용제 조성물 및 식품을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 대두피 또는 흑두피 발효물의 생산성이 우수한 신규한 바실러스속 미생물 균주를 제공하는 데 있다.
본 발명은 바실러스속(Bacillus sp .) 미생물을 이용한 대두피 또는 흑두피 발효방법, 대두피 또는 흑두피 발효물, 및 이를 함유하는 조성물, 그리고 상기 대두피 또는 흑두피 발효물의 생산성이 우수한 균주로서 신규한 바실러스속 CBI- 720 균주에 관한 것이다.
상세하게는, 본 발명의 첫번째 태양은,
35~55℃, pH 5.5~8.5 및 통성 혐기적인 발효 조건에서, 그리고 대두피 또는 흑두피 0.1~20.0 중량%를 포함하는 배양액 조성 하에서, 바실러스속 미생물을 이용하여 대두피 또는 흑두피를 액상 발효하여 대두피 또는 흑두피 발효물을 생산하기 위한 대두피 발효방법에 관한 것이다.
본 발명의 대두피 또는 흑두피 발효방법은 바람직하게는,
40~47℃, pH 6~7.5 및 0.001~0.15 vvm의 통성 혐기적인 발효 조건에서, 그리고 대두피 1~5 중량%를 포함하고, 추가로 글루코오스 및 수크로오스로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 성분을 0.01~10.0 중량%를 포함하는 배양액 조성 하에서 이루어질 수 있다.
본 발명의 대두피 또는 흑두피 발효방법에서,
배양액 조성은 추가로 글루타메이트 0.01~10.0 중량%, 인산수소이나트륨 0.01~10.0 중량%, 인산이수소나트륨 0.01~10.0 중량%, MgCl2 0.001~1.0 중량%, 그리 고 ZnSO4 0.001~1.0 mM 을 포함할 수 있다.
본 발명의 대두피 또는 흑두피 발효방법은 그의 대두피 또는 흑두피 발효물이 γ-폴리글루타메이트 또는 폴리푸룩탄을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 대두피 또는 흑두피 발효방법에서 상기 바실러스속 미생물은 바람직하게는 고초균, 더욱 바람직하게는 바실러스속 CBI-720 균주 (KCCM 10619)이다.
본 발명의 또 다른 태양은,
대두피 또는 흑두피 발효물 생산성이 우수한 신규한 균주인 바실러스속 CBI-720 균주 (KCCM 10619)에 관한 것이다.
그리고, 본 발명의 또 다른 태양은,
본 발명의 대두피 또는 흑두피 발효방법으로 생산되는 대두피 또는 흑두피 발효물에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 태양은,
본 발명의 대두피 또는 흑두피 발효물을 함유하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 상기 대두피 또는 흑두피 발효물 0.1~20.0 중량%를 유효성분으로 포함하는 것이 바람직하며,
보습, 피부세포의 대사활성화, 항알러지 또는 아토피성 피부염 개선을 위한 화장료 조성물로서 이용할 수 있으며,
또한, 세포재생 또는 아토피성 피부염 개선을 위한 피부외용제 조성물로서 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 보습기능 뿐만아니라 간지러움 및 알러지 등 피부 부작용이 심한 사람들에게 나타나는 증상의 하나인 비만세포의 히스타민 방출을 억제하는 기능, 세포의 대사를 활성도를 증가시켜 상처회복 기간을 단축시키는 기능, 아토피성 피부염의 악화를 방지하는 등 환부를 개선시켜주는 기능을 나타내므로 건강보조식품의 조성물로서 사용될 수 있다.
또한, 대두피 또는 흑두피 발효물에 존재하는 폴리푸룩탄(레반)은 인체의 소화기관에서 분해되기 어려운 구조이기 때문에 본 발명의 조성물은 다이어트 식품으로 사용할 수 있다.
본 발명의 바실러스속 CBI-720 균주의 균학적 특성은 다음과 같다.
바실러스속 CBI-720 균주는 그람양성의 미생물이며, 내생포자 형성능이 있고, 장간균(rod shape)의 형태를 가지고 있다. 도 1은 바실러스속 CBI-720 균주의 내생포자형성 확인을 위한 현미경 사진이다. 또한, 호기적 또는 통성혐기적인 조건에서 생육이 가능하지만 혐기적인 조건에서는 생육이 불가능하며, 내생포자 형성능이 있고, 카탈라아제 생산 및 카제인과 젤라틴, 전분 분해능 등의 특징을 가지고 있다. 생육조건으로는 7% NaCl 농도에서 생육이 가능하며, 발효 조건인 약 45℃에서 생육하고, 약 pH 5.0~7.5에서 생육한다. 또한, 글루코오스, 아라비노오스, 크실 로오스, 만니톨을 이용하여 산을 생성할 수 있다.
상기 특징들을 고려할 때, 바실러스속 CBI-720 균주는 바실러스속 미생물에 해당한다고 판단되어, 상기 균주를 바실러스속(Bacillus sp.) CBI-720 균주로 명명하였다.
바실러스속 CBI-720 균주는 다음의 기관에 기탁되어 있다.
대한민국 서울특별시 서대문구 홍제1동 361-221 유림빌딩 우편번호 120-091
한국미생물보존센터(Korea culture center of microorganisms: KCCM)
기탁번호 KCCM-10619
기탁일 2004년 11월 18일
본 발명자들은 대두 발효물 및 흑두 발효물에서 γ-폴리글루타메이트와 폴리푸룩탄 등의 고분자 물질은 대두 또는 흑두의 껍질(대두피 또는 흑두피)부분에 존재하므로 반드시 대두 또는 흑두 전체를 발효하지 않아도 고분자 물질의 생산이 가능하다는 것을 본 발명을 통해 확인하였다. 따라서, 사료 첨가물 또는 폐기물로 인식되어지는 대두피 또는 흑두피를 발효원료로 사용하여 새로운 대두 또는 흑두 추출물로 개발한다면, 생산원가를 절감할 수 있을 뿐만 아니라 부가가치가 낮은 산업에 이용되거나 오히려 폐기물로써 처리되어질 대두피 또는 흑두피를 가공하여 고부가 가치의 물질인 γ-폴리글루타메이트와 폴리푸룩탄 등을 생산할 수 있다.
또한, 상기 대두피 또는 흑두피 발효 고분자 물질은 항염증, 보습 및 세포활 성화 효능으로 인해 아토피 또는 건선 치료제로서의 효능을 극대화할 수 있는 물질로서 사용될 수 있다. 발효대두 추출물을 아토피성 피부염 환부의 개선효과를 갖는 화장료로 사용한 경우는 한국특허등록 제0431076호 등에서 찾아 볼 수 있으며, γ-폴리글루타메이트 등의 고분자 물질이 보습, 항염증 및 세포활성화를 나타내는 바 대두피 또는 흑두피 발효를 통해 생산되는 고분자 물질을 포함하는 화장료 조성물에서 그 효능을 기대할 수 있다. 따라서, 대두피 또는 흑두피를 발효하여 고분자 물질을 생산하는 기술은 식품, 화장품 및 의약품 산업에서 매우 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명자들이 개발한 대두피 또는 흑두피 발효법은 저렴한 대두피 또는 흑두피를 이용하였기 때문에 생산원가의 절감뿐만 아니라, 대두피 또는 흑두피를 액상에서 발효하기 때문에 균체가 탄소원 및 질소원을 만날 수 있는 가능성을 높여주어 보다 발효를 활발하게 진행할 수 있다. 따라서, 본 발명의 발효법을 이용한 고분자 물질의 생산성은 고체발효법으로 생산되는 고분자 물질의 생산성보다 약 3~5배 더 높다. 또한, 고체발효의 경우 생산된 고분자 물질을 추출하는 과정이 필요하지만, 본 발명의 발효법을 통하여 생산된 고분자 물질의 경우에는 특별한 추출과정이 필요없으므로 산업적으로 매우 유용한 발효법이라 할 수 있다.
본 발명에 의해 대두 또는 흑두 가격의 1/20~1/17 인 대두피 또는 흑두피를 탄소원 및 질소원으로 사용하여 상기 고분자 물질을 생산할 수 있고, 제조공정을 단순화할 수 있으며, 대두 또는 흑두 발효 시 생성되는 탈탄산현상으로 생성된 아민에 의한 악취를 상당히 제거할 수 있다. 또한, 발효액을 균체와 침전물제거 후 그대로 사용할 수 있으므로 대두피 또는 흑두피 발효를 통한 고분자 물질의 생산성은 대두 또는 흑두 발효를 통한 생산성의 100 배 이상의 효과를 나타낼 수 있다. 이러한 발효법으로 생산되는 대두피 또는 흑두피 발효물은 뛰어난 보습력, 항염증 및 세포활성화 효능을 나타내므로 식품, 화장품 및 의약 산업에서 효과적으로 사용될 수 있다. 특히 간지러움 및 알러지 등 피부 부작용이 심한 사람들에게 나타나는 증상의 하나인 비만세포의 히스타민 방출을 억제하는 기능을 한다. 또한, 세포의 대사를 활성도를 증가시켜 상처회복 기간을 단축시킬 수 있으며, 아토피성 피부염의 악화를 방지하는 등 환부를 개선 시켜주는 기능을 한다. 따라서, 본 발명은 화장품 산업뿐만 아니라 의약품 산업, 그리고 다이어트 및 건강식품 등의 식품 산업에서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명에 의해 볏짚으로부터 분리된 바실러스속(Bacillus sp.) 미생물을 대두피 또는 흑두피 배양액에 접종하고, 고분자 물질 중 특히 γ-폴리글루타메이트 또는 폴리푸룩탄 등을 최대로 생산할 수 있는 최적화된 조건으로 발효할 수 있는 방법이 제공된다. 상기 바실러스속 미생물은 바람직하게는 고초균, 더욱 바람직하게는 바실러스속 CBI-720 균주이다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예를 통해 더욱 상세히 기술하고자 한다. 다만, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 구체적으로 설명하는 것으로서, 하기 실시예 및 실험예에 의해 본 발명의 범위가 제한되지는 않는다.
본 발명자들은 먼저 대두피 또는 흑두피 발효를 위한 조건을 최적화하기 위하여 하기의 여러 가지 실험을 실시하였다.
실험예
1. 발효온도, pH,
산소요구성
등 발효 조건 최적화 연구
1-ⅰ) 원리
고초균은 매우 다양하고 복잡한 대사과정을 가지고 있으며, 온도 및 초기 pH에 따라 미생물의 생육 뿐만 아니라 대사과정이 달라질 수 있다. 또한, 발효과정 중의 pH는 미생물의 산소 소비와 맞물려 pH를 크게 변화시켜 주면서 당을 소비하고 산을 생성시키는 대사과정으로 진행될 수 있다.
미생물은 당과 질소원을 소비하면서 생성되는 구성단위 물질을 중합하거나, 배양액에 존재하는 구성단위의 물질을 중합시켜 고분자 물질을 생산하게 되는데, 고분자 물질을 최대로 생산하는 대사과정은 산의 생성을 최대한 낮게 유지시켜서 pH의 변화를 적게 해주는 대사과정이다. 예를 들면, 대두피 발효를 통하여 생산하고자 하는 γ-폴리글루타메이트는 구성단위가 글루탐산(Glutamic acid)인데, 이는 미생물이 글루코오스를 섭취하였을 때 진행될 수 있는 시트르산 회로(citric acid cycle) 중 중간체인 α-케토글루타레이트에 NH2 기가 결합되어 생성되는 글루탐산이 구성단위이다. 그런데, 산소의 소비량이 많아지면 고초균은 α-케토글루타레이트를 생산하지 않고, 계속해서 시트르산 회로를 진행시켜 많은 산을 생성하도록 하여, 에너지(ATP)를 생산하면서 균체를 증가시키는 과정으로 진행하게 되고, pH는 급격하게 낮아져서 약 pH 4.9 까지 떨어진다. 그 결과 고분자 물질의 생산성은 극히 낮아진다. 따라서, 발효온도, pH 및 산소량은 발효 조건에서 있어서 매우 중요한 인자라고 할 수 있다.
1-ⅱ) 실험방법
㉠ 발효 온도 최적화
고초균의 생육가능 온도는 약 25~50℃이다. 그리고, 일반적으로 알려진 청국장 혹은 낫도의 발효온도는 약 42~45℃이다. 따라서, 본 발명자들은 최적의 온도 조건을 조사하기 위하여, 27~50℃까지를 6 단계, 즉 27℃, 32℃, 37℃, 42℃, 47℃, 그리고 50℃로 나누고 균주선발용 배지(대두피 2%, 글루코오스 0.5%, 나머지는 멸균 정제수, pH 7.0)에서 각각 약 72 시간동안 배양한 후 고분자 물질의 생산성 을 확인하였다. 고분자 물질의 생산성 확인은 60% 아세톤 침전법을 사용하였다.
㉡ 발효 pH 최적화
고초균의 생육가능 pH는 pH 3.5~8.0 이다. 일반적으로 알려진 청국장 혹은 낫도의 발효 pH는 약 pH 6.0~7.0 이다. 이에 본 발명자들은 최적 초발 pH를 찾기 위하여 균주선발용 배지(대두피 2%, 글루코오스 0.5%, 나머지는 멸균 정제수)를 pH 5.0~8.0 까지를 7 단계, 즉 pH 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 그리고 8.0으로 각 각 제조하여 47℃에서 각각 약 72 시간 동안 배양한 후 고분자 물질의 생산성을 확인하였다. 고분자 물질의 생산성 확인은 60% 아세톤 침전법을 사용하였다.
㉢ 발효 시의 산소 요구성
고초균은 호기적인 조건과 통성 혐기적인 조건에서 생육이 가능하다. 일반적으로 알려진 청국장 혹은 낫도의 산소조건은 절대 혐기적인 조건은 아니지만 매우 혐기적인 조건에서 진행된다. 따라서, 본 발명자들은 산소조건을 혐기적 조건, 통성혐기적 조건, 그리고 호기적인 조건에서 대두피 발효시험을 실시하였다.
발효를 진행할 때 적합한 산소 조건을 찾고자 균주선발용 배지(대두피 2%, 글루코오스 0.5%, 나머지는 멸균 정제수, pH 7.0)에서 혐기적인 조건, 통성 혐기적인 조건, 호기적인 조건으로 47℃에서 각각 약 72 시간 동안 배양한 후 고분자 물질의 생산성을 확인하였다. 통성혐기적 조건의 산소 통기량(volumetric air flow rate: volume of air/volume of media/min(vvm))은 0.001~0.15 vvm이 바람직하고, 여기서는 0.013 vvm으로 하여 실험하였다. 호기성 조건의 산소 통기량은 0.65 vvm으로 하였다. 이때 발효조에 유입되는 산소의 양은 발효양을 고려하여 계산한 값이다. 고분자 물질의 생산성 확인은 60% 아세톤 침전법을 사용하였다.
1-ⅲ) 결과 및 고찰
㉠ 발효 온도 최적화
결과를 하기 표 1에 나타내었다.
| 온도(℃) | 27 | 32 | 37 | 42 | 47 | 50 |
| 생산성(mg/mL) | 1.3 | 4.0 | 6.7 | 12.5 | 13.8 | 10.1 |
상기 표 1을 보면, 47℃에서 가장 높은 고분자 물질이 생산되었다는 것을 알 수 있다. 대두피 발효는 미생물이 프로테아제 등의 단백질 가수분해효소의 생산이 최대일 때 최적의 조건이 될 것이라 예상되며, 일반적으로 고초균이 생산하는 단백질 가수분해효소는 45~50℃에서 높은 활성을 나타내므로 실험 결과 얻어진 최적 온도 47℃는 이론적으로도 일치하는 결과라고 할 수 있다.
㉡ 발효 pH 최적화
결과를 하기 표 2에 나타내었다.
| pH | 5.0 | 5.5 | 6.0 | 6.5 | 7.0 | 7.5 | 8.0 |
| 생산성(mg/mL) | 0 | 0 | 1.7 | 3.2 | 13.8 | 7.3 | 4.1 |
상기 표 2를 보면, 시험결과 예상했던 것보다 고초균에 의한 대두피 발효는 pH의 영향을 많이 받음을 알 수 있었다. 특히 pH 5.0~6.0 에서 미생물의 생육이 전혀 이루어지지 않은 것은 아니었으나 고분자 물질의 생산은 거의 이루어지지 않았고, pH 7.0 에서는 다른 영역에서보다 특히 고분자 물질의 생산성이 높은 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 대두피 발효에서 pH의 조절은 매우 중요한 인자임을 확인하였다.
상기 결과를 토대로 대두피 발효 시에는 pH 7.0, 0.1 M 인산염 완충용액(나트륨염)에 대두피 2%와 글루코오스 0.5%를 첨가하여 발효를 진행하였다. 그 결과, 약 21.5 mg/mL의 고분자 물질을 얻을 수 있었으며, 이는 인산염 완충용액을 사용하지 않은 결과의 156%에 해당하는 양이었다.
상기 결과를 토대로 하여 볼 때, 대두피 발효에 있어서 pH의 조절은 매우 중요하며, 발효조에서 생산할 때 pH를 효율적으로 조절하면 높은 수율로 고분자 물질을 생산할 수 있다고 판단된다. 한편, 대두피 발효시 첨가하여 준 인산염 완충용액은 완충능력이 우수하며, 나트륨염이기 때문에 γ-폴리글루타메이트에 존재하는 (-) 전하를 보완해주는 기능을 한다. 인산염 완충용액 뿐만 아니라 pH 조건이 맞는 다른 완충용액을 사용하여도 대두피 발효에서 좋은 영향을 줄 수 있다. 따라서, 본 발명의 대두피 발효에서 완충용액은 특별히 제한되는 것은 아니지만, 인산염 완충용액, 예를 들면 인산수소이나트륨(disodium hydrogenphosphate), 인산이수소나트륨 (sodium dihydrogenphosphate)이 바람직하다.
㉢ 발효 시의 산소 요구성
결과를 하기 표 3에 나타내었다.
| 조건 | 혐기적 | 통성혐기적 | 호기적 |
| 생산성(mg/mL) | 0 | 13.8 | 1.1 |
대두피 발효의 산소조건은 예상했던 것처럼 통성혐기적인 조건에서 최적으로 나타났으며, 혐기적인 조건에서는 미생물의 생육이 불가능하여 물질생산 뿐만 아니라 균체의 증식도 이루어지지 않았다. 또한, 호기적인 조건에서 미생물의 증식은 매우 활발하게 일어났고, 생산된 단백질분해효소 등의 영향으로 대두피의 분해가 가장 많이 이루어졌으나 물질 생산은 거의 이루어지지 않았으며 생산된 물질도 점성이 없고 뚜렷한 특징이 없는 저분자량의 물질이었다. 따라서, 고분자 물질의 생산을 위한 대두피 발효는 통성혐기적인 조건에서 이루어져야 한다는 것을 확인하였다.
실험예
2. 당 첨가에 따른 고분자 물질의 생산성 변화에 관한 연구
2-ⅰ) 원리
대두피 발효는 대두피를 이용하여 고분자 물질을 생산하는 것이기 때문에 당을 반드시 필요로 하지는 않는다. 그러나, 미생물은 본격적인 발효를 시작하기 위하여 유도기를 거치는데 이러한 기간에 특정 당을 첨가하면 이후의 발효 기간동안 목적하는 물질을 더 많이 얻을 수 있다. 그것은 유도기 동안 배지에 존재하는 특정 물질에 미생물이 반응하여 다른 물질보다도 특정 물질을 처리하는데 이용되는 효소를 더욱 많이 생산하는 양상을 나타내기 때문이다.
대두피 발효 시에는 γ-글루타메이트와 폴리푸룩탄 등의 고분자 물질이 동시에 생산된다. 상기 폴리푸룩탄은 γ-폴리글루타메이트의 보습력 및 그 밖의 여러 효과를 촉진시켜주는 역할을 하므로, γ-폴리글루타메이트와 함께 폴리푸룩탄을 과량 생산하면 그 만큼 좋은 효과를 나타낼 수 있다.
폴리푸룩탄은 6탄당인 푸룩토오스(fructose)가 구성단위인 고분자 물질이며, 푸룩토실트랜스퍼라아제(fructosyltransferase)에 의해 생산된다. 일반적으로 미생물이 생산하는 체외효소인 트랜스퍼라아제류의 효소는 글루코오스와 푸룩토오스의 결합으로 이루어져 있는 수크로오스가 존재할 때, 그 결합을 끊을 때 발생하는 에너지를 이용하여 분해된 글루코오스 또는 푸룩토오스를 결합시키면서 고분자 물질을 생합성한다. 따라서, 대두피 발효 시 생성되는 폴리푸룩탄의 합성을 촉진시키기 위해서는 대두피 발효 배지를 제조할 때 수크로오스를 첨가하여 푸룩토실트랜스퍼라아제의 과생산을 유도할 필요가 있다.
한편, γ-폴리글루타메이트는 글루탐산의 COOH 기와 NH2 기의 펩타이드 결합으로 긴 사슬구조를 형성하고 있다. 또한, 폴리푸룩탄은 구성단위인 푸룩토오스가 β-(2,6) 결합과 β-(1,2) 결합을 형성하고 있는 다당체이다. 대두피 발효시 생성되는 고분자 물질은 크게 이러한 두 가지 물질로 구성되어 있으며, 두 물질을 물리적으로 간단히 분리하는 것은 매우 어렵다.
성분분석 시 물질을 분리하기 어려울 때에는 일부 물질을 분해시켜 제거하면서 잔존하는 물질의 건조중량을 측정하는 방법으로 성분 비율을 결정하기도 한다. 이에 본 발명자들은 상기 두 물질을 분리하지 않고, 그 중 한 물질을 분해시키는 방법을 택하였다.
폴리푸룩탄을 분해시킬 수 있는 효소는 자연계에서 매우 드물다. 따라서, 펩타이드 결합을 하고 있는 γ-폴리글루타메이트를 펩티다아제(peptidase)를 사용하여 제거하는 것이 유리하다고 판단하였다. 펩티다아제를 사용하여 γ-폴리글루타메이트의 펩타이드 결합을 분해시켜서 제거한 후 용액에 존재하는 물질은 폴리푸룩탄일 것으로 가정하였고, 잔존하는 고분자 물질을 침전법으로 분리하여 건조중량을 측정하였으며, 동량의 펩티다아제 무처리군의 고분자 물질을 침전법으로 분리하여 건조중량을 비교하였다. 이러한 과정을 통하여 간접적으로 γ-폴리글루타메이트와 폴리푸룩탄의 비율을 측정하고자 하였다. 예를 들어, 만약 5 mL에 총 고분자 물질이 200 mg이 존재하는데, 펩티다아제를 사용하여 γ-폴리글루타메이트를 분해시킨 후 침전법으로 고분자 물질을 분리하였을 때, 상기 고분자 물질의 양이 100 mg이 존재했다면 γ-폴리글루타메이트와 폴리푸룩탄의 양은 모두 100 mg이 된다.
2-ⅱ) 실험방법
대두피 발효 시 글루코오스와 수크로오스를 하기 표 7의 최적화된 배지에 각각 첨가하여 고분자 물질을 생산한 후 아세톤 침전법으로 고분자 물질을 각각 분리하였다. 펩티다아제는 pH 7.0, 37℃에서 반응하여 펩타이드 결합을 분해시키므로 각각 분리된 고분자 물질을 pH 7.0, 0.1 M 인산염완충용액에 용해시킨 후 펩티다아제를 첨가하여 약 18 시간동안 반응시켰다. 반응 후 아세톤 침전법으로 용액 중의 고분자 물질을 분리시켰으며, 건조중량을 측정하여 펩타이드분해효소 무처리군의 건조중량과 비교하였다.
2-ⅲ) 결과 및 고찰
펩티다아제와 약 18 시간동안 반응시킴으로 γ-폴리글루타메이트는 모두 분해되었다고 판단되며, 이러한 가정 하에 대두피 발효를 통하여 생산된 고분자 물질 중 γ-폴리글루타메이트와 폴리푸룩탄의 비율을 계산하여 하기 표 4에 나타내었다.
| γ-폴리글루타메이트 | 폴리푸룩탄 | 총량 | |
| 수크로오스 첨가군 | 19.8(49.4%) | 20.3(50.6%) | 40.1 |
| 글루코오스 첨가군 | 17.2(63.0%) | 10.1(37.0%) | 27.3 |
결과적으로 전체적인 고분자 물질의 생산량은 수크로오스를 첨가하였을 때 약 47% 증가하였다. 그러나, 수크로오스를 첨가하여 발효하였을 때보다 글루코오스를 첨가하여 발효한 경우 γ-폴리글루타메이트의 비율이 상대적으로 증가하였다. 이와 같은 결과는 당의 첨가에 따라 미생물이 특정 효소의 발현을 촉진할 것이라는 예상과 정확하게 일치하는 결과이었다. 따라서, 향후 대두피 발효를 통하여 고분자 물질을 생산할 때 목적에 따라 물질의 비율을 발효수준에서 조절할 수 있다고 판단된다. 예를 들면, 의약용 또는 식품용으로 생산할 경우 γ-폴리글루타메이트의 약리적 성질을 고려하여 고분자 물질을 생산할 경우에는 글루코오스를 첨가하여 생산하는 것이 유리할 것이다. 반면, 전반적인 고분자 물질의 생산량을 비교할 때 화장품 조성물의 원료로 이용하기 위해서는 수크로오스를 첨가하여 발효하는 것이 효율적일 것이다.
실험예
3. 대두피 발효 미생물의 분리
3-ⅰ) 연구방법
선별된 균주인 바실러스속 CBI-720 균주의 대두피 발효능을 다른 바실러스속 미생물들의 발효능과 비교하기 위하여, 총 13 종의 균주들을 동일한 조건에서 반응시킨 후 각각 생산된 고분자 물질의 양을 비교하였다. SK-31, KU-63 및 BSFT는 본 발명자들이 보유하고 있는 고초균 균주들이고, 그 외 C1, C2, C3, C4, N1, B2, B3, B4 그리고 B5 균주들은 청국장, 낫도, 볏짚 등에서 분리한 고초균 균주들이다.
총 13 종의 바실러스속 미생물 균주를 하기 표 7의 최적화된 배지에 접종하고, 47℃에서 72 시간동안 배양한 후 각 발효액을 원심분리하였다. 그리고, 여과필터(pore size 0.2 ㎛)로 제균한 후 아세톤 침전(최종 아세톤농도 70%)시켜 고분자 물질을 회수하였으며 그 중량비를 비교하여 각 고분자 물질의 생산성을 확인하였다.
3-ⅱ) 결과 및 고찰
실험결과 바실러스속 CBI-720의 고분자 물질 생산성이 다른 미생물들 보다 가장 높았으며, 대두피를 분해시키는 능력도 가장 높았다. 이를 하기 표 5에 나타내었다.
| 미생물들의 명칭 | 건조중량(mg/mL) |
| SK-31 | 3.5 |
| KU-63 | 6.0 |
| BSFT | 9.3 |
| C1 | 8.2 |
| C2 | 7.0 |
| C3 | 6.4 |
| C4 | 7.9 |
| N1 | 6.4 |
| Bacillus sp. CBI-720 | 40.1 |
| B2 | 3.9 |
| B3 | 4.6 |
| B4 | 5.9 |
| B5 | 7.3 |
상기 실험예 1 내지 3의 결과를 토대로 최적화된 대두피 발효 조건을 하기의 표 6에 나타내었다. 아울러 흑두피에 대해서도 동일한 실험을 실시하여 대두피와 동일한 발효조건에서 최적의 발효가 달성될 수 있음을 확인하여 하기 표에 함께 나타내었다.
| 대두피 또는 흑두피 | 0.1~20.0 중량% |
| 인산수소이나트륨 (disodium hydrogenphosphate) | 0.01~10.0 중량% |
| 인산이수소나트륨 (sodium dihydrogenphosphate) | 0.01~10.0 중량% |
| 글루코오스(또는 수크로오스) | 0.01~10.0 중량% |
| 글루타메이트 | 0.01~10.0 중량% |
| MgCl2 | 0.001~1.0 중량% |
| ZnSO4 | 0.001~1.0 mM |
| 멸균 정제수 | 나머지 |
| 35~55℃, pH 6.0~8.0, 통성 혐기적 조건 | |
실시예
1.
바실러스속
CBI
-720 균주의 분리, 대두피 발효 및 그
발효물의
정제
본 발명자들은 볏짚으로부터 50 여종 미생물을 분리하였으며, 바실러스속 미생물 중 대두피를 발효하여 고분자 물질을 많이 생산하는 능력을 시험하여 1 종의 균주를 선별하였고, 이를 바실러스속 CBI-720 균주로 명명하였다.
본 발명의 발효과정은 바실러스속 미생물을 이용하여 이루어질 수 있으나, 바람직하게는 상기 바실러스속 CBI-720 균주를 이용한다. 하기의 발효과정에서는 바실러스속 CBI-720 균주를 이용하였다.
본 발명자들은 50 여종의 미생물을 분리하여 대두피의 발효능을 시험하였다. 그 결과 기존의 청국장 또는 낫도에서 분리한 균주 및 공지 균주의 대두피 발효를 통해서는 약 9.3 mg/mL의 고분자 물질을 생산하였으나, 본 발명의 균주를 이용하였을 때에는 약 430% 이상 향상된 수율의 고분자 물질을 생산할 수 있었다. 따라서, 바실러스속 CBI-720 균주는 대두피를 발효하여 고분자 물질을 생산함에 있어서 탁월한 능력을 갖추었다고 사료되는 바 신균주로 등록하였다.
본 발명자들은 표 7의 배양액 조건 하에서 발효를 진행하여 최적화된 대두피 발효 조건 중 하나를 선택하였다.
| 대두피 (또는 흑두피) | 3.0 중량% |
| 인산수소이나트륨 (disodium hydrogenphosphate) | 1.63 중량% |
| 인산이수소나트륨 (sodium dihydrogenphosphate) | 0.913 중량% |
| 글루코오스(또는 수크로오스) | 0.5 중량% |
| 글루타메이트 | 0.5 중량% |
| MgCl2 | 0.02 중량% |
| ZnSO4 | 20.0 μM |
| 멸균 정제수 | 나머지 |
| 47℃, pH 7.0, 통성 혐기적 조건(0.013 vvm) | |
대두피 발효에서는 생산하고자 하는 목적물질에 따라 생산조건이 달라진다. 즉, γ-폴리글루타메이트를 위주로 고분자 물질을 생산할 경우에는 글루코오스를 첨가한 배양액에서 48 시간 동안 정치 배양한 후 나머지 24 시간 동안 약 100 rpm으로 진탕 배양하며, 수크로오스를 첨가한 배양액에서는 72 시간 동안 정치배양하여 물질을 생산한다. γ-폴리글루타메이트의 단위물질은 글루코오스 대사의 시트르산 회로 시 생성되는 α-케토글루타레이트가 글루타메이트 신타아제(glutamate synthase)에 의해 아미노화되어 생성되는 글루타메이트로 구성되어 있으며, 이는 바실러스속 미생물의 대사를 통하여 생성된 글루타메이트를 긴 사슬로 만들기도 하고, 외부에 존재하는 글루타메이트를 사슬로 만들기도 한다. 상기 두 가지의 경우 모두 고분자 물질로 합성될 때는 균체의 세포벽에 부착되어 있는 γ-글루타밀트랜스펩티다아제에 의해 만들어지므로, 종자 배양 시 미량의 글루타메이트를 배양액에 첨가하여 효소생성을 유도해야만 한다.
대두피 발효를 통한 물질의 생산에 있어서 생산되는 고분자 물질 중 다당체와 γ-폴리글루타메이트의 비율은 글루코오스와 수크로오스 등의 탄소원으로 조절할 수 있다. 대두피 발효 시 γ-폴리글루타메이트의 비율을 높이고자 할 때는 글루코오스를 첨가하여 발효를 진행하고, 다른 고분자 물질의 비율을 높이고자 할 때는 수크로오스를 첨가하여 발효를 진행시킨다. 이는 대두피 발효를 효율적으로 제어할 수 있는 키 인자(key factor)로서 활용된다.
발효 후 연속원심분리를 통하여 입자가 큰 고형분과 큰 미생물 펠릿(pellet) 을 제거하고, 1 차로 공극 크기(pore size) 2 ㎛의 필터로 여과한 후, 2 차로 공극 크기 0.2 ㎛의 필터로 여과하여 제균한다. 제균한 배양 상등액을 화장료 조성물의 원료로 그대로 사용하였다.
실시예
2.
흑두피
발효 및 그
발효물의
정제
실시예 1의 대두피 발효에 이용한 기술을 동일하게 사용하여 흑두피를 발효한 결과 대두피의 발효에 적용한 기술이 그대로 흑두피에도 적용가능함을 확인하여 본 발명에 따르는 흑두피 발효 방법을 완성하고 그 발효물을 얻었다. 배지성분도 대두피를 흑두피로 대체한 것 이외에 동일하게 조성되었다. 흑두피에는 식물성 유사 여성호르몬 및 플라보노이드 등 여러 가지 유용한 물질을 내포하기 때문에 화장품 및 식품 산업에서 갖는 중요성은 더욱 크다고 할 수 있다. 본 발명자들은 표 7의 배양액 조건 하에서 발효를 진행하여 대두피 및 흑두피 발효조건을 최적화하였다. 발효 과정 및 후처리 과정 모두를 대두피 발효물과 동일한 방법으로 실시하였다.
실시예
3. 대두피
발효물을
함유하는 조성물의 제조
상기 실시예 1의 대두피 발효물을 0.01~10.0 중량% 함유하고 약제학적으로 허용 가능한 부가물을 첨가하여 피부보호용 조성물을 제조하였다.
(1) 제조예 1: 대두피 발효물의 화장료 조성물 제조예
하기의 표 8과 같은 조성 성분으로 구성되는 화장료 조성물과 대조군으로 대두피 발효물을 첨가하지 않고 증류수를 첨가한 조성물을 제형화하였다. 표 8의 (가)는 수용성이고, (나)는 지용성이다.
| 성분 | 조성 1 | 조성 2 | 조성 3 | |
| 가 | 에탄올 실시예 1의 발효물 글리세린 1,3-부틸렌글리콜 멸균 정제수 | 5.0 1.0 4.0 4.0 67.5 | 5.0 5.0 4.0 4.0 63.5 | 5.0 10.0 4.0 4.0 53.5 |
| 나 | 에탄올 세틸알코올 밀납 와세린 스쿠알렌 디메틸폴리실록산 POE(10)모노올레인산 에스테르 글리세롤 모노스테아린산 에스테르 방부제 향료 색소 | 5.0 1.0 0.5 2.0 6.0 2.0 1.0 1.0 적량 적량 적량 | 5.0 1.0 0.5 2.0 6.0 2.0 1.0 1.0 적량 적량 적량 | 5.0 1.0 0.5 2.0 6.0 2.0 1.0 1.0 적량 적량 적량 |
(2) 제조예 2: 대두피 발효물의 피부외용제 조성물 제조예
하기의 표 9와 같은 조성 성분으로 구성되고 국소사용을 위해 적합한 피부외용제 조성물을 제형화하였다.
| 성 분 | 조성 1 | 조성 2 | 조성 3 |
| 실시예 1의 발효물 에탄올 글리세롤 프로필렌 글리콜 4000 레시친 POE(20)-솔비탄모노스테아레이트 글리세롤 모노스테아린산 에스테르 염화나트륨 방부제 멸균 정제수 | 5.0 5.0 10.0 5.0 0.5 1.0 1.0 적량 적량 72.5 | 10.0 5.0 10.0 5.0 0.5 1.0 1.0 적량 적량 67.5 | 20.0 5.0 10.0 5.0 0.5 1.0 1.0 적량 적량 57.5 |
(3) 제조예 3: 대두피 발효물의 식품 조성물 제조예
하기의 표 10과 같은 조성 성분으로 구성되고 음료식 건강보조식품을 위해 적합한 식품 조성물을 제조하였다.
| 성 분 | 조성 1 | 조성 2 | 조성 3 |
| 실시예 1의 발효물 사이클로덱스트린 소량 첨가물 정제수 천연방부제 | 50 2 3 45 적량 | 75 2 3 20 적량 | 95 2 3 - 적량 |
실시예
4.
흑두피
발효물을
함유하는 조성물의 제조
상기 실시예 2의 흑두피 발효물을 0.01~10.0 중량% 함유하고 약제학적으로 허용 가능한 부가물을 첨가하여 피부보호용 조성물을 제조하였다.
(1) 제조예 1: 흑두피 발효물의 화장료 조성물 제조예
대두피 발효물 대신에 실시예 2의 흑두피 발효물을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 3의 제조예 1과 동일한 방법으로 흑두피 발효물을 함유하는 화장료 조성물을 제조하였다.
(2) 제조예 2: 흑두피 발효물의 피부외용제 조성물 제조예
대두피 발효물 대신에 실시예 2의 흑두피 발효물을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 3의 제조예 2와 동일한 방법으로 흑두피 발효물을 함유하는 피부외용제 조성물을 제조하였다.
(3) 제조예 3: 흑두피 발효물의 식품 조성물 제조예
대두피 발효물 대신에 실시예 2의 흑두피 발효물을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 3의 제조예 3과 동일한 방법으로 흑두피 발효물을 함유하는 식품 조성물을 제조하였다.
실험예
4.
발효물의
생산성 측정
실험예
4-1. 대두피
발효물의
생산성 측정
대두피 발효물을 정제하여 중량 측정 및 분석에 이용하고자 생산하였다. 이경우에는 상기 실시예 1에 명시된 방법으로 고분자 물질을 생산한 후 제균된 배양 상등액과 에탄올을 1:1.5의 부피비로 첨가하고, 1N HCl로 약 pH 2.0으로 보정한 후 서서히 교반하여 침전물을 회수하고, 이를 재용해 함으로써 1 차 정제하였다. 더욱 정제하고자 할 때는, 4℃에서 분자량(MW) 10 kDa의 막 포대(membrane bag)를 이용한 투석(dialysis)법으로 저분자량의 물질을 제거하여 얻었다. 분리된 물질 용액의 부피와 동일한 부피의 증류수를 첨가하여 고분자 물질의 점도를 낮춘 후 동결건조하여 건조중량을 측정하였으며, 정제 초기의 배양액 부피에 대하여 고분자 물질의 건조중량을 계산하여 생산성을 결정하였다.
[실험결과]
수크로오스를 첨가한 배양액에서 발효된 고분자 물질을 투석법을 통하여 정제하고, 동결건조하여 생산성을 측정한 결과, 대두피 발효를 통하여 생산되는 총 고분자 물질의 농도는 약 40.1 mg/mL 로 이러한 방법으로 1 L를 발효하면 40.1 g의 고분자 물질을 얻을 수 있다. 그러나 글루코오스를 첨가하여 발효를 진행하게 되면, 총 고분자 물질은 27.3 g/L 생산된다. 이러한 결과는 바실러스속 CBI-720 균주가 대두피를 발효할 때 첨가되어지는 당의 종류에 따라 생산되는 고분자 물질의 생성비율을 달리하는 것이라고 생각된다. 수크로오스 첨가시 생성되는 고분자 물질은 γ-폴리글루타메이트가 약 6.1 mg/mL 농도로 생산되고, 폴리푸룩탄은 약 34 mg/mL이 생산된다(γ-폴리글루타메이트:폴리푸룩탄 = 1:5.6). 그러나, 글루코오스 첨가 시 생성되는 고분자 물질은 γ-폴리글루타메이트의 비율이 매우 증가되어 11.3 mg/mL이 생산되고, 폴리푸룩탄은 약 16 mg/mL이 생산되었다. 이는 상기에서 설명한 것처럼 발효시 첨가되는 당에 의해 발효의 진행과정을 조절할 수 있다는 것을 입증하는 결과이다.
본 발명에서처럼 대두피를 발효하여 γ-폴리글루타메이트를 생산하는 것은 아니지만, Magarita K. 등의 보고에 따르면 2% 글루코오스를 함유한 배양액 조건에서 고초균 발효에 의한 γ-폴리글루타메이트 생산성은 1.9 mg/mL이라고 보고되어 있으며 (Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67, 2, p1004~1007), Markus P. 등에 의한 보고에 따르면 고초균의 변이주를 통하여 생산성을 4.8 mg/mL까지 높일 수 있었다고 보고되어 있다 ( Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67, 2, p617~ 622). 따라서, 상기 두 보고에서보다 본 발명에 의해 대두피를 발효함으로써 γ-폴리글루타메이트의 생산성이 매우 높아졌다는 것을 알 수 있다.
또한, 본 발명에서는 대두 발효시 나타나는 자극적인 냄새가 거의 나타나지 않기 때문에 발효액 자체를 그대로 원료로 사용할 수 있다. 대두피 가격이 대두 가격의 약 1/20이고, 대두 발효 후 물질분리에 소요되는 원심분리, 여과, 침전 및 회수 등 여러 단계의 공정을 연속원심분리 또는 여과의 단계로 줄일 수 있기 때문에 대두피 발효를 통한 물질생산 비용은 대두 발효를 통한 생산비용의 약 1/100로 줄일 수 있다. 따라서, 본 발명의 대두피 발효를 통한 물질생산에 대한 생산성은 매우 뛰어나다고 할 수 있다.
실험예
4-2.
흑두피
발효물의
생산성 측정
흑두피 발효물의 생산성 측정은 에탄올 추출 후 재용해 및 투석(dialysis)법을 사용하였으며, 자세한 방법은 대두피 발효물의 생산성 측정 방법과 동일하게 실시하였다.
[실험결과]
흑두피 발효 시 수크로오스를 첨가한 경우 생산된 고분자물질의 건조중량은 약 29.7.g/L이며, γ-폴리글루타메이트와 폴리푸룩탄의 비율은 약 1.0:3.8이었고, 대두피 발효물과 마찬가지로 2종의 고분자물질이 생산되는 것을 확인하였다. 또 흑두피 발효 시 글루코오스를 첨가한 경우에는 약 22.1g/L의 고분자물질이 생산되며, γ-폴리글루타메이트와 폴리푸룩탄의 비율은 약 1.0:2.3이었다. 흑두피 발효 시 대두피 발효와 비교하여 다소 생산성이 떨어지는 것으로 나타났으며 그 이유는 콩의 종류에 따른 껍질 성분의 차이에 기인하는 것으로 생각된다. 그러나 산업적으로 이용하는 데는 충분한 생산성을 나타냈으며 더구나 흑두피 발효물의 경우 흑두피에 존재하는 유용성 물질의 부가적인 효능을 기대하기 때문에 이후의 효능평가 시험을 실시하여 그 효능을 확인하였다.
실험예
5.
발효물의
보습력
시험
실험예
5-1. 대두피
발효물의
보습력
시험
대두피 발효물은 좋은 물성을 갖고 있으며, 피부 친화력을 갖고 있어서 피부도포 시 이질감이 거의 없다. 또한, 보습력이 있어서 화장품 원료로 이용될 가능성이 매우 크다. 보습력의 측정은 25℃, 습도 55%의 항온·항습실에서 측정하였고, 피부수분 측정기(Corneometer) CM 825(독일 Courage + Khazaka 사)를 사용하여 인체의 피부에 도포 한 후, 1 분 간격으로 10 분 동안 연속적으로 측정하였으며, 각 시료의 측정시간 당 피부에 도포된 부위를 6 회 이상 측정한 값을 평균하여 결과로 산출하였다.
음성 대조군으로 증류수를 사용하였으며, 비교실험 물질(양성 대조군)로는 대두 발효 추출물과, 0.3% 히알루론산나트륨(sodium hyaluronate), 0.5% 베타글루칸을 사용하였다. 대두피 발효물은 상기 실시예 1에서 제조된 용액 상태의 물질을 약 10%로 희석하여 사용했으므로 약 0.4%의 농도이며, 그 결과는 도 2에 나타내었다.
[실험결과]
도 2에 나타난 것처럼 대두피 발효물은 상기 대조군들 중에서 가장 높은 보습력을 나타내었으며, 대두 발효 추출물, 히알루론산나트륨, 베타글루칸의 순으로 보습력이 점점 낮아짐을 확인하였다. 대두피 발효물의 경우 대두 발효 추출물보다 높은 보습력을 나타내는데, 이는 대두피 발효물의 경우 글루코오스(또는 수크로오스) 첨가에 의한 미생물의 당 발효로 인해 고분자 물질이 더 많이 생산되었기 때문이라고 판단된다.
실험예
5-2.
흑두피
발효물의
보습력
시험
흑두피 발효물의 보습력 시험은 항온항습실에서 피부수분 측정기 (Corneometer CM 825, 독일Courage + Khazaka 사)를 이용하여 실시하였으며, 자세한 방법은 대두피 발효물의 생산성 측정 방법과 동일하게 실시하였다.
[시험결과]
도 2에서 흑두피 발효물의 보습력은 대두피 발효물보다 약간 낮은 것을 볼 수 있다. 이는 흑두피를 발효할 때 생산되는 고분자물질의 함량이 낮은 것에 기인한 것이라고 생각된다. 그러나, 일반적으로 보습제로 알려져 있는 베타글루칸이나 히알루론산, 그리고 대두 발효물과 비교하여서는 유사하거나 보다 우수한 양상을 나타내었다.
실험예
6.
발효물의
항염증(항히스타민) 시험
실험예
6-1. 대두피
발효물의
항히스타민 활성 유무 확인
음전하를 띠고 있는 고분자 물질은 자극을 받은 비만세포(mast cell)의 히스타민 방출을 억제할 수 있다는 보고(George Chiang et al, The Journal of Urology, Dec., 164, 2000, p2119~2125)에 착안하여, 잔기에 의해 음전하를 나타내는 대두피 발효 추출물의 항 히스타민 효과를 관찰하고자 하였다. 현미경 관찰법으로 대조군과 비교함을 통하여 항 히스타민 효과를 확인하였으며, 그 결과는 도 3a~3e과 같다. 대조군으로는 항 히스타민제로 잘 알려진 1% 크로몰린나트륨(sodium cromolyn)을 사용하였으며, C48/80을 자극물질(stimulator)로 사용하여 비만세포의 활성화(activation)를 유도하였다.
[시험결과]
정상적인 상태인 비만세포의 형태는 매끈하게 둥근 형태를 나타내며, 면역반응시 나타나는 울퉁불퉁한 모습을 거의 나타내지 않는다. 그러나, C48/80을 처리하고 15 분이 경과하면 비만세포는 울퉁불퉁하게 뿔이 난 형태를 나타내게 되고, 30분이 경과하면 본래의 형태를 알아볼 수 없게 되고, 세포가 터지면서 히스타민이 방출된다. 비만세포의 표면이 울퉁불퉁하게 되는 것은 C48/80으로부터 자극을 받은 비만세포의 세포막에서 여러 신호전달물질이 분비되고 세포막의 안정성이 떨어지면서 세포막 표면이 불안정해지기 때문에 발생하는 현상이다. 따라서, 세포의 표면이 C48/80 처리 후 얼마나 본래의 형태를 유지하는 가를 확인하는 것도 물질의 효능을 가늠할 수 있는 잣대가 될 수 있다. 대조군과 반대로 대두피 발효물 처리군의 비만세포의 모양은 15분 후까지는 거의 변화를 확인할 수 없었으며, 30분 후에도 일부 세포들이 히스타민을 방출하면서 세포막이 터진 것을 제외하면 정상적인 상태의 비만세포의 형태와 매우 유사함을 확인할 수 있었다. 따라서, 대두피 발효물은 항 히스타민(항 알러지)의 기능을 할 수 있는 가능성이 있는 물질이라 판단된다.
실험예
6-2. 대두피
발효물
및
흑두피
발효물의
항히스타민 활성 시험
비만세포의 히스타민 분비는 세포의 형태변화와 관계있는 바, 도 3에서는 비만세포의 탈과립현상을 관찰하여 세포의 히스타민 분비 여부를 판정하였고, 추가로 실시한 시험에서는 대두피 발효물 및 크로몰린, 그리고 흑두피 발효물의 항히스타민 효능을 세포로부터 분비되는 히스타민을 정량하여 판정하고자 하였다. 히스타민 정량 kit(Oxford Biomedical Research사)는 경쟁적인 항원항체반응 원리를 이용한 제품이며, 비만세포의 히스타민 분비 유도과정은 대두피 발효물의 항히스타민 시험법과 동일하게 실시한 후 상등액으로부터 분비된 히스타민을 정량하였다. 대조군과 비교한 히스타민 분비 저해율(%, histamine-release inhibition rate)을 도 3f 나타내었다.
[실험결과]
도 3f의 결과에서 도 3a~3e의 결과를 재차 확인할 수 있었으며, 더 나아가 흑두피 발효물의 항히스타민 효능은 대두피 발효물보다 높은 것을 확인할 수 있었다. 각 물질의 항히스타민 효능을 ED50 (50% Effective doses)값으로 비교할 때, 크로몰린의 ED50 값은 1.0mg/ml이상이며, 대두피 발효물은 약 0.06mg/ml이다. 그러나 흑두피 발효물의 ED50 값은 0.031mg/ml 이하로 약 0.01mg/ml로 추정한다. 따라서 흑두피 발효물은 대두피 발효물보다 고분자물질 생산성은 낮지만 효능적인 면에서는 더 우수한 효능을 갖는 다고 할 수 있다. 이러한 효능은 흑두피에 존재하는 플라보노이드 및 식물성 유사 호르몬 등 여러 가지 유용성 물질에 기인된 효능이라고 생각하며, 대두피 발효물이 갖는 장점을 대부분 갖으면서 더 높은 효능을 나타내는 제품으로 이용할 수 있는 흑두피 발효물의 장점이라고 평가한다.
실험예
7.
발효물의
세포활성화 시험
실험예
7-1. 대두피
발효물의
세포활성화 시험
세포의 활성화의 개념은 획일적으로 정의될 수 없을 정도로 광범위한 의미를 갖고 있다. 그러나, 대두피 발효물을 적용함에 있어서 세포의 활성화란 상처부위 혹은 피부의 약한 곳에 존재하는 세포가 피부를 재생시키는 등 세포 본래의 형태와 기능을 갖출 수 있도록 어떤 기능을 부여하여 주거나, 세포의 대사 활성도를 높여주는 현상을 말한다. 따라서, 본 발명의 세포 활성화 시험은 각질형성 세포 배양 시 대두피 발효물을 첨가한 후 세포의 대사활성도의 증가여부를 측정함으로 확인하였다. 더 나아가 실시예 2의 제조예 2에서 제조된 대두피 발효물 함유 피부 외용제를 깊지 않은 상처의 환자 및 아토피성 피부염 환자의 환부에 도포한 후 환부의 개선정도를 확인하여 그 효능을 평가하고자 하였다.
세포의 활성도는 세포의 증식도와 관련되어 있으므로 세포 증식율을 NR(뉴트럴 레드: Neutral Red) assay로 시험하였으며, 세포의 대사활성도는 MTT(3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]2,5-디페닐 테트라졸리움 브로마이드) assay로 측정하였다. 또한, 실시예 2의 제조예 2에서 제조된 대두피 발효물 함유 피부 외용제를 깊지 않은 상처를 갖고 있는 환자 30명에게 처방한 후 환부의 치료기간의 단축여부를 조사하였으며, 가렵고 상처가 나타나는 아토피성 피부염 환자 12명의 환부에 약 30일간 1일 3회 도포한 후 그 개선정도를 5단계의 기준을 근거로 평가하여 아토피성 피부염의 개선정도를 판단하였다.
[실험결과]
대두피 발효물의 세포 대사 활성화 시험 결과는 도 4에 나타내었다. 시료는 최고 0.5%부터 단계적으로 희석하여 시험하였으며, 음성 대조군은 증류수를 첨가하였으며, 양성 대조군은 시판되고 있는 바이오랜드 사의 셀플러스를 같은 농도로 첨가하여 결과를 비교하였다.
도 4a는 대두피 발효물의 농도에 따른 세포 증식도를 NR assay 로 측정한 결과를 나타내며, 이는 MTT assay 에 의한 결과가 단순히 세포 수의 증가에 기인한 것이 아니라는 것을 나타내고 있다. 양성 대조군의 경우 저농도에서 세포 수가 증가하였고, 도 4b는 대두피 발효물의 대사 활성도를 MTT assay 로 측정한 결과를 나타내며, 상기 결과에서도 저농도에서 세포활성도가 증가하였다. 따라서, 이는 세포 수의 증가에 의해 높아지는 결과라고 할 수 있으며, 양성 대조군의 경우 매우 좁은 영역에서 세포 활성도 증가효과를 나타낸다. 그러나, 대두피 발효물의 경우 세포수는 오히려 음성 대조군보다 낮거나 같지만 넓은 영역에서 높은 대사활성도를 나타내고 있다. 따라서, 대두피 발효물은 비교적 높은 세포 활성화 효능을 갖고 있다고 할 수 있다.
또한, 깊지 않은 상처에 대해 실시예 2의 제조예 2에서 제조된 대두피 발효물 함유 피부 외용제에 대한 세포 활성화 효능시험의 결과는 하기 표 11에 나타내었다. 깊지 않은 상처이기 때문에 상처가 아물고 덧나지 않게 되는 시간은 총 7일 안에 이루어지므로 7일간 1일 2회 도포하였다. 결과적으로 대두피 발효물을 첨가한 피부 외용제를 환부에 도포한 환자의 약 73%(11명)이 3일 이내에 상처가 치유되는 효과를 볼 수 있었으나, 대조군의 경우 4일 동안 도포하였을 때 약 60%(9명)의 환자가 치료완료 되었고, 5일 동안 도포하였을 때 약 73%(11명)이 치유되었다. 따라서, 대두피 발효물은 피부의 세포를 활성화하여 상처의 치유를 도울 수 있는 효능이 있다고 결론지을 수 있었다.
또한, 가렵고 상처가 나타나는 정도의 아토피성 피부염 환부의 개선도 시험 결과는 하기 표 12과 같은 결과를 나타내었다. 환부의 아토피성 피부염 상태는 A(전혀 증상이 나타나지 않음), B(피부가 붉어지고 가벼운 가려움증), C(매우 가렵고 쌀알 같은 돌기형성), D(매우 가렵고 통증을 느끼며 상처), E(통증을 느끼며 진물이 남)의 기준으로 판단하였다. 환자 12명은 모두 D의 상태일 때부터 시험을 시작하였으며, 실시예 2의 제조예 1의 화장료 조성물과 제조예 2의 피부 외용제 조성물을 각각 1 일당 3 회씩 30 일 동안 환부에 도포하였다. 결과적으로 대두피 발효물을 함유한 피부 외용제는 환부의 상태가 더 이상 악화되는 것을 막아주는 효과를 나타내었으나, 아토피성 피부염이 나타나는 환부를 치료하지는 못하였다. 그러나, 대부분의 환부가 개선되어 피부의 상태가 양호해진 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 대조군의 경우 대부분 오히려 환부의 상태가 악화되거나 초기의 상태를 유지하고 있었다. 따라서, 본 발명의 대두피 발효물은 아토피성 피부염 환자의 피부 상태를 양호하게 개선해 주고, 적어도 환부의 악화를 방지하는 기능을 할 수 있는 물질로서, 아토피성 피부염 환자를 위한 화장료 또는 피부 외용제에 첨가되어 환부를 개선하는 기능을 할 수 있다.
| 외용제 도포기간 | 완치된 환자의 수(총 30명) | |
| 제조예 2 (15명) | 대조군(15명) | |
| 1일 | 0 | 0 |
| 2일 | 4 | 1 |
| 3일 | 7 | 3 |
| 4일 | 3 | 5 |
| 5일 | 1 | 2 |
| 6일 | 0 | 3 |
| 7일 | 0 | 1 |
| 외용제 도포기간 | 환자의 수(총 12명) | |
| 제조예 2(6명) | 대조군(6명) | |
| A | 0 | 0 |
| B | 2 | 1 |
| C | 3 | 1 |
| D | 1 | 2 |
| E | 0 | 2 |
실험예
7-2.
흑두피
발효물의
세포활성화 시험
흑두피 발효물의 세포활성화 시험은 세포 증식도와 세포 대사활성도를 측정하였으며, 자세한 방법은 대두피 발효물의 세포 활성화 시험방법과 동일하게 실시하였다.
[시험결과]
도 4에는 대두피 발효물과 흑두피 발효물의 세포활성화 효능을 나타내었으며, 가장 높은 효능을 나타내는 농도에서 흑두피 발효물의 효능은 대두피 발효물의 효능보다 약 45.7% 더 높은 세포활성화 효능을 나타내었다. 이러한 현상은 항히스타민 효능 시험과 매우 유사한 결과이며, 발효 시 흑두피의 성분이 추출되어 나타나는 현상이라고 생각된다. 흑두피 발효물의 세포증식도 및 세포활성도는 대두피 발효물의 결과들과 매우 유사한 패턴을 나타낸다. 그러나 도4b에서 흑두피 발효물의 세포활성도는 대두피 발효물보다 더 높고 폭 넓은 농도 영역에서 나타난다. 따라서 흑두피 발효물의 세포활성화 효능은 대두피 발효물보다 높을 가능성이 많다고 판단한다.
상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 대두피 발효물 및 흑두피 발효물은 다른 유사한 제품과 비교할 때 낮은 생산단가 및 높은 생산성, 그리고 악취제거의 측면에서 산업적으로 매우 큰 의의를 갖고 있다. 또한, 상기 대두피 발효물 또는 흑두피 발효물을 함유하는 화장료 조성물과 피부 외용제 조성물은 뛰어난 보습력을 나타내며, 간지러움 및 알러지 등 피부 부작용이 심한 사람들에게 나타나는 증상의 하나인 비만세포의 히스타민 방출을 억제하는 기능을 한다. 또한, 세포의 대사를 활성도를 증가시켜 상처회복 기간을 단축시킬 수 있으며, 아토피성 피부염의 악화를 방지하는 등 환부를 개선시켜주는 기능을 한다. 따라서, 본 발명은 화장품 산업 뿐만 아니라 의약품 산업, 그리고 다이어트 및 건강식품 등의 식품 산업에서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
Claims (16)
- 35~55℃, pH 5.5~8.5 및 통성 혐기적인 발효 조건에서, 그리고 대두피 또는 흑두피 0.1~20.0 중량%를 포함하는 배양액 조성 하에서, 바실러스속 미생물을 이용하여 대두피 또는 흑두피를 액상 발효하여 대두피 또는 흑두피 발효물을 생산하기 위한 대두피 또는 흑두피 발효 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 발효 조건이 40~47℃, pH 6~7.5 및 0.001~0.15 vvm의 통성 혐기적인 발효 조건이며, 상기 배양액이 대두피 또는 흑두피 1~5 중량%를 포함하고, 추가로 글루코오스 및 수크로오스로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 성분을 0.01~10.0 중량% 포함하는 것인 대두피 또는 흑두피 발효 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배양액이 추가로 글루타메이트 0.01~10.0 중량%, 인산수소이나트륨 0.01~10.0 중량%, 인산이수소나트륨 0.01~10.0 중량%, MgCl2 0.001~1.0 중량%, 그리고 ZnSO4 0.001~1.0 mM 을 포함하는 것을 특징으로 하는 대두피 또는 흑두피 발효 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 대두피 또는 흑두피 발효물이 γ-폴리글루타메이트 또는 폴리푸룩탄을 포함하는 것을 특징으로 하는 대두피 또는 흑두피 발효 방 법.
- 제3항에 있어서, 대두피 또는 흑두피 발효물이 γ-폴리글루타메이트 또는 폴리푸룩탄을 포함하는 것을 특징으로 하는 대두피 또는 흑두피 발효 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 바실러스속 미생물이 바실러스속 CBI-720 균주(KCCM 10619)인 것을 특징으로 하는 대두피 또는 흑두피 발효 방법.
- 제3항에 있어서, 바실러스속 미생물이 바실러스속 CBI-720 균주(KCCM 10619)인 것을 특징으로 하는 대두피 또는 흑두피 발효 방법.
- 바실러스속 CBI-720 균주 (KCCM 10619).
- 제1항 또는 제2항의 방법에 의해 생산되는 흑두피 발효물.
- 제3항의 방법에 의해 생산되는 흑두피 발효물.
- 제9항의 흑두피 발효물 0.1~20.0 중량%를 유효성분으로 포함하는 보습, 피부세포의 대사활성화, 항알러지 또는 아토피성 피부염 개선을 위한 화장료 조성물.
- 제10항의 흑두피 발효물 0.1~20.0 중량%를 유효성분으로 포함하는 보습, 피부세포의 대사활성화, 항알러지 또는 아토피성 피부염 개선을 위한 화장료 조성물.
- 제9항의 흑두피 발효물 0.1~20.0 중량%를 유효성분으로 포함하는 세포재생 또는 아토피성 피부염 개선을 위한 피부외용제 조성물.
- 제10항의 흑두피 발효물 0.1~20.0 중량%를 유효성분으로 포함하는 세포재생 또는 아토피성 피부염 개선을 위한 피부외용제 조성물.
- 제9항의 흑두피 발효물을 포함하는 다이어트용 또는 건강보조용 식품 조성물.
- 제10항의 흑두피 발효물을 포함하는 다이어트용 또는 건강보조용 식품 조성물.
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