JP6523579B2 - 乳酸菌の菌体外多糖及びその用途 - Google Patents
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Description
本発明の菌体外多糖は、N−アセチルグルコサミンがα-1,6結合により連結した構造を有する中性多糖が好ましく、この中性多糖はヒアルロニダーゼ阻害活性を有する。
また、本発明の菌体外多糖は、主としてグルコースとマンノースから構成される酸性多糖が好ましく、この酸性多糖はヒアルロニダーゼ阻害活性を有する。
本発明の菌体外多糖を産生する乳酸菌は、Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株(受託番号NITE BP-02242)又はそれと同等の乳酸菌株が好ましい。
本発明の菌体外多糖を産生する乳酸菌は、イチジク由来の乳酸菌であってラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)に属する乳酸菌の培養物から得られる多糖体をイオン交換クロマトグラフィーによって分離精製して得ることができる。より具体的には、(1) イチジク由来の乳酸菌であってラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)に属する乳酸菌の培養物から遠心分離により菌体を除去する工程;(2) 工程(1)で得られた培養物から、エタノール又はアセトンによる沈殿によって多糖体及びタンパク質を沈殿として回収する工程;(3) 回収した沈殿からタンパク質を除去して菌体外多糖体を回収する工程;及び(4) 回収された菌体外多糖体を陰イオン交換クロマトグラフィーにより分離精製する工程によって得ることができる。
組成物は飲食品組成物が好ましく、飲食品としては、機能性食品、発酵食品、飲料又はサプリメントが好ましい。また、この組成物は医薬組成物が好ましい。また、この組成物は飼料組成物及び化粧品組成物が好ましい。
これらの組成物は、好ましくは、ヒアルロニダーゼ阻害又は抗アレルギーのために使用される。
1.本発明の乳酸菌
本発明の菌体外多糖を産生する乳酸菌は、イチジク由来の乳酸菌であってラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)に属する乳酸菌である。この乳酸菌はイチジクの葉・茎・果実などから分離することができる。本発明の菌体外多糖を産生する乳酸菌は、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)に属する乳酸菌であって、特に特定の菌株に限定されない。
この中性多糖は、後述する実施例4に記載するように、Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株の培養物から得られる多糖体を陰イオン交換クロマトグラフィーによって分離精製することにより得ることができる。この中性多糖は、図3に示すプロトン-NMR及びカーボン-NMRのNMRプロファイルから、N−アセチルグルコサミンがα-1,6結合により連結した構造を有することが明らかとなった。また、Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株は、主としてグルコースとマンノースから構成される酸性多糖を菌体外に分泌する。より具体的には、酸性多糖は、グルコース、マンノース、ガラクトース及びラムノースから構成され、それらの組成比は、おおよそ10:170:2:1である。
これらの中性多糖及び酸性多糖は、後述する実施例4に記載するように、ヒアルロン酸を加水分解する酵素であるヒアルロニダーゼを阻害する活性を示す。
これらの同等の乳酸菌は、例えば、Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株に対して突然変異、遺伝子組換え等の通常の変異処理技術を行うことによって得ることができ、また、Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株の自然変異株の選択等によって育種された菌株であってもよい。
本発明の乳酸菌は、後述する実施例4に記載するLactobacillus paracasei IJH-SONE68株と同様にして、イチジクから取得することができる。
本発明の菌体外多糖は、上述したイチジク由来の乳酸菌であってLactobacillus paracaseiに属する乳酸菌を、上述した方法によって培養し、例えば、その培養物から得られる多糖体をイオン交換クロマトグラフィーによって分離精製することにより得ることができる。
より具体的には、例えば、(1) 遠心分離により培養液物から菌体を除去する工程;(2) 工程(1)で得られた培養物から、エタノール又はアセトンによる沈殿によって多糖体及びタンパク質を沈殿として回収する工程;(3) 回収した沈殿からタンパク質を除去して菌体外多糖体を回収する工程;及び(4) 回収された菌体外多糖体を陰イオン交換クロマトグラフィーにより分離精製する工程によって、本発明の菌体外多糖を得ることができる。
また、これらの工程(1)〜(4)は適宜必要に応じて、それぞれを複数回実施しても、あるいは一部を省略することもできる。また、さらに、必要に応じて、透析やゲルろ過、限外ろ過などを組み合わせることもできる。このようにして得られた菌体外多糖は、必要に応じて凍結乾燥などの追加操作を加えることもできる。
本発明の菌体外多糖は、ヒアルロン酸を加水分解する酵素であるヒアルロニダーゼを阻害する活性を示す。本発明の菌体外多糖は、飲食品組成物、医薬組成物、飼料組成物、化粧品組成物などの各種の組成物の有効成分として広く用いることができる。例えば、ヒアルロニダーゼ阻害用、抗アレルギー用などの飲食品組成物、医薬組成物、飼料組成物、化粧品組成物の有効成分として用いることができる。
本発明の医薬組成物の剤形は特に制限されず、具体的には、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、貼付剤、点眼剤、及び点鼻剤等を例示できる。製剤化にあたっては、製剤担体として通常使用される賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、界面活性剤、又は注射剤用溶剤等の添加剤を使用することができる。
本発明の医薬組成物の投与時期は特に限定されず、適用対象に応じて、適宜投与時期を選択することができる。また、予防的に投与してもよく、健康維持に用いてもよい。投与形態は製剤形態、投与対象の年齢、性別、その他の条件、投与対象の症状の程度等に応じて適宜決定されることが好ましい。本発明の医薬組成物は、いずれの場合も1日1回又は複数回に分けて投与することができ、また、数日又は数週間に1回の投与としてもよい。
本発明の医薬組成物は、例えば、投与対象のアレルギーを低減化させるために用いることができる。
本発明の菌体外多糖を含む飲食品組成物は、抗アレルギー効果や抗アルコール傷害効果を利用する種々の用途に用いることができる。
具体的には、本発明の飲食品に係る商品又は商品の包装に上記用途を表示することが例示でき、特に包装、容器、カタログ、パンフレット、POP等の販売現場における宣伝材、その他の書類等への表示が好ましい。また、表示としては、例えば、健康食品、機能性食品、経腸栄養食品、特別用途食品、栄養機能食品、医薬用部外品、特定保健用食品等を例示することができる。
本発明の菌体外多糖、それを産生する乳酸菌の培養物等を含む飼料組成物は、例えば、抗アレルギー効果を利用する種々の用途に用いることができる。
本発明の菌体外多糖、それを産生する乳酸菌の培養物等を含む化粧品組成物は、例えば、抗アレルギー効果を利用する種々の用途に用いることができる。
乳酸菌の分離及び同定
1. 乳酸菌サンプルの分離
イチジク(品種「とよみつ姫」)の葉、茎、および果実を選択し、殺菌済みピンセットとハサミを用いて2〜3 mmに細断片化した後、滅菌済のMRS液体培地入りの試験管に5〜6個ずつの細片を入れ、28℃および37℃にて、乳酸菌の標準培地であるMRS培地が濁る (増殖する) まで静置培養した。ちなみに、乳酸菌候補株の増殖が目視できるまでに2〜4日間を要した。
上記乳酸菌候補株の各培養液の一部をMRS寒天培地上にディスポーザブルループで線画塗菌後、静置培養を行った。寒天培地上に形成されたコロニーのうち、「色、つや、形状の異なるもの」を全てピックアップし、フレッシュなMRS寒天培地上に線画塗菌を行い、コロニーを純化した。
純化された各コロニーに対し、カタラーゼ酵素の産生の有無を検証するため、H2O2テストを行った。これは、10%のH2O2溶液に菌体を曝した際に起こる、カタラーゼが存在すれば生成する酸素の発生の有無を観察する試験法である。ちなみに、乳酸菌はカタラーゼを産生しない。
イチジクからの探索分離を試みた結果、イチジクの葉を分離源としたものから、カタラーゼ陰性を示す乳酸菌候補株を1株得ることができた。
上記乳酸菌候補株をMRS液体培地で改めて培養し、遠心により菌体を取得した。細胞壁溶解酵素で処理した後, DNAzol試薬を使用し、ゲノムDNAを抽出した。
Lane, D. J. (1991). 16S/23S rRNA sequencing. In Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics、pp. 115-175. Edited by E. Stackebrandt & M. Goodfellow. Chichester : Wileyに記載された方法に従って、ゲノムDNAを鋳型として、27fプライマー(5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')(配列表の配列番号1)および1525rプライマー(5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3')(配列表の配列番号2)を用いたPCR反応により16S rDNA部分を増幅させ、NucleoSpin Gel and PCR Clean-up kit(マッハライ・ナーゲル社製)により、アガロースゲルより目的断片を回収した。塩基配列決定のためのダイターミネーター法によるシークエンス反応は, Big Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit ver.3.1(ThermoFisher Scientific社製)にて行い、ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer(ThermoFisher Scientific社製)にて解析した。解析した16S rDNAの塩基配列は配列表の配列番号3の塩基配列を有していた。この塩基配列に対してBLAST programによる相同性検索を行い、DNA data bank(DDBJ/EMBL/GenBank)のデータベースと比較することで、分離株の分類学的同定を行った。
この菌株は、2016年4月19日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物センター(〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室)に受託番号NITE P-02242として国内寄託され、その後にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管されて、2017年5月26日にNITE BP-02242として国際寄託の受託番号が付与されている。
IJH-SONE68株からのゲノムDNAについて、P6ポリメラーゼおよびC4ケミストリー(P6C4)を用いた単一分子リアルタイム(SMRT)セルで、PacBio RS II(Pacific Biosciences、Menlo Park、CA、U.S.A.)によってゲノムDNA配列決定を行った。 精製されたゲノムDNA試料を、g-TUBEキット(Covaris、Woburn、MA、U.S.A.)を用いて断片に剪断した。次いで、剪断された断片をAMPure PBキット(Pacific Biosciences)を用いて精製した。PacBio DNAテンプレート調製キット1.0(Pacific Biosciences)およびPacBio DNA / Polymerase Binding Kit P6(Pacific Biosciences)を用いてDNAライブラリーを構築した。短い断片をBlue Pippin(Sage Science、Beverly、MA、U.S.A.)によって除去し、次いで精製DNAライブラリーをPacBio SMRTプラットフォーム上で配列決定した。 階層的ゲノムアセンブリプロセス(HGAP)プロトコル(Nat. Methods, 10, 563-56933)でデノボアセンブリを行い、得られた全ゲノムコンティグを微生物ゲノムアノテーションパイプライン(MiGAP)によりアノテーションを行った(The 20th International Conference on Genome Informatics (GIW2009) Poster and Software Demonstrations (Yokohama), S001-1-2)。
IJH-SONE68株の全ゲノム配列を決定し、その結果、ゲノムDNAはGC含量46.37%の3,084,917 bpからなり、構造遺伝子の数はMiGAPによって2,963個と予測された。さらに、配列の結果から、IJH-SONE68株は2つのプラスミドを含み、そのうちの1つが少なくとも51 kbであり、もう1つが45,267 bpのサイズであることを示した。他の乳酸菌と比べると、IJH-SONE68株は、より大きいゲノムサイズおよび構造遺伝子数を有する。
分離同定された乳酸菌の菌学的性質
分離同定された上記乳酸菌IJH-SONE68株は、図1の写真に示すように, カタラーゼ陰性のグラム陽性桿菌で、かつ、白色コロニー形成性を有し、条件的ヘテロ乳酸醗酵の特性を有するとともに、多糖体を産生する能力を有していた。
分離同定された乳酸菌の糖資化能力
1.資化能力の試験方法
IJH-SONE68株の49種類の糖類に対する資化能力について以下の試験方法により調べた。
IJH-SONE68株をMRS液体培地で増殖の定常期まで静置培養した。遠心して得られた菌体を適量のsuspension medium (ビオメリュー社製) で洗浄した後、最終的に2 mLのsuspension mediumに懸濁した。この一部を、5 mLのsuspension mediumに加えてマクファーランド濁度が2になる量 (n) を求めた。続いて, API 50 CHL培地 (ビオメリュー社製) に2nの菌液を添加し、これをAPI 50 CHLキット (ビオメリュー社製、各ウェルの底にはそれぞれ49種類の糖が塗り付けられている) の各ウェルへ分注した。最後にミネラルオイルを重層し、滅菌水を入れたトレイにセットした。37℃で48時間培養した後に、各ウェルにおける色調の変化を観察することで、資化能の有無の判定を行った。
IJH-SONE68株の49種類の糖類に対する資化能力を調べた結果は、表1に示したとおりである。表1には、特許公開公報に記載された、他のLactobacillus paracaseiについて同様のキットを用いて調べた資化能力も併せて示した。
1.IJH−SONE68株が産生する多糖体の分離精製
IJH−SONE68株が産生する菌体外多糖を以下の方法で分離精製した。
IJH−SONE68株をMRS液体培地で増殖の定常期まで静置培養した。この培養液5 mLを種培養液とし、5 Lの菌体外多糖体産生用半合成培地 (その組成は後述する) に植菌した後、37℃で120時間静置培養した。培養液を4℃に冷却した後、培養液上清中に含まれるタンパク質を変性させて、後のステップで沈殿として除去するために、202.5 mLの100%トリクロロ酢酸水溶液を加え、混和した後に30分間静置した。遠心によって沈殿を取り除き、回収した上清に等量のアセトンを加えて混和した後、4℃で一晩静置させることによって、IJH−SONE68株が産生する多糖体を沈殿させた。沈殿物を遠心によって回収した後、250 mLの70%エタノ−ルで沈殿物の洗浄を行った。沈殿物を風乾させた後、75 mLの50 mM Tris−HCl buffer (pH 8.0) を加えて1時間混和することで、沈殿物を溶解させた。遠心によって不溶性の夾雑物を取り除いた後、回収した上清に対し、それぞれ750 μLの1 mg/mL DNase溶液 (Worthington社) および1 mg/mL RNase溶液 (ナカライテスク社) を加え、37℃で8時間反応させた。続いて750 μLの2 mg/mL proteinase K溶液 (和光純薬工業社) を加え、37℃で16時間反応させた。反応後の溶液を4℃に冷却した後、添加した各酵素を変性させ、次の遠心で沈殿として除去するために、8.75 mLの100%トリクロロ酢酸水溶液を加えて混和し、4℃で1時間静置した。遠心によって沈殿物を取り除き、得られた上清に対し262.5 mLの100%エタノールを加え、しっかりと混和した後、遠心によってIJH−SONE68株が産生する多糖体を沈殿物として回収した。50 mLの70%エタノールで沈殿物を洗浄した後に風乾させ、適量 (約25 mL) の精製水を加えて4℃で一晩静置することで、多糖体を溶解させた。溶解後の多糖体サンプルは、10,000 MWCOの限外濾過ユニット (メルク社) を用い、溶媒を精製水に置換しながら、回収したサンプル中の単糖類などの小分子を取り除いて、精製された多糖体サンプルを得た。
以上により、IJH−SONE68株が産生する菌体外多糖として中性多糖画分および 酸性多糖画分が分離精製された。
Glucose 20
Tween 80 1.0
Ammonium citrate 2.0
Sodium acetate 5.0
MgSO4・7H2O 0.1
MnSO4・5H2O 0.05
K2HPO4 2.0
Bacto casitone 10.0
Vitamine Soln. 2 mL
Trace element Soln. 1 mL
4−aminobenzoic acid 0.05
Biotin 0.001
Folic acid 0.025
Lipoic acid 0.025
Nicotinic acid 0.1
Pantothenic acid 0.05
Pyridoxamin−HCl 0.25
Vitamine B12 0.05
Pyridoxine 0.025
Riboflavin 0.05
Thiamine 0.1
25% HCl 10 mL
FeCl2・4H2O 1.5
CoCl2・6H2O 0.19
MnCl2・4H2O 0.1
ZnCl2 0.07
H3BO3 0.006
Na2MoO4・2H2O 0.036
NiCl2・6H2O 0.024
CuCl2・2H2O 0.002
上記した陰イオン交換カラムクロマトグラフィー(TOYOPEARL DEAE−650M樹脂 (東ソ−株式会社))によって精製された菌体外中性多糖を、プロトン-NMRおよびカーボン-NMRに付し、得られたそれぞれのNMRプロファイルを図3に示した。これらのNMRプロファイルからの菌体外中性多糖の構造解析結果を図4に示した。
この構造解析結果から、IJH−SONE68株が産生する菌体外中性多糖は、N−アセチルグルコサミンがα-1,6結合により連結した構造を有することが明らかになった。
上記した陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによって精製された菌体外酸性多糖の糖組成分析を高速液体クロマトグラフ(HPLC)法で測定することにより行った。
精製された菌体外酸性多糖(7.3 mg/mL)10μLと水60μLを混合して7倍希釈試料溶液を調製し、試験管に調製して希釈試料溶液20μLを採取し、減圧乾固し、2 mo1/Lトリフルオロ酢酸100μLを添加して溶解し、窒素置換、減圧封管、100℃で6時間加水分解し、次いで減圧乾固した。得られた残澄に水200μLを添加して溶解し、0.22μmのフィルターでろ過して測定用試料溶液を得、測定用試料溶液を水で10倍希釈して希釈測定用試料溶液を得た。これらの測定用試料溶液および希釈測定用試料溶液50μLを分析した。分析機器として、HPLCシステム:LC-20Aシステム(株式会社島津製作所)および分光蛍光光度計M-10AxL(株式会社島津製作所)を用いた。分析条件は以下の通りであった。
カラム:TSK-gel Sugar AXG 4.6 mmI.D.×15 cm(東ソー株式会社)
カラム温度:70℃
移動相:0.5 mo1/Lホウ酸カリウム緩衝液、pH 8.7
移動相流速:0.4 mL/min
ポストカラム標識:反応試薬:l w/v%アルギニン・3 w/v%ホウ酸
反応試薬流速:0.5 mL/min
反応温度:150℃
検出波長:Ex.320 nm Em.430 nm
実施例1に記載したIJH-SONE68株のゲノム配列のアノテーションに基づいて、2つの菌体外多糖生合成遺伝子クラスターがゲノムDNA上に見出された(図5)。そのうちの一つの23 kbのクラスターをpcelクラスターと命名し、このpcelクラスターは、機能不明のタンパク質をコードする遺伝子を含む18個のオープンリーディングフレーム(ORF(pce1A〜R))から構成されていた。他の一つの28 kbのクラスターをpce2クラスターと命名し、このpce2クラスターは、12個の完全なORFと3つの短縮(truncated)ORF(pce2A〜O)を含んでいた。さらに、12個のトランスポゼース関連遺伝子がpce2クラスター上に見出された。 菌体外多糖の生合成に必要なタンパク質をコードする遺伝子に関しては、鎖長因子として作用するタンパク質-チロシンホスファターゼWzbをコードするwzb遺伝子(Yother J. Annu. Rev. Microbiol., 65, 563-581 (2011))はpcelクラスターには見出されなかった。一方、pce2クラスター上には、糖重合の最初の工程を触媒するプライミンググリコシルトランスフェラーゼ(van Kranenburg R, Vos HR, van Swam II, Kleerebezem M, de Vos WM. J Bacteriol. 1999 Oct;181(20):6347-6353)と相同性を示す遺伝子は存在しなかった。
pce2クラスターにおいて、pce2Jと命名したグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の1つから推定されたタンパク質は、既に知られているβ-1,6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼに見られるpfam02485モチーフ又はドメイン(Genes Dev. 1993 Mar;7(3):468-478及びJ. Biol. Chem. 1999 Jan 29;274(5):3215-3221)と同様のモチーフ又はドメイン持っていることが見出されたことから、pce2クラスター中のこのタンパク質をコードする構造遺伝子が中性多糖の生合成に関与していることが示唆された。実際、pce2クラスターは、ATCC334株およびJCM 8130T株と比較してIJH-SONE68株ゲノムに特異的であり、pce2クラスターから新規な構造の中性多糖が生合成されると考えられる。
IJH−SONE68株が産生する多糖体のヒアルロニダ−ゼ活性阻害
実施例4で得られたIJH−SONE68株が産生する菌体外多糖である、中性多糖画分および酸性多糖画分を含む多糖体サンプル、並びに中性多糖画分および酸性多糖画分のヒアルロニダ−ゼ活性阻害を調べた。
実施例4で得られた中性多糖画分および酸性多糖画分を含む多糖体サンプル、中性多糖画分および酸性多糖画分から任意の濃度に調整した多糖を含む水溶液10 μLに対し、5 μLのヒアルロニダーゼ酵素溶液 (MP Biomedicals社、4 mg/mL、100 mM酢酸ナトリウムbuffer (pH 4.0)) を添加し、37℃で20分インキュベートした。その後、10 μLの酵素活性化溶液 (0.5 mg/ml Compound 48/80 (MP Biomedicals社)、3.75 mg CaCl2・2H2O、100 mM酢酸ナトリウムbuffer (pH 4.0)) を加え、再び37℃で20分間インキュベートした。続いて、25 μLのヒアルロン酸ナトリウム溶液 (和光純薬工業社、0.8 mg/mL、100 mM酢酸ナトリウムbuffer (pH 4.0)) を加え、更に37℃で40分間反応させた。反応後、10 μLの0.4 M NaOH水溶液を加えることによって反応を停止させた。続いて10 μLの100 mMホウ酸カリウムbuffer (pH 10.0) を加えた後に100℃で3分間加熱し、直ちに氷冷した。反応液40 μLを200 μLのp−DMAB溶液 (後述する) と混和し、37℃で20分反応させた後、585 nmにおける吸光度を測定した。コントロールとして、ヒアルロニダーゼ酵素溶液を含まない反応液についても同様に調製し、実験を行った。
阻害率 (%) = 100 − (S/C) × 100
この式において、Cはサンプルを含まない場合の酵素活性、Sはサンプルを含む場合の酵素活性を示す。また、多糖体サンプルのIC50値については、含有濃度を変化させたデ−タを複数取得した後、X軸に多糖体サンプル濃度、Y軸に阻害率を取ったグラフにプロットし、次の近似式より求めた。
Y = α / (1 + βe−γX)
式中、α、β及びγは定数を示す。
得られたヒアルロニダーゼ活性阻害の試験結果を表3に示す。
多糖体サンプル(中性多糖画分および酸性多糖画分を含む)、中性多糖画分および酸性多糖画分は高いヒアルロニダーゼ活性阻害を示した。特に、多糖体サンプルおよび中性多糖画分は抗炎症作用を有するグリチルリチン酸ジカリウムと同程度のヒアルロニダーゼ活性阻害を示した。
[1] イチジク由来の乳酸菌であってラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)に属する乳酸菌の菌体外多糖。
[2] 菌体外多糖は、N−アセチルグルコサミンがα-1,6結合により連結した構造を有する中性多糖である上記[1]に記載の菌体外多糖。
[3] 菌体外多糖が主としてグルコースとマンノースから構成される酸性多糖である上記[1]に記載の菌体外多糖。
[4] ヒアルロニダーゼ活性阻害を有する上記[1]〜[3]のいずれかに記載の菌体外多糖。
[5] 乳酸菌がLactobacillus paracasei IJH-SONE68株(受託番号NITE BP-02242)又はそれと同等の乳酸菌である上記[1]〜[4]のいずれかに記載の菌体外多糖。
[6] イチジク由来の乳酸菌であってラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)に属する乳酸菌の培養物から得られる多糖体をイオン交換クロマトグラフィーによって単離精製して得ることができる上記[1]〜[5]のいずれかに記載の菌体外多糖。
[7] (1) イチジク由来の乳酸菌であってラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)に属する乳酸菌の培養物から遠心分離により菌体を除去する工程;
(2) 工程(1)で得られた培養物から、エタノール又はアセトンによる沈殿によって菌体外多糖体及びタンパク質を沈殿として回収する工程;
(3) 回収した沈殿からタンパク質を除去して菌体外多糖体を回収する工程;及び
(4) 回収された菌体外多糖体を陰イオン交換クロマトグラフィーにより分離精製する工程
によって得ることができる上記[1]〜[6]のいずれかに記載の菌体外多糖。
[8] 上記[1]〜[7]のいずれかに記載の菌体外多糖を含有する組成物。
[9] 組成物が飲食品組成物である上記[8]に記載の組成物。
[10] 飲食品が、機能性食品、発酵食品、飲料又はサプリメントである上記[9]に記載の組成物。
[11] 組成物が医薬組成物である上記[8]に記載の組成物。
[12] 組成物が飼料組成物である上記[8]に記載の組成物。
[13] 組成物が化粧品組成物である上記[8]に記載の組成物。
[14] ヒアルロニダーゼ阻害のための上記[8]〜[13]のいずれかに記載の組成物。
[15] 抗アレルギーのための上記[8]〜[13]のいずれかに記載の組成物。
[16] 上記[1]〜[7]のいずれかに記載の菌体外多糖の製造方法であって、イチジク由来の乳酸菌であってラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)に属する乳酸菌の培養物から多糖体を得、次いで、得られた多糖体をイオン交換クロマトグラフィーに付して、上記[1]〜[7]のいずれかに記載の菌体外多糖を得る、製造方法。
[17] (1) イチジク由来の乳酸菌であってラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)に属する乳酸菌の培養物から遠心分離により菌体を除去する工程;
(2) 工程(1)で得られた培養物から、エタノール又はアセトンによる沈殿によって多糖体及びタンパク質を沈殿として回収する工程;
(3) 回収した沈殿からタンパク質を除去して菌体外多糖体を回収する工程;及び
(4) 回収された菌体外多糖体を陰イオン交換クロマトグラフィーにより分離精製する工程
を含む上記[16]に記載の製造方法。
[18] 組成物の有効成分としての上記[1]〜[7]のいずれかに記載の菌体外多糖の使用。
[19] 組成物が飲食品組成物である上記[18]に記載の使用。
[20] 飲食品が、機能性食品、発酵食品、飲料又はサプリメントである上記[19]に記載の使用。
[21] 組成物が医薬組成物である上記[18]に記載の使用。
[22] 組成物が飼料組成物である上記[18]に記載の使用。
[23] 組成物が化粧品組成物である上記[18]に記載の使用。
[24] 組成物がヒアルロニダーゼ阻害のための組成物である上記[18]〜[23]のいずれかに記載の使用。
[25] 組成物が抗アレルギーのための組成物である上記[24]に記載の使用。
[26] 上記[1]〜[7]のいずれかに記載の菌体外多糖と他の成分とを混合することを含む組成物の製造方法。
[27] 組成物が飲食品組成物である上記[26]に記載の製造方法。
[28] 飲食品が、飲料、機能性食品、発酵食品又はサプリメントである上記[27]に記載の製造方法。
[29] 組成物が医薬組成物である上記[26]に記載の製造方法。
[30] 組成物が飼料組成物である上記[26]に記載の製造方法。
[31] 組成物が化粧品組成物である上記[26]に記載の製造方法。
[32] 組成物がヒアルロニダーゼ阻害のための組成物である上記[26]〜[31]のいずれかに記載の製造方法。
[33] 組成物が抗アレルギーのための組成物である上記[26]〜[31]のいずれかに記載の製造方法。
[34] 上記[1]〜[7]のいずれかに記載の菌体外多糖を、それを必要とする対象に適用する方法であって、上記[1]〜[7]のいずれかに記載の菌体外多糖を含有する組成物を対象に適用することを含む適用方法。
[35] 組成物が飲食品組成物である上記[34]に記載の適用方法。
[36] 飲食品が、飲料、機能性食品、発酵食品又はサプリメントである上記[35]に記載の適用方法。
[37] 組成物が医薬組成物である上記[34]に記載の適用方法。
[38] 組成物が飼料組成物である上記[34]に記載の適用方法。
[39] 組成物が化粧品組成物である上記[34]に記載の適用方法。
[40] 対象に対してヒアルロニダーゼ阻害作用を発揮する上記[34]〜[39]のいずれかに記載の適用方法。
[41] 対象に対して抗アレルギー作用を発揮する上記[34]〜[39]のいずれかに記載の適用方法。
Claims (13)
- ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei) IJH-SONE68株(受託番号NITE BP-02242)である乳酸菌のN−アセチルグルコサミンがα-1,6結合により連結した構造を有する中性多糖。
- ヒアルロニダーゼ阻害活性を有する請求項1に記載の中性多糖。
- ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei) IJH-SONE68株(受託番号NITE BP-02242)である乳酸菌の培養物から得られる多糖体をイオン交換クロマトグラフィーによって分離精製して、N−アセチルグルコサミンがα-1,6結合により連結した構造を有する中性多糖を得ることを含む、中性多糖の製造方法。
- (1) ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)IJH-SONE68株(受託番号NITE BP-02242)である乳酸菌の培養物から遠心分離により菌体を除去する工程;
(2) 工程(1)で得られた培養物から、エタノール又はアセトンによる沈殿によって多糖体及びタンパク質を沈殿として回収する工程;
(3) 回収した沈殿からタンパク質を除去して菌体外多糖体を回収する工程;及び
(4) 回収された菌体外多糖体を陰イオン交換クロマトグラフィーにより分離精製して、N−アセチルグルコサミンがα-1,6結合により連結した構造を有する中性多糖を得る工程
を含む、請求項3に記載の製造方法。 - 請求項1又は2に記載の中性多糖を含有する組成物。
- さらに、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)IJH-SONE68株(受託番号NITE BP-02242)である乳酸菌の酸性多糖であって、主としてグルコースとマンノースから構成される酸性多糖を含有する請求項5に記載の組成物。
- 組成物が飲食品組成物である請求項5又は6に記載の組成物。
- 飲食品が、機能性食品、発酵食品、飲料又はサプリメントである請求項7に記載の組成物。
- 組成物が医薬組成物である請求項5又は6に記載の組成物。
- 組成物が飼料組成物である請求項5又は6に記載の組成物。
- 組成物が化粧品組成物である請求項5又は6に記載の組成物。
- ヒアルロニダーゼ阻害のための請求項5〜11のいずれかに記載の組成物。
- 抗アレルギーのための請求項12に記載の組成物。
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