TWI739078B

TWI739078B - 脂肪累積抑制用組成物

Info

Publication number: TWI739078B
Application number: TW108110967A
Authority: TW
Inventors: 杉山政則
Original assignee: 日商曾根農場股份有限公司
Priority date: 2018-04-25
Filing date: 2019-03-28
Publication date: 2021-09-11
Also published as: JP6649539B1; WO2019208150A1; CN111698913A; EP3760055A4; TW202002801A; KR20200091403A; CA3086024C; EP3760055A1; AU2019260952B2; US20210169952A1; AU2019260952A1; US20230034847A1; KR102368627B1; CA3086024A1; JPWO2019208150A1

Abstract

含有屬於副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei )之乳酸菌菌體、其培養物或發酵物或者其所產生之多醣類作為有效成分之組成物對於抑制脂肪累積甚是有效，可供用作用以預防或改善肥胖、脂肪肝或肝功能衰竭之飲食品、醫藥品及飼料。

Description

脂肪累積抑制用組成物

本發明有關一種脂肪累積抑制用組成物。更詳言之，本發明有關一種用以抑制脂肪累積之組成物，該組成物係以屬於副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei)之乳酸菌菌體、其培養物或發酵物或者其所產生之多醣類作為有效成分。

背景技術

近年來，在日本及歐美各國，具有被稱為代謝症候群(顯示脂肪肝、糖尿病、高血壓及動脈硬化等症狀)之病態的患者日趨增加。咸認代謝症候群與肥胖關聯甚深。肥胖係指，因過度飲食導致熱量過度攝取、或運動不足導致熱量消費低落等，致使脂肪細胞數增加之狀態或脂肪細胞內脂肪過剩累積之狀態。因此，咸認可藉由抑制此種脂肪累積來預防、改善肥胖。

此外，脂肪肝係指中性脂肪過剩累積於肝臟或肝細胞之狀態，咸認其與肥胖、高血脂症及糖尿病等文明病密切相關。就中性脂肪累積於肝臟或肝細胞而言，舉例來說，遊離脂肪酸被攝入而累積為中性脂肪一事也被認為是原因之一。

為了預防、改善肥胖，目前已有各種方案提出，諸如攝取可促進體脂肪燃燒及抑制脂肪累積之食材或補充劑、醫療領域下投予抗肥胖劑等。此外，就預防、治療脂肪肝之方法而言，則有抑制脂肪累積肝臟之方法等提出。然而，就現狀而言，從安全性及實用性層面等來看，可有效預防、改善肥胖及脂肪肝者仍為數甚少。

另一方面，乳酸菌自古以來被用於製造發酵乳、乳酸菌飲料及發酵奶油等乳製品等食品，由於乳酸菌本身也具有以整腸效果為始之各種藥理作用，也被用作健康食品及醫藥品等之素材。就乳酸菌對脂肪累積之作用而言，已有報告指出，在乳酸桿菌屬及乳酸球菌屬乳酸菌中發現了具有內臟脂肪減少作用之菌株(專利文獻1)、屬於加氏乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri)之乳酸菌具有脂肪肝抑制作用(專利文獻2)等。此外，源自植物之乳酸菌亦有具改善脂肪肝與抑制體內脂肪累積之效果的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)LP28菌株(非專利文獻3)等已為人所知。

先行技術文獻

專利文獻

[專利文獻1] 日本特開2008-214253號公報

[專利文獻2] 日本特開2008-24680號公報

非專利文獻

[非專利文獻1] Appl. Microbiol. Biotechnol., 84, 341-347 (2009)

發明概要

於此種背景技術下，乃冀望開出發以乳酸菌作為有效成分且用以抑制脂肪累積之新穎組成物。因此，本發明之課題在於提供一種用以抑制脂肪累積的新穎組成物，其可有效預防或改善肥胖、脂肪肝及肝功能衰竭且以乳酸菌作為有效成分。

本案發明人等以開發出用以抑制脂肪累積之新穎組成物為目的而精心研討，結果發現，屬於副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei)之乳酸菌所產生之多醣類具有抑制肝細胞攝入遊離脂肪酸而累積為中性脂肪之作用，及，屬於副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei)之乳酸菌會抑制體重增加與內臟脂肪累積而顯示抗肥胖作用，依上述知識見解進一步反覆研究後而完成本發明。

於本發明之一面向中，本發明有關一種用以抑制脂肪累積之組成物，其係以屬於副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei)之乳酸菌菌體、其培養物或發酵物或者其所產生之多醣類作為有效成分。

本發明之組成物可適宜用於預防或改善肥胖，或者預防或改善脂肪肝或肝功能衰竭。

就本發明之組成物而言，乳酸菌以源自無花果之乳酸菌為宜，尤以Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株(寄存編號NITE BP-02242)或與其同等之乳酸菌為佳。

本發明之組成物中，乳酸菌之培養物或發酵物以在鳳梨屬植物果汁存在下培養乳酸菌或使其發酵所得之培養物或發酵物為宜。

本發明之組成物中，乳酸菌所產生之多醣類可舉如：中性多醣體，其具有N-乙醯葡萄糖胺藉α-1,6鍵而連結之結構；或者，主要由葡萄糖與甘露糖構成之酸性多醣體。

本發明之組成物以飲食品組成物為宜，飲食品宜舉如飲料、機能性食品、發酵食品或補充劑(supplement)。

此外，本發明之組成物以醫藥組成物為宜。

進一步來說，本發明之組成物以飼料組成物為宜。

本發明之組成物對於抑制脂肪累積甚有效，可用於預防或改善肥胖或者用於預防或改善脂肪肝或肝功能衰竭。本發明之組成物可用作用以預防或改善肥胖、脂肪肝或肝功能衰竭之飲食品、醫藥品及飼料。此外，由於本發明之組成物係以屬於副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei)之乳酸菌菌體、其培養物或發酵物或者其所產生之多醣類作為有效成分，安全性甚高而可長期施用，此外，可價廉地大量供給，其有用性及實用性極高。

圖1為Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株之顯微鏡照片。圖1之(A)為革蘭氏染色顯微鏡照片，(B)為掃描型電子顯微鏡(SEM)照片。

圖2為Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株之多醣類利用陰離子交換層析法(TOYOPEARL DEAE-650M樹脂(TOSOH CORPORATION))之分離分析圖。以0mM~500mM梯度濃度之NaCl(虛線)使多醣類溶出，再藉酚硫酸法於490nm下監測各分液中多醣類之存在(直線)。

圖3顯示：將以陰離子交換管柱層析法純化Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株之多醣類所得中性多醣體施行質子-NMR及碳-NMR所獲得之各NMR分析圖。圖3之(A)為質子-NMR之NMR分析圖，(B)為碳-NMR之NMR分析圖。

圖4顯示源自NMR分析圖之中性多醣體之結構解析結果。由該結構解析結果明確得知，Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株之中性多醣體具有N-乙醯葡萄糖胺藉α-1,6鍵而連結之結構。

圖5為圖表，顯示Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株所產生之多醣類係濃度相依性地具有脂肪累積抑制作用。

圖6為圖表，顯示攝取了經Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株發酵所得鳳梨果汁發酵液之攝食高脂肪食餌之肥胖模式小鼠的體重增加變遷。

圖7為圖表，顯示：藉由攝取經Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株發酵所得鳳梨果汁發酵液，攝取高脂肪食餌之肥胖模式小鼠的體重增加受到抑制。

圖8為圖表，顯示：藉由攝取經Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株發酵所得鳳梨果汁發酵液，攝取高脂肪食餌之肥胖模式小鼠的內臟脂肪量受到抑制。

用以實施發明之形態

以下，針對本發明所提供之用以抑制脂肪累積之組成物予以詳細說明，該組成物係以屬於副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei)之乳酸菌菌體、其培養物或發酵物或者其所產生之多醣類作為有效成分。

1.本發明中作為對象之乳酸菌

本發明中作為對象之乳酸菌為屬於副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei)之乳酸菌，且以源自無花果之乳酸菌為宜。可具體舉如：依本發明而從無花果葉分離並鑑定之Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株。該菌株係於2016年4月19日以寄存編號NITE P-02242於獨立行政法人製品評價技術基礎機構專利微生物中心(〒292-0818日本國千葉縣木更津市上總鎌足2-5-8 122號室)進行國內寄存，之後移管為遵照布達佩斯條約之國際寄存，並於2017年5月26日賦予國際寄存編號為NITE BP-02242。

Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株係如圖1之照片所示，為過氧化氫酶陰性之革蘭氏陽性桿菌，且具有白色菌落形成性，並具有視條件而定之雜乳酸發酵特性的菌學性質。進一步來說，具有產生多醣體之能力。

於本發明中，與Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株同等之乳酸菌亦視為對象。於此，同等之乳酸菌意指：屬於Lactobacillus paracasei之乳酸菌，且與Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株同樣地具有脂肪累積抑制作用的乳酸菌，抑或，可產生與Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株所產生之多醣類同樣具有脂肪累積抑制作用之多醣類的乳酸菌。舉例來說，於其等同等之乳酸菌可藉由對Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株進行突變、基因重組等一般突變處理技術來獲得，此外，也可為藉選擇Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株之自然突變菌株等並育種而成之菌株。

2.本發明之有效成分

本發明之組成物包含上述乳酸菌之菌體、其培養物或發酵物或者其所產生之多醣類作為有效成分。

乳酸菌可使用一般使用之MRS培養基及其修正培養基等，藉液體靜置培養等一般使用之培養方法來培養。乳酸菌可藉由在鳳梨屬植物果汁或其萃取物存在下進行培養來促進其增殖(國際公開第WO2011/046194號)，此外，在酒粕、酒粕萃取物或酒粕之酵素分解物存在下進行培養也可促進其增殖(日本特開平3-172171號公報、日本特開平5-15366號公報及日本專利第2835548號公報)。培養乳酸菌後，可將所得培養物直接用作有效成分，亦可將所得培養液稀釋或濃縮後使用，也可使用回收自培養物之菌體。此外，在不損及本發明效果之前提下，也可於培養後進行加熱及冷凍乾燥等各種追加操作。又，乳酸菌之菌體可為其細胞表層附著有多醣類之活菌體，亦可為死菌體，也可為活菌體及死菌體兩者。死菌體可為破碎物，但宜使多醣類附著於其表層。此外，乳酸菌之發酵物通常使用葡萄糖等作為營養源，且可視需要進一步添加酵母萃、鳳梨屬植物果汁、酒粕、燒酒粕等植物乳酸菌之增殖促進物質並使其發酵來獲得。

乳酸菌所產生之多醣類可藉一般方法自屬於副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei)之乳酸菌培養物分離純化來獲得。具體舉例來說，可藉離心分離而從屬於副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei)之乳酸菌培養物中去除菌體，再使用乙醇及丙酮等，從所得培養物中使多醣類沉澱來獲得。此外也可藉離子交換層析法進一步進行分離純化來獲得。

本發明中乳酸菌所產生之多醣類可具體舉如：具有N-乙醯葡萄糖胺藉α-1,6鍵而連結之結構的中性多醣體，或者，主要由葡萄糖與甘露糖構成之酸性多醣體。該中性多醣體係如後述實施例2所載，可藉陰離子交換層析法將得自Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株培養物之多醣體進行分離純化來製得。從圖3所示質子-NMR及碳-NMR之NMR分析圖，可明確得知該中性多醣體具有N-乙醯葡萄糖胺藉α-1,6鍵而連結之結構。此外， Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株會將主要由葡萄糖與甘露糖構成之酸性多醣體分泌至菌體外。更具體來說，酸性多醣體由葡萄糖、甘露糖、半乳糖及鼠李糖構成，且其等之組成比大致上為10：170：2：1。

3.本發明之組成物

本發明之組成物可以飲食品組成物、醫藥組成物及飼料組成物等各種形態作使用。

飲食品組成物之飲食品並未特別受限，可例示如：清涼飲料、碳酸飲料、營養飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料等飲料；該等飲料之濃縮原液、調製用粉末等；冰淇淋、雪果霜、刨冰等冰製點心；糖果、膠質糖、穀物片、口香糖、硬糖、樹膠、巧克力、糖果錠、零食、餅乾、果凍、果醬、鮮奶油及烘焙點心等點心類；加工乳、乳飲料、發酵乳、優酪飲品、奶油等乳製品；麵包；經腸營養食品、流質食品、育兒用奶粉、運動飲料；蔬果泥(Purée)等食品；甜酒；其他機能性食品等。此外，飲食品亦可為補充劑，例如，可為顆粒狀、粉末狀、錠狀補充劑。

如上所述之飲食品可藉由在飲食品原料中添加乳酸菌菌體、其培養物或發酵物或者其所產生之多醣類來製造，或者，可與一般飲食品同樣地製造。乳酸菌菌體、其培養物或發酵物或者其所產生之多醣類之添加可在飲食品製程之任一階段進行。也可經所添加乳酸菌之發酵步驟後再製造飲食品。此種飲食品可舉如乳酸菌飲料、發酵乳等發酵食品等。

飲食品組成物中乳酸菌菌體、其培養物或發酵物之含量可視飲食品之態樣予以適當設定，但一般來說，以飲食品組成物中所含菌體在1×10⁶~1×10¹²cfu/g或1×10⁶~1×10¹²cfu/ml範圍內之含量為宜，在1×10⁷~1×10¹¹cfu/g或1×10⁷~1×10¹¹cfu/ml範圍內更佳。乳酸菌為死菌體時，cfu/g或cfu/ml可替換為個細胞/g或個細胞/ml。為乳酸菌所產生之多醣類時，飲食品組成物中，多醣類以重量換算計通常含0.001重量%以上，更宜含0.01重量%以上。

醫藥組成物通常係將乳酸菌菌體、其培養物或發酵物或者其所產生之多醣類摻合至一般使用之生理上可接受之液體或固體製劑載體並製劑化後作使用。醫藥組成物之劑形並未特別受限，具體來說可例示如錠劑、丸劑、粉劑、液劑、懸浮劑、乳劑、顆粒劑、膠囊劑、糖漿劑、栓劑、注射劑、軟膏劑、貼劑、點眼劑及點鼻劑等。

本發明之醫藥組成物製劑中，乳酸菌菌體或其培養或者發酵物之含量可視劑形、用法、對象之年齡、性別、疾病種類、疾病程度及其他條件等予以適當設定，通常以所含菌體在1×10⁶~1×10¹²cfu/g或1×10⁶~1×10¹²cfu/ml範圍內之含量為宜，在1×10⁷~1×10¹¹cfu/g或1×10⁷~1×10¹¹cfu/ml範圍內更佳。乳酸菌為死菌體時，cfu/g或cfu/ml可替換為個細胞/g或個細胞/ml。為乳酸菌所產生之多醣類時，醫藥品組成物中多醣類以重量換算計通常含0.001重量%以上，更宜含0.01 重量%以上。

本發明醫藥組成物之投予時期並未特別受限，可視施用對象適當選擇投予時期。此外，可作預防性投予，亦可用於維持療法。投予形態宜視製劑形態、投予對象之年齡、性別、其他條件、投予對象之症狀程度等適當決定。本發明之醫藥組成物在任一狀況下皆可1天1次或分為多數次投予，此外，也可數天或數週投予1次。

飼料組成物之飼料可舉如如寵物食品、家畜飼料、飼育魚飼料等。此種飼料可於一般飼料諸如穀類、粕類、糠類、魚粉、骨粉、油脂類、脫脂奶粉、乳清(whey)、鹽滷、礦物質飼料、酵母類等中混入乳酸菌菌體、其培養物或發酵物或者其所產生之多醣類來製造。此外，舉例來說，可如青貯料時般，經所添加乳酸菌之發酵步驟後再製造飼料。所製造之飼料可經口投予一般哺乳動物、家畜類、飼育魚類、寵物等。此外，飼育魚類時，也可採用將添加有乳酸菌菌體、其培養物或發酵物或者添加有其所產生之多醣體的發酵物撒於養魚場之方法。

飼料組成物中乳酸菌菌體或其培養物或者發酵物之含量可視飼料態樣及施用對象來適當設定，但以所含菌體在1×10⁶~1×10¹²cfu/g或1×10⁶~1×10¹²cfu/ml範圍內之含量為宜，在1×10⁷~1×10¹¹cfu/g或1×10⁷~1×10¹¹cfu/ml範圍內更佳。乳酸菌為死菌體時，cfu/g或cfu/ml可替換為個細胞/g或個細胞/ml。為乳酸菌所產生之多醣類時，飲食品組成物中多醣類以重量換算計通常含0.001重量%以上，更宜含0.01重量%以上。

4.本發明組成物之用途

屬於副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei)之乳酸菌菌體、其培養物或發酵物或者其所產生之多醣類具有抑制肝細胞攝入遊離脂肪酸並累積為中性脂肪之作用，可抑制體重增加與內臟脂肪累積而具有抗肥胖作用。因此，含有屬於副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei)之乳酸菌菌體、其培養物或發酵物或者其所產生之多醣類作為有效成分之組成物可供使用於抑制脂肪累積或用於抑制肥胖。具體來說，本發明之組成物可供用於預防或改善肥胖或者用於預防或改善脂肪肝或肝功能衰竭。此外，由於本發明之組成物對於預防或改善肥胖有效，尤可用作維持健康或增進健康用之飲食品素材。再者，由於脂肪肝或肝功能衰竭之預防或改善也維繫著體力之維持、增進及恢復等，亦可作為體力維持、增進及恢復用飲食品之素材來利用。

實施例

以下，藉實施例進一步詳細說明本發明，但本發明不受此等實施例所侷限。

實施例1

乳酸菌之分離及鑑定

1.乳酸菌樣本之分離

選擇無花果(品種「豐蜜姬」)之葉、莖及果實，使用已殺菌之鑷子與剪刀使其細破片化至2~3mm後，於已滅菌且裝有MRS液體培養基之試管中分別裝入5~6個細片，於28℃及37℃下靜置培養至乳酸菌之標準培養基即MRS培養基發生混濁(增殖)。亦即，至可目視到乳酸菌候補菌株增殖為止需要2~4天。

將上述乳酸菌候補菌株之各培養液的一部分以拋棄式接種環劃線塗菌於MRS洋菜培養基上後進行靜置培養。形成於洋菜培養基上之菌落中，將「顏色、光澤、形狀不同者」全部拾取，再於新鮮之MRS洋菜培養基上進行劃線塗菌來純化菌落。

對於經純化之各菌落，為了驗證有無過氧化氫酶之產生而進行H₂O₂測試。此係一用以觀察菌體暴露於10% H₂O₂溶液時若過氧化氫酶存在即會生成氧的現象有無發生的試驗法。順帶一提，乳酸菌不會產生過氧化氫酶。

嘗試從無花果探索分離之結果，從以無花果葉作為分離源者成功獲得顯示過氧化氫酶陰性之乳酸菌候補菌株1株。

2.分離菌株之鑑定

將上述乳酸菌候補菌株另以MRS液體培養基培養並利用離心分離取得菌體。以細胞壁溶解酵素處理後，使用DNAzol試劑抽提出基因組DNA。

按照記載於Lane,D.J.(1991).16S/23S rRNA sequencing.In Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics、pp.115-175.Edited by E.Stackebrandt & M.Goodfellow.Chichester：Wiley之方法，以基因組 DNA為模板，藉由使用27f引子與1525r引子之PCR反應，使16S rDNA部分擴增，並以NucleoSpin Gel and PCR Clean-up kit(MACHEREY-NAGEL GmbH & Co.KG製)自瓊脂糖凝膠回收目的斷片。用以決定鹼基序列之dye terminator法所致序列反應係以Big Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit ver.3.1(ThermoFisher Scientific公司製)進行，並以ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer(ThermoFisher Scientific公司製)解析。以BLAST program對解析出之16S rDNA的鹼基序列進行相同性檢索，與DNA data bank(DDBJ/EMBL/GenBank)之資料庫比較，藉此進行分離菌株之分類學鑑定。

將分離自無花果葉之乳酸菌候補菌株命名為IJH-SONE68菌株，由於其與已登記在DNA data bank(DDBJ/EMBL/GenBank)之「Lactobacillus paracasei R094」菌株且鹼基序列之accession編號為「NR_025880」的鹼基序列100%一致，而鑑定為Lactobacillus paracasei。

該菌株係於2016年4月19日以寄存編號NITE P-02242進行國內寄存於獨立行政法人製品評價技術基礎機構專利微生物中心(〒292-0818日本國千葉縣木更津市上總鎌足2-5-8 122號室)，之後移管為遵照布達佩斯條約之國際寄存，並於2017年5月26日賦予國際寄存編號為NITE BP-02242。

3.經分離鑑定之乳酸菌的菌學性質

經分離鑑定之上述乳酸菌IJH-SONE68菌株係如圖1之照片所示，為過氧化氫酶陰性之革蘭氏陽性桿菌且具白色菌落形成性，具有視條件而定之雜乳酸發酵特性，同時具有產生多醣類之能力。

4.經分離鑑定之乳酸菌之醣類同化能力

(1)同化能力之試驗方法

藉下述試驗方法，調查IJH-SONE68菌株對49種醣類之同化能力。

將IJH-SONE68菌株以MRS液體培養基靜置培養至增殖穩定期。將離心分離所得菌體以適量之懸浮介質(suspension medium，bioMérieux公司製)洗淨後，最後懸浮於2mL之suspension medium。將其一部分添加到5mL之suspension medium中，求出麥式(McFarland)濁度為2之量(n)。接著，於API 50 CHL培養基(bioMérieux公司製)中加入2n菌液，將其分注到API 50 CHL套組(bioMérieux公司製，各孔底分別塗附了49種醣)之各孔中。最後覆上礦物油層，安裝於已裝有滅菌水之托盤中。於37℃下培養48小時後，觀察各孔中之色調變化，藉此判定有無同化能力。

5.同化能力之試驗結果

IJH-SONE68菌株對49種醣類之同化能力的調查結果係如表1所示。

[表1]

實施例2

1.IJH-SONE68菌株所產生之多醣類的分離純化

以下述方式分離純化IJH-SONE68菌株所產生之多醣類。

將IJH-SONE68菌株以MRS液體培養基靜置培養至增殖穩定期。將該培養液5mL用作種培養液，植菌至5L之多醣體產生用半合成培養基(其組成後述)後，於37℃下靜置培養120小時。將培養液冷卻至4℃後，使培養液上清中所含蛋白質變性，為了在後續步驟中以沉澱物形式去除，添加202.5mL之100%三氯乙酸水溶液，混合後靜置30分鐘。藉離心去除沉澱物，於回收之上清液中加入等量丙酮並混合後，使其於4℃下靜置一夜，藉此使IJH-SONE68菌株所產生之多醣體沉澱。以離心回收沉澱物後，以250mL之70%乙醇進行沉澱物之洗淨。使沉澱物風乾後，添加75mL之50mM Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)並混合1小時，藉此使沉澱物溶解。藉離心去除不溶性之夾雜物後，對所回收之上清液分別添加750μL之1mg/mL DNase溶液(Worthington公司)及1mg/mL RNase溶液(Nacalai Tesque公司)，於37℃下使其反應8小時。接著，添加750μL之2mg/mL proteinase K溶液(和光純藥工業社製)，於37℃下使其反應16小時。使反應後之溶液冷卻至4℃後，使所添加之各酵素變性，為了於後續之離心將其作為沉澱物去除，添加8.75mL之100%三氯乙酸水溶液並混合，於4℃下靜置1小時。以離心去除沉澱物，對所得上清液添加262.5mL之100%乙醇，確實混合後藉離心將IJH-SONE68菌株所產生之多醣體以沉澱物形式回收。以50mL之70% 乙醇洗淨沉澱物後使其風乾，添加適量(約25mL)純水並於4℃下靜置一夜，藉此使多醣體溶解。溶解後之多醣體樣本使用10,000MWCO之超過濾單元(Merck公司)，一邊將溶劑替換為純水，一邊去除所回收樣本中之單醣類等小分子，而製得經純化之多醣類樣本。

將已純化之多醣類樣本施用到已預先以50mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)平衡化且填充有TOYOPEARL DEAE-650M樹脂(TOSOH CORPORATION)之開放管柱(2.5×22cm)，進行用以分離純化中性多醣分液與酸性多醣分液之管柱作業。溶液使用相同之緩衝液，固定流速1mL/min。此外，溶出液每6mL回收到不同的試管。首先，從開始至240分鐘的期間，以相同緩衝液使其溶出(試管編號1-40)。接著，從240分鐘之時間點至600分鐘之時間點為止，製作出使用相同緩衝液之0-500mM NaCl的濃度梯度並持續溶出(試管編號41-100)。茲將管柱分離圖譜顯示於圖2。對溶出至試管之全部樣本以酚硫酸法(後述)確認多醣體之存在後，將對應試管內之溶液分別統整為中性多醣分液、酸性多醣分液。各分液使用10,000MWCO之超過濾單元，一邊將溶劑替換為純水，一邊去除所回收樣本中之單醣類等小分子。

如上述般分離純化出中性多醣分液及酸性多醣分液來作為IJH-SONE68菌株所產生之多醣類。

多醣類產生用半合成培養基係將載於Kimmel SA、Roberts RF.Development of a growth medium suitable for exopolysaccharide production by Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus RR.Int.J.Food Microbiol.,40,87-92(1998)之培養基變更如下。

微量元素溶液(Trace element Soln.)係載於Kets EPW,Galinski EA,de Bont JAM.Carnitine：a novel compatible solute in Lactobacillus plantarum.Arch.Microbiol.,192,243-248(1994)，其組成如下。

酚硫酸法(DuBois M,Gilles KA,Hamilton JK,Rebers PA,Smith F.,Colorimetric method for determination of sugars and related substances.,Anal.Chem.,28,350-356(1956))

將30μL之對象樣本與等量之5w/v%酚水溶液混合後，添加150μL濃硫酸使其混合並開始反應。10分鐘後立刻冰冷使反應停止。藉由測定反應液於490nm下之吸光度來測定醣類濃度。另，濃度之決定係使用以葡萄糖作為標準品進行相同實驗所製出之檢量線。

2.菌體外中性多醣體之結構解析

將上述經陰離子交換管柱層析法(TOYOPEARL DEAE-650M樹脂(TOSOH CORPORATION))純化之菌體外中性多醣體施行質子-NMR及碳-NMR，並將所得各NMR分析圖顯示於圖3。茲將得自此等NMR分析圖之菌體外中性多醣體之結構解析結果顯示於圖4。

由該結構解析結果明確得知，IJH-SONE68菌株所產生之菌體外中性多醣體具有N-乙醯葡萄糖胺藉α-1,6鍵而連結之結構。

3.菌體外酸性多醣之醣組成分析

以高速液體層析(HPLC)法測定經上述陰離子交換管柱層析法純化之酸性多醣體，藉此進行醣組成分析。

將經純化之酸性多醣體(7.3mg/mL)10μL與水60μL混合而調製出7倍稀釋試樣溶液，再採取所調製稀釋試樣溶液20μL至試管，減壓乾涸後添加2mol/L三氟乙酸100μL使其溶解，進行氮氣沖洗、減壓封管後於100℃下水解6小時，接著減壓乾涸。對所得殘渣添加水200μL使其溶解，再以0.22μm之濾器過濾而獲得測定用試樣溶液，以水將測定用試樣溶液稀釋10倍而獲得稀釋測定用試樣溶液。分析此等測定用試樣溶液及稀釋測定用試樣溶液50μL。分析機器使用HPLC系統：LC-20A system(島津製作所股份有限公司)及分光螢光光度計M-10AxL(島津製作所股份有限公司)。分析條件如下。

管柱：TSK-gel Sugar AXG 4.6mmI.D.×15cm(TOSOH CORPORATION)

管柱溫度：70℃

移動相：0.5mol/L硼酸鉀緩衝液，pH8.7

移動相流速：0.4mL/min

柱後標識：反應試劑：1w/v%精胺酸‧3w/v%硼酸

反應試劑流速：0.5mL/min

反應溫度：150℃

檢測波長：Ex.320nm Em.430nm

求出以菌體外酸性多醣體調製之試樣層析圖譜及各單醣類之檢量線數據，從檢量線求出構成菌體外酸性多醣之構成醣的試料中濃度。茲將所得結果示於表2。

實施例3

IJH-SONE68菌株所產生之多醣類的脂肪累積抑制作用

依照下述方法，調查實施例2所得IJH-SONE68菌株產生之多醣類，即包含中性多醣分液及酸性多醣分液之多醣類樣本的脂肪累積抑制作用。

1.試驗方法

使用源自人類肝癌之細胞株HuH-7細胞作為試驗對象。HuH-7細胞係經含10v/v%FBS(fetal bovine serum)、100U/mL盤尼西林G及100μg/mL鏈黴素之DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)培養基(含有高葡萄糖、L-麩醯胺酸、酚紅、丙酮酸鈉)培養。使已匯合(confluent)之細胞懸浮於新DMEM培養基，以成為8×10⁴cells/well之方式播種至細胞培養用24孔盤。令此時每1盤孔之平均液量為500μL。培養24小時後，於各盤孔添加棕櫚酸(PA)：油酸(OA)(PA/OA)溶液(=1：2，溶解於DMSO中)至最終濃度為600μM(PA：200μM及OA：400μM)，更進一步培養24小時而開始攝入脂肪酸。此時，也同時對各多醣類樣本(最終濃度4-400μg/mL)預先添加，評價對細胞抑制脂肪酸攝入之程度。

經過24小時後，以抽濾管(aspirator)去除各盤孔中之培養液，添加500μL之PBS(phosphate buffered saline)洗淨細胞與盤孔。去除PBS後，添加10w/v%甲醛溶液250μL 10分鐘，使細胞固定。接著，以500μL之PBS洗淨2次，去除PBS後添加150μL之顯色劑溶液(Triglyceride E-test Wako)，於37℃下進行30分鐘呈色反應。反應後，從各盤孔回收100μL之反應液並測定600nm之吸光度，藉此將已攝入細胞之脂肪酸量測定為細胞內甘酸甘油脂(中性脂肪)量並予比較。對照則使用胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)SN35N菌株(寄存編號NITE P-6)所產生之多醣類。

2.試驗結果

實施脂肪酸攝入評價2次(1st及2nd)，將所得結果示於表3。

此外，亦將所得結果示於圖5。可由表3及圖5之結果得知，因僅添加PA/OA溶液，細胞中之三酸甘油脂(中性脂肪)量明顯上昇。此外，僅添加已溶有PA/OA之溶劑DMSO(vehicle)，與未添加時(NC)同樣未觀察到變化。另一方面，於PA/OA存在下添加有IJH-SONE68菌株所產生多醣類樣本(EPS)(SONE68)時，觀察到脂肪酸攝入細胞內之現象係與EPS濃度相依性地受到抑制，脂肪累積受到抑制。另，就其抑制程度而言，IJH-SONE68菌株所產生之多醣類樣本較SN35N菌株所產生之多醣類樣本 (EPS)(SN35N)更高。

由以上結果明顯得知，IJH-SONE68菌株所產生之多醣類具有脂肪累積抑制作用。

實施例4

IJH-SONE68菌株之抗肥胖作用及脂肪累積抑制作用

使用攝取高脂肪食餌肥胖模式小鼠，針對IJH-SONE68菌株之抗肥胖活性及脂肪累積抑制活性進行評價。結果明確得知，藉由攝取經IJH-SONE68菌株發酵之鳳梨果汁發酵液，攝取高脂肪食餌肥胖模式小鼠之體重增加與內臟脂肪累積顯著受到抑制。

1.試驗方法

本試驗中使用C57BL/6Jcl(SPF)雄性小鼠。搬入7週齡之小鼠，每飼育籠飼養5隻。使用一般飼料(MF，Oriental Yeast Co.,Ltd.製)進行1週馴化飼育後，每5隻分為一組(A組~E組)，將食餌變更為高脂肪食餌(Research Diets,Inc.，#D12492)，開始誘導肥胖。另，飼料給餌時，預先以木槌將高脂肪食餌粉碎成黏土狀，使用玻璃製粉末用給餌器(KN-675-4A)，以每次120g之方式充填給餌，間隔1週更換。此外，投予樣本係在充填至給餌器前預先與高脂肪食餌均勻混合。全部組別皆使其自由攝取食餌及飲用水。投予樣本使用IJH-SONE68菌株發酵鳳梨果汁原液及其稀釋等，該IJH-SONE68菌株發酵鳳梨果汁原液係將以100%鳳梨果汁(含1w/v%燒酒蒸餾残渣)培養IJH-SONE68菌株48小時所得發酵液於121℃、20分鐘條件下實施滅菌處理來獲得。小鼠A組~F組之投予樣本的詳情如下。

A組：令其同時攝取高脂肪食餌與IJH-SONE68菌發酵鳳梨果汁原液之組(令其攝取於高脂肪食餌120g中添加、混合發酵鳳梨果汁原液7mL之物的組)。

B組：令其同時攝取高脂肪食餌與IJH-SONE68菌株發酵鳳梨果汁10倍稀釋液之組(令其攝取於高脂肪食餌120g中添加、混合有經滅菌蒸餾水稀釋10倍之發酵鳳梨果汁原液的稀釋液7mL之物的組)。

C組：令其同時攝取高脂肪食餌與IJH-SONE68菌株發酵鳳梨果汁100倍稀釋液之組(令其攝取於高脂肪食餌120g中添加、混合有經滅菌蒸餾水稀釋100倍之發酵鳳梨果汁原液的稀釋液7mL之物的組)。

D組：令其同時攝取高脂肪食餌與未發酵之鳳梨果汁之組(令其攝取於高脂肪食120g中添加、混合有7mL鳳梨果汁之物的組)。

E組：僅以高脂肪食餌飼育之組(陽性對照組)(令其攝取於高脂肪食餌120g中添加混合有7mL滅菌蒸餾水之物的組)。

F組：僅以一般飼料飼育之組(陰性對照組)

將食餌內容由高脂肪食餌變更為上述A組~F組之各食餌後，繼續飼育12週。另，飼育期間中每週測定體重。飼育期間結束後，使小鼠吸入異氟醚麻醉而安樂死，採取內臟脂肪並測定其重量。各測定數據之顯著性檢定使用非成對t檢定，危險率(p值)小於0.05時判定「具顯著差異」。

2.試驗結果與考察

茲將上述A組~F組之各組每週體重增加量(從飼育開始時間點(0週)之體重起算的增加量)之變遷顯示於表4及表5(表4顯示平均體重增加量(g)，表5顯示其標準誤差(SE))，其等圖表化所成之物則示於圖6。此外，將飼育最末週(12週)之各組體重增加量之平均值顯示於表6，其圖表化所成之物則示於圖7。各數據係以平均值±標準誤差表示，組間之顯著性檢定使用Tukey-Kramer法，危險率(p值)小於0.05即判定具顯著差異(以下記載之圖6及7中僅就與陽性對照組之顯著差異予以記述)。

[表5]

由表4~6及圖6~7可知，相較於陰性對照組(F組)，確認陽性對照組(E群)因攝取高脂肪食餌而有體重顯著增加之情況(p<0.01)。得知相較於陽性對照組，攝取發酵鳳梨果汁之組中，攝取原液及10倍稀釋液之組(A組及B組)因攝取高脂肪食餌所致之體重上昇現象明顯受到抑制(均p<0.05)。此外，攝取稀釋100倍之發酵果汁時(C組)，雖然效果減弱，增加量仍較陽性對照組少。另一方面，攝取未發酵鳳梨果汁之組(D群)觀察到體重較陽性對照組更為增加的情況，但未有明顯差異。

接著，將飼育最末週(12週)時間點之各組小鼠內臟脂肪重量測定結果顯示於表7及圖8。

由表7及圖8可知，相較於陰性對照組，確認陽性對照組因攝取高脂肪食餌而有內臟脂肪量顯著增加之情況(p<0.01)。此外，相較於陽性對照組，攝取發酵鳳梨果汁之組中，攝取10倍稀釋液時(B組)雖可見內臟脂肪量增加之顯著抑制(p<0.01)，但攝取原液(A組)則止於抑制傾向(p<0.1)。另一方面，攝取稀釋100倍之發酵果汁時(C組)則效果減弱。更甚者，攝取未發酵鳳梨果汁之組(D組)與體重同樣地觀察到較陽性對照組更增加之情況，但未有顯著差異。

由以上結果可明顯得知，藉由攝取稀釋10倍之IJH-SONE68菌株發酵鳳梨果汁，受攝取高脂肪食餌所誘導之體重增加及內臟脂肪量增加皆顯著受到抑制。攝取IJH-SONE68菌株發酵鳳梨果汁原液及100倍稀釋液則確認其效果有減弱的情況。可以想見，100倍稀釋液的情況是肇因於與小鼠之機能性相關的成分被稀釋。由於攝取未發酵鳳梨果汁時體重增加至陽性對照組以上，推測IJH-SONE68菌株發酵鳳梨果汁原液的情況有可能是源自殘留於鳳梨果汁中之糖分。

由以上詳細說明可明確得知，若依本發明，可提供下列發明。

[1]一種用以抑制脂肪累積之組成物，係以屬於副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei)之乳酸菌菌體、其培養物或發酵物或者其所產生之多醣類作為有效成分。

[2]如上述[1]之組成物，其用以預防或改善肥胖。

[3]如上述[1]之組成物，其用以預防或改善脂肪肝或肝功能衰竭。

[4]如上述[1]至[3]中任一項之組成物，其中乳酸菌係源自無花果之乳酸菌。

[5]如上述[1]至[4]中任一項之組成物，其中乳酸菌為副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei)IJH-SONE68菌株(寄存編號NITE BP-02242)或與其同等之乳酸菌。

[6]如上述[1]至[5]中任一項之組成物，其中培養物或發酵物係於鳳梨屬植物果汁存在下培養乳酸菌或使其發酵所得之培養物或發酵物。

[7]如上述[1]至[5]中任一項之組成物，其中多醣類為中性多醣體，該中性多醣體具有N-乙醯葡萄糖胺藉α-1,6鍵而連結之結構。

[8]如上述[1]至[5]中任一項之組成物，其中多醣類為主要由葡萄糖與甘露糖構成之酸性多醣體。

[9]如上述[1]至[8]中任一項之組成物，其中組成物為飲食品組成物。

[10]如上述[9]之組成物，其中飲食品為飲料、機能性食品、發酵食品或補充劑。

[11]如上述[1]至[8]中任一項之組成物，其中組成物為醫藥組成物。

[12]如上述[1]至[8]中任一項之組成物，其中組成物為飼料組成物。

[13]一種Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株與屬於副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei)之乳酸菌的菌體、其培養物或發酵物或者其所產生之多醣類的用途，係供用作用以抑制脂肪累積之組成物的有效成分。

[14]如上述[13]之用途，其係用以預防或改善肥胖的組成物。

[15]如上述[13]之用途，其係用以預防或改善脂肪肝或肝功能衰竭之組成物。。

[16]如上述[13]至[15]中任一項之用途，其中乳酸菌為源自無花果之乳酸菌。

[17]如上述[13]至[16]中任一項之用途，其中乳酸菌為Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株(寄存編號NITE BP-02242)或與其同等之乳酸菌。

[18]如上述[13]至[17]中任一項之用途，其中培養物或發酵物係於鳳梨屬植物果汁存在下培養乳酸菌或使其發酵所得之培養物或發酵物。

[19]如上述[13]至[17]中任一項之用途，其中多醣類為中性多醣體，該中性多醣體具有N-乙醯葡萄糖胺藉α-1,6鍵而連結之結構。

[20]如上述[13]至[17]中任一項之用途，其中多醣類為主要由葡萄糖與甘露糖構成之酸性多醣體。

[21]如上述[13]至[20]中任一項之用途，其中組成物為飲食品組成物。

[22]如上述[21]之用途，其中飲食品為飲料、機能性食品、發酵食品或補充劑。

[23]如上述[13]至[20]中任一項之用途，其中組成物為醫藥組成物。

[24]如上述[13]至[20]中任一項之用途，其中組成物為飼料組成物。

[25]一種於對象上抑制脂肪累積之方法，包含：將包含Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株與屬於副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei)之乳酸菌的菌體、其培養物或發酵物或者其所產生之多醣類作為有效成分之組成物施用於需要其之對象。

[26]如上述[25]之方法，其預防或改善肥胖。

[27]如上述[25]之方法，其預防或改善脂肪肝或肝功能衰竭。

[28]如上述[25]至[27]中任一項之方法，其中乳酸菌為源自無花果之乳酸菌。

[29]如上述[25]至[28]中任一項之方法，其中乳酸菌為Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株(寄存編號NITE BP-02242)或與其同等之乳酸菌。

[30]如上述[25]至[29]中任一項之方法，其中培養物或發酵物係於鳳梨屬植物果汁存在下培養乳酸菌或使其發酵所得之培養物或發酵物。

[31]如上述[25]至[30]中任一項之方法，其中多醣類為中性多醣體，該中性多醣體具有N-乙醯葡萄糖胺藉α-1,6鍵而連結之結構。

[32]如上述[25]至[30]中任一項之方法，其中多醣類為主要由葡萄糖與甘露糖構成之酸性多醣體。

[33]如上述[25]至[32]中任一項之方法，其中組成物為飲食品組成物。

[34]如上述[33]之方法，其中飲食品為飲料、機能性食品、發酵食品或補充劑。

[35]如上述[25]至[32]中任一項之方法，其中組成物為醫藥組成物。

[36]如上述[25]至[32]中任一項之方法，其中組成物為飼料組成物。

產業上之可利用性

如上述詳細說明，本發明之組成物對於抑制脂肪累積甚有效，可供用於預防或改善肥胖，又可供用於預防或改善脂肪肝或肝功能衰竭。本發明之組成物可用作用以預防或改善肥胖、脂肪肝或肝功能衰竭之飲食品、醫藥品及飼料。再者，因本發明之組成物係以屬於副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei)之乳酸菌菌體、其培養物或發酵物或者其所產生之多醣類作為有效成分，具高安全性而可長期施用，又可價廉地大量供給，其有用性及實用性極高。

【生物材料寄存】

JP日本獨立行政法人製品評價技術基盤機構專利微生物中心2017年5月26日NITE BP-02242

(無)

Claims

一種副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei)IJH-SONE68菌株(寄存編號NITE BP-02242)之乳酸菌之菌體、其培養物或發酵物或者其所產生之多醣類的用途，係用來製造用以抑制脂肪累積之組成物。
如請求項1之用途，其用以預防或改善肥胖。
如請求項1之用途，其用以預防或改善脂肪肝或肝功能衰竭。
如請求項1之用途，其中培養物或發酵物係於鳳梨屬植物果汁存在下培養乳酸菌或以乳酸菌進行發酵所得培養物或發酵物。
如請求項1之用途，其中多醣類為中性多醣體，該中性多醣體具有N-乙醯葡萄糖胺藉α-1,6鍵而連結之結構。
如請求項1之用途，其中多醣類為主要由葡萄糖與甘露糖構成之酸性多醣體。
如請求項1之用途，其中組成物為飲食品組成物。
如請求項7之用途，其中飲食品為飲料、機能性食品、發酵食品或補充劑(supplement)。
如請求項1之用途，其中組成物為醫藥組成物。
如請求項1之用途，其中組成物為飼料組成物。