TWI797769B

TWI797769B - 副乾酪乳酸桿菌lm-141分離株及其用途

Info

Publication number: TWI797769B
Application number: TW110137219A
Authority: TW
Inventors: 謝豐欽; 吳慶軒; 林志傑
Original assignee: 樂牧生技股份有限公司
Priority date: 2021-10-06
Filing date: 2021-10-06
Publication date: 2023-04-01
Also published as: TW202315939A; JP7362084B2; JP2023055601A

Abstract

本發明揭示一株副乾酪乳酸桿菌LM-141分離株，它以寄存編號BCRC 911037被寄存於財團法人食品工業發展研究所(FIRDI)的生物資源保存及研究中心(BCRC)。該副乾酪乳酸桿菌LM-141分離株可被用來預防和/或治療代謝症候群關聯性疾病。

Description

副乾酪乳酸桿菌LM-141分離株及其用途

本發明是有關於一株副乾酪乳酸桿菌( Lactobacillus paracasei) LM-141分離株，它以寄存編號BCRC 911037被寄存於財團法人食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute, FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center, BCRC)。該副乾酪乳酸桿菌LM-141分離株可被用來預防和/或治療代謝症候群關聯性疾病(metabolic syndrome-related disorders)。

當人體攝取過量的高油脂食物並缺乏足夠的運動時，過多的熱量會以脂肪的形式儲存於脂肪組織(adipose tissue)中而形成體脂肪(body fat)。當人體體內的體脂肪不正常地累積或是脂肪代謝(fat metabolism)出現異常時，就可能會引發各種代謝症候群關聯性疾病(metabolic syndrome-related disorders)，包括：肥胖(obesity)、高三酸甘油脂血症(hypertriglyceridemia)、糖尿病(diabetes mellitus)、高血壓(hypertension)以及心血管疾病(cardiovascular disease)等。

目前臨床上用於預防和/或治療代謝症候群關聯性疾病的方法，除了控制飲食與維持運動習慣之外，還包括服用抗肥胖藥物(anti-obesity medication)、降血糖藥物(hypoglycemic agents)或降血脂藥物(hypolipidemic agents)。然而，長期服用這些藥物不但無法達到所欲的療效，更可能會導致患者產生嚴重的副作用(side effects)。因此，本領域的相關研究人員皆致力於開發可以有效地預防和/或治療代謝症候群關聯性疾病並且不會產生非所欲的副作用的藥物。

乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)是屬於一般被公認為安全的(generally recognized as safe, GRAS)並且是為人所熟悉與廣泛使用的益生菌(probiotics)。常見的乳酸菌包括：乳酸桿菌屬( Lactobacillus)、雙叉桿菌屬( Bifidobacterium)、芽孢桿菌屬( Bacillus)、乳球菌屬( Lactococcus)、腸球菌屬( Enterococcus)以及鏈球菌屬( Streptococcus)等。

已有研究指出，副乾酪乳酸桿菌( Lactobacillus paracasei)(又被稱為 Lacticaseibacillus paracasei)具有抗肥胖以及降血脂等功效。例如，在Tanida M. et al.(2008), Obes. Res. Clin. Pract., doi: 10.1016/j.orcp.2008.04.003中，Tanida M.等人藉由對帶有高脂肪飼料(HFD)-誘發的肥胖[high fat diet (HFD)-induced obesity]的大鼠投予副乾酪乳酸桿菌ST11而發現到，副乾酪乳酸桿菌ST11能夠有效地減輕大鼠的體重，並減少其腹部的脂肪重量。

雖然已存在有上述文獻報導，本技藝中仍然存在有一需要去篩選出可以有效預防和/或治療代謝症候群關聯性疾病的微生物以供產業界之所需。

發明概要

於本發明中，申請人分離出一株乳桿菌分離株並經由特徵鑑定而被歸屬於副乾酪乳酸桿菌( Lactobacillus paracasei)，它被申請人命名為“副乾酪乳酸桿菌LM-141”，並已被寄存於國內寄存機構。副乾酪乳酸桿菌LM-141經由活體內( in vivo)實驗而被證實對於帶有高脂肪飼料(HFD)-誘發的肥胖[high fat diet (HFD)-induced obesity]的大鼠具有減重、降低體脂肪(body fat)與血糖、改善葡萄糖耐受性(glucose tolerance)與胰島素抗性(insulin resistance)、減緩血脂異常(dyslipidemia)與肝臟脂肪堆積的效用。而基於上述的有利生物活性，申請人認為：副乾酪乳酸桿菌LM-141具有發展成為預防和/或治療代謝症候群關聯性疾病(metabolic syndrome-related disorders)之藥物的高潛力。

於是，在第一個方面，本發明提供一種副乾酪乳酸桿菌LM-141，它以寄存編號BCRC 911037被寄存於財團法人食品工業發展研究所(FIRDI)的生物資源保存及研究中心(BCRC)。

在第二個方面，本發明提供一如上所述的副乾酪乳酸桿菌LM-141供應用於製備一用來預防和/或治療代謝症候群關聯性疾病之組成物的用途。

在第三個方面，本發明提供一種用於治療一具有或被懷疑具有代謝症候群關聯性疾病之個體的方法，其包括對該個體投予一如上所述的副乾酪乳酸桿菌LM-141。

發明的詳細說明

要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。

為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。

除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。

本發明提供一種副乾酪乳酸桿菌( Lactobacillus paracasei) LM-141，其以寄存編號BCRC 911037被寄存於財團法人食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)。

本發明亦提供一如上所述的副乾酪乳酸桿菌LM-141供應用於製備一用來預防和/或治療代謝症候群關聯性疾病(metabolic syndrome-related disorders)之組成物的用途。

如本文中所使用的，術語“代謝症候群(metabolic syndrome)”意指一個體因慢性代謝異常而導致一或多種關聯性疾病共同發生的情形。

依據本發明，該代謝症候群關聯性疾病可包括，但不限於：代謝症候群本身；肥胖(obesity)；高血糖症(hyperglycemia)；高胰島素血症(hyperinsulinemia)；糖尿病(diabetes mellitus)[包括第2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM]及其所引起的併發症(complications)[諸如，糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy)、糖尿病白內障(diabetic cataract)、糖尿病神經病變(diabetic neuropathy)、糖尿病腎病變(diabetic nephropathy)以及糖尿病心肌病變(diabetic cardiomyopathy)等]；血脂異常(dyslipidemia)[包括高血脂症(hyperlipidemia)、高三酸甘油酯血症(hypertriglyceridemia)、高膽固醇血症(hypercholesterolemia)以及高脂蛋白血症(hyperlipoproteinemia)]；高血壓(hypertension)；心血管疾病(cardiovascular diseases, CVDs)[諸如，冠狀動脈疾病(coronary artery diseases, CADs)、心肌梗塞(myocardial infarction)、中風(stroke)、心臟衰竭(heart failure)、心絞痛(angina pectoris)以及心律不整(cardiac arrhythmias)等]；脂肪肝(fatty liver)[又稱肝臟脂肪變性(hepatic steatosis)，包括急性脂肪肝(acute fatty liver)、慢性脂肪肝(chronic fatty liver)、大囊泡性脂肪肝(macrovesicular fatty liver)、小囊泡性脂肪肝(microvesicular fatty liver)，以及非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)]；肝纖維化(hepatic fibrosis)；以及肝硬化(cirrhosis)。

較佳地，該代謝症候群關聯性疾病是肥胖。

較佳地，該代謝症候群關聯性疾病是T2DM。

如本文中所使用的，術語“治療(treating)”或“治療(treatment)”代謝症候群關聯性疾病意指該疾病的嚴重性(severity)或該疾病的症狀(symptom)被減少(reduced)，或是該疾病被部分地(partially)或完全地(entirely)消除(eliminated)。

如本文中所使用的，術語“預防(preventing)”或“預防(prevention)”代謝症候群關聯性疾病意指一個體在還沒有被診斷具有該疾病時，消除(eliminate)或減少(reduce)該疾病的發生率(incidence)，以及減緩(slow)、延遲(delay)、控制(control)或減少(decrease)該疾病的可能性(likelihood)或機率(probability)。

依據本發明，副乾酪乳酸桿菌LM-141可以是活菌或死菌、經濃縮的(concentrated)或未經濃縮的(non-concentrated)、液態(liquid)、糊狀(paste)、半固態(semi-solid)，或固態(solid)[例如，丸(pellet)、細顆粒(granule)或粉末(powder)]，並且可以是經熱去活的(heat-inactivated)、經冷凍的(frozen)、經乾燥的(dried)，或經冷凍-乾燥的(freeze-dried)[例如，可呈冷凍乾燥形式或噴霧/流化床乾燥(spray/fluid bed dried)形式]。在本發明的一個較佳具體例中，副乾酪乳酸桿菌LM-141是呈活菌的形式存在。

依據本發明，該組成物可以是一食品組成物(food composition)，例如呈一食品添加物(food additive)的形式，其可以被添加至一可食性材料(edible material)中以製備一供人類或動物食用的食品產品。依據本發明，該食物產品的實例可包括，但不限於：流體乳品(fluid milk products)，例如牛奶(milk)以及濃縮牛奶(concentrated milk)；發酵乳品(fermented milk)，例如優酪乳(yogurt)、酸乳(sour milk)以及冷凍優格(frozen yogurt)；奶粉(milk powder)；冰淇淋(ice cream)；乳酪(cream cheeses)；乾酪(dry cheeses)；豆奶(soybean milk)；乳酸菌發酵飲料(lactic acid bacteria fermented beverages)，例如發酵豆奶(fermented soybean milk)；蔬果汁(vegetable-fruit juices)；果汁(fruit juices)；運動飲料(sports drinks)；甜點(confectionery)；果凍(jelly)；糖果(candies)；嬰兒食品(infant food)，例如嬰兒乳(infant formula)；保健食品(health foods)，例如中草藥保健品；動物飼料(animal feeds)；以及膳食補充品(dietary supplements)。

依據本發明，該組成物可以是一藥學組成物(pharmaceutical composition)。

依據本發明，該藥學組成物可呈一適合於非經腸道投藥(parenteral administration)、口服投藥(oral administration)或局部投藥(topical administration)之劑型(dosage form)。較佳地，該藥學組成物是呈一供口服投藥的劑型。

依據本發明，該藥學組成物可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之藥學上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，該藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，該藥學組成物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道投藥的劑型[包括注射品(injection)，例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]，且以一選自於由下列所構成的群組中的途徑來投藥：腹膜內注射(intraperitoneal injection)、胸膜內注射(intrapleural injection)、肌肉內注射(intramuscular injection)、靜脈內注射(intravenous injection)、動脈內注射(intraarterial injection)、關節內注射(intraarticular injection)、滑液內注射(intrasynovial injection)、椎管內注射(intrathecal injection)、顱內注射(intracranial injection)、表皮內注射(intraepidermal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、皮內注射(intradermal injection)、病灶內注射(intralesional injection)、以及舌下投藥(sublingual administration)。

依據本發明，該藥學組成物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於口服投藥的劑型，這包括，但不限於：無菌的粉末、錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pellet)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)以及類似之物。

依據本發明，該藥學組成物亦可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於局部地施用於皮膚上的外部製劑(external preparation)，這包括，但不限於：乳劑(emulsion)、凝膠(gel)、軟膏(ointment)、乳霜(cream)、貼片(patch)、擦劑(liniment)、粉末(powder)、氣溶膠(aerosol)、噴霧(spray)、乳液(lotion)、乳漿(serum)、糊劑(paste)、泡沫(foam)、滴劑(drop)、懸浮液(suspension)、油膏(salve)以及繃帶(bandage)。

本發明亦提供一種用於治療一具有或被懷疑具有代謝症候群關聯性疾病之個體的方法，其包括對該個體投予一如上所述的副乾酪乳酸桿菌LM-141。

如本文中所使用的，術語“投予(administering)”以及“投藥(administration)”可被交換地使用，並且意指藉由任何合適的途徑來對一個體導入(introducing)、提供(providing)或遞送(delivering)一預定的活性成分以執行其預期的效用。

如本文中所使用的，術語“個體(subject)”意指任何感興趣的哺乳類動物，諸如人(humans)、猴子(monkeys)、牛(cows)、綿羊(sheep)、馬(horses)、豬(pigs)、山羊(goats)、狗(dogs)、貓(cats)、小鼠(mice)以及大鼠(rats)。

依據本發明，副乾酪乳酸桿菌LM-141的投藥劑量與投藥次數會視下列因素而變化：要被治療的疾病之嚴重性，投藥途徑，以及要被治療的個體之年齡、身體狀況與反應。一般而言，副乾酪乳酸桿菌LM-141可呈單一劑量或是分成數個劑量的形式而被非經腸道地、口服地或局部地投藥。 較佳實施例之詳細說明

本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。 實施例 一般實驗材料： 1. 實驗動物：

在下面的實施例中所使用的雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠(5週大)是購自於樂斯科生物科技股份有限公司(BioLasco Taiwan Co., Ltd)。所有的實驗動物被飼養於一個光照與黑暗各為12小時、室溫維持在25±1℃的獨立空調的動物房內，而且水分與飼料被充分地供給。有關實驗動物的飼養環境、處理以及一切實驗程序均符合國家衛生研究院(National Institutes of Health, NIH)的實驗動物飼養管理及使用規範(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)。 2. 在下面的實施例中所使用的一般飼料(normal diet)與高脂肪飼料(high fat diet, HFD)具有下面表1所示的配方。表1. 一般飼料與高脂肪飼料的配方

成分	一般飼料	高脂肪飼料
用量(g/kg)
酪蛋白(Casein)	200	232
L-胱胺酸(L-Cystine)	3.0	3.0
玉米澱粉(Corn Starch)	397.48	137
麥芽糊精(Maltodextrin)	132	150
蔗糖(Sucrose)	100	162.58
纖維素(Cellulose)	50	50
礦物質混合物(Mineral Mix)(AIN-93)	35	40.60
維生素混合物(Vitamin Mix)(AIN-93)	10	16.24
膽鹼酒石酸氫鹽(Choline Bitartrate)	2.5	5
三級丁氫醌(Tert-butylhydroquinone)	0.014	0.04
大豆油(Soybean oil)	70	40
D,L-甲硫胺酸(D,L-Methionine)	－	3.5
膽固醇(Cholesterol)	－	1.9
二鹽基性的磷酸鈣(Calcium phosphate dibasic)	－	4.64
豬油(Lard)	－	153.5

一般實驗方法： 1. 統計學分析(statistical analysis)：

在下面的實施例中，各組的實驗數據是以“平均值(mean)±平均值的標準誤差(standard error of the mean, SEM)”來表示。所有數據是採用Sigma Plot統計軟體(version 10.0, Systat Software Inc.)來進行統計分析，並藉由史徒登氏t-試驗(Student’s t-test)來作分析，俾以評估各組之間的差異性。若所得到的統計比對結果是 p＜0.05，代表有統計學顯著性(statistical significance)。 實施例 1. 乳桿菌分離株 LM-141 的篩選與特徵鑑定 A、 乳桿菌分離株 LM-141 的來源與分離：

申請人使用台式泡菜(購自於台灣傳統市場)作為樣品來源並且利用Lactobacilli MRS瓊脂(Lactobacilli MRS Agar)(BD Difco)來進行乳桿菌的分離與篩選，而得到1株乳桿菌分離株LM-141。

為了確認乳桿菌分離株LM-141所屬的菌種，乳桿菌分離株LM-141被拿來進行下面第B項的分析。 B、 16S rDNA 序列分析 (16S rDNA sequence analysis) ：

有關16S rDNA序列分析是委託國立嘉義大學食品科學系暨研究所(Department of Food Science at National Chiayi University)的呂英震教授的研究室來代為進行。簡言之，以乳桿菌分離株LM-141的基因組DNA作為模板(template)，並使用一組針對細菌的16S rDNA基因而設計之具有下面所示的核苷酸序列的引子對(primer pair)前向引子F1與反向引子R1來進行聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)，俾以擴增出乳桿菌分離株LM-141的16S rDNA片段。有關PCR的反應條件被顯示於下面表2中。前向引子F1 5’-agagtttgatcctggctcag-3’ (序列辨識編號：1) 反向引子R1 5’-gtattaccgcggctgctg-3’ (序列辨識編號：2) 表2. PCR的反應條件

內容物	體積(µL)
乳桿菌分離株LM-141的基因組DNA	1
前向引子F1 (10 µM)	2
反向引子R1 (10 µM)	2
Taq PCR Master Mix	10
去離子水	35
操作條件：在95℃下進行變性反應(denaturation)歷時5分鐘，接而進行36個循環如下：在94℃下進行變性反應歷時60秒、在36℃下進行引子黏合(primer annealing)歷時60秒，以及在72℃下進行延伸反應(extension)歷時60秒；最後，在72℃下進行延長反應(elongation)歷時5分鐘。

於完成PCR之後，藉由1.5%瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis)來確認有否得到一大小約為550 bp的PCR擴增產物，並從凝膠回收純化該經確認的PCR產物。

之後，經由定序分析而得到乳桿菌分離株LM-141的16S rDNA序列(序列辨識編號：3)，並進一步經與NCBI網站中的基因資料庫比對後發現，乳桿菌分離株LM-141的16S rDNA序列與副乾酪乳酸桿菌( Lactobacillus paracasei)的16S rDNA序列[Genbank登錄編號(accession number)：NC_014334.2]之間具有97%的相似性。

依據上面的實驗結果，申請人認為：本發明的乳桿菌分離株LM-141是一種副乾酪乳酸桿菌分離株，因而將它命名為副乾酪乳酸桿菌LM-141，並且已於西元2021年1月29日以寄存編號BCRC 911037寄存於台灣的食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute, FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center, BCRC)(300新竹市食品路331號，台灣)。 實施例 2. 副乾酪乳酸桿菌 LM-141 在改善肥胖 - 相關的代謝症候群 (obesity-related metabolic syndrome) 上的效用評估 實驗材料： 1. 副乾酪乳酸桿菌LM-141的試驗菌液之製備：

將上面實施例1中所得到的副乾酪乳酸桿菌LM-141接種至MRS肉湯培養基(MRS Broth)(BD Difco)中，並於37℃下進行培養歷時12小時。之後，所得到的培養物在4℃下以4,000 rpm進行離心歷時10分鐘，接著倒除上澄液，而沉澱物(pellets)以適量的PBS予以洗滌，然後以適量之滅菌水予以散浮並調整成分別具有2×10 ⁷CFU/mL與2×10 ⁹CFU/mL的細菌濃度(以平板計數培養基來進行菌數計數)，藉此而分別得到副乾酪乳酸桿菌LM-141的試驗菌液1與試驗菌液2。 實驗方法： A、 肥胖的誘發與副乾酪乳酸桿菌 LM-141 的投藥：

首先，將雄性SD大鼠隨機地分成4組，其中包括1個正常對照組(n＝6)、1個病理對照組(n＝6)以及2個實驗組(每組n＝8)(亦即實驗組1與實驗組2)。接著，透過口服胃管灌食法(oral gavage)的方式，對實驗組1與實驗組2的大鼠分別投藥以1 mL之在上面“實驗材料”的第1項當中所得到的副乾酪乳酸桿菌LM-141的試驗菌液1與試驗菌液2。至於正常對照組以及病理對照組的大鼠則被投藥以1 mL的逆滲透水。各組大鼠每天被投藥一次，投藥時間總共歷時14週。

在開始投藥之後的第2週起，病理對照組、實驗組1與實驗組2的大鼠被餵食以高脂肪飼料，而正常對照組的大鼠則是被餵食以一般飼料，總共歷時12週。

另外，在開始投藥之前以及在開始投藥之後的第14週結束之時，分別測量各組大鼠的體重。 B、 生物樣品的製備：

在開始投藥之後的第4與9週結束之時以及在第14週完成體重的測量之後，令各組大鼠經歷16小時的禁食(fasting)，然後藉由靜脈穿刺採血(venipuncture bleeding)而從各組大鼠的尾部靜脈(caudal vein)來收集血液，由此所得到的血液樣品被拿來進行下面第F項的實驗。另外，從在第14週所得到的血液樣品中取出一部分，並於4℃下以4,000 g進行離心歷時10分鐘，由此所得到的血清樣品被拿來進行下面第G至J項的實驗。

此外，在第14週完成血液樣品的收集之後，透過口服胃管灌食法的方式，對各組大鼠投予葡萄糖溶液(廠牌為Riedel-de Haën，貨號為16325)(劑量為2 g/kg)，並在投予葡萄糖溶液之前(亦即第0分鐘)以及投予葡萄糖溶液之後的第15與30分鐘藉由靜脈穿刺採血而從各組大鼠的尾部靜脈來收集血液，由此所得到的血液樣品被拿來進行下面第E項的實驗。之後，藉由CO ₂來犧牲各組大鼠，接著取出各組大鼠的脂肪組織(adipose tissue)[亦即，附睪周邊脂肪(epididymal fat)以及腎臟周邊脂肪(perirenal fat)]以及肝臟組織(liver tissue)並將它們分別拿來進行下面第D與K項的實驗。 C、 體重增加比率 (body weight gain ratio) 的測定：

有關體重增加比率是藉由將各組大鼠在開始投藥之前以及在開始投藥之後的第14週結束之時所測得的體重分別代入下列公式(1)而被計算出：公式 (1) ： A ＝ (B-C)/ C其中：A＝體重增加比率 B＝在開始投藥之後的第14週結束之時所測得的體重(g) C＝在開始投藥之前所測得的體重(g)

之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 D、 體脂肪百分比 (body fat percentage) 的測定：

將在上面第B項中所得到之各組大鼠的脂肪組織分別拿來秤重，藉此而得到各組大鼠的體脂肪重量。

有關體脂肪百分比(%)是藉由將各組大鼠的體脂肪重量以及各組大鼠在開始投藥之後的第14週結束之時所測得的體重分別代入下列公式(2)而被計算出：公式 (2) ： D ＝ ( E/F ) × 100其中：D＝體脂肪百分比(%) E＝體脂肪重量(g) F＝在開始投藥之後的第14週結束之時所測得的體重(g)

之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 E、 口服葡萄糖耐受性試驗 (oral glucose tolerance test) ：

在上面第B項中所得到之各組大鼠在投予葡萄糖溶液之前(亦即第0分鐘)以及投予葡萄糖溶液之後的第15與30分鐘所收集到的3個血液樣品是使用一Rightest GM550血糖偵測系統(Rightest GM550 blood glucose monitoring system)(Bionime, Taichung, Taiwan)來進行血液葡萄糖濃度(mg/dL)的測定，繼而將所測得的血液葡萄糖濃度相對於時間來作圖，而繪製出一血糖濃度-時間曲線(blood glucose concentration-time curve)。

之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 F、 禁食血糖位準 (fasting blood sugar level) 的測定：

在上面第B項中所得到之各組大鼠在開始投藥之後的第4、9以及14週結束之時所收集到的血液樣品是使用一Rightest GM550血糖偵測系統來進行禁食血糖位準(mg/dL)的測定。

之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 G、 恆定模式評估胰島素抗性 (HOMA-IR) 指數 [homeostatic model assessment insulin resistance (HOMA-IR) index] 的測定：

在上面第B項中所得到之各組大鼠的血清樣品是依據製造商的操作指南使用大鼠胰島素ELISA套組(Rat Insulin ELISA kit)(Mercodia AB)來進行胰島素位準(mIU/L)的測定。有關HOMA-IR指數是藉由將所測得之各組大鼠的胰島素位準以及將在上面第F項中所測得的禁食血糖位準代入下列公式(3)而被計算出：公式 (3) ： G ＝ (H ×I)/405其中：G＝HOMA-IR指數 H＝禁食血糖位準(mg/dL) I＝胰島素位準(mIU/L)

之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 H、 血清總膽固醇 (total cholesterol, TC) 以及三酸甘油酯 (triglyceride, TG) 濃度的測定：

在上面第B項中所得到之各組大鼠的血清樣品是委託財團法人國家實驗研究院國家實驗動物中心(National Laboratory Animal Center, R.O.C.)並依據製造商的操作指南使用一HITACHI 7080全自動生化分析儀(HITACHI 7080 automatic biochemical analyzer)來進行血清總膽固醇以及三酸甘油酯濃度(mg/dL)的測定。

之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 I、 低密度脂蛋白 / 高密度脂蛋白 (LDL/HDL) 比率 [low-density lipoprotein / high-density lipoprotein (LDL/HDL) ratio] 的測定：

在上面第B項中所得到之各組大鼠的血清樣品是委託財團法人國家實驗研究院國家實驗動物中心並依據製造商的操作指南使用一HITACHI 7080全自動生化分析儀來進行血清低密度脂蛋白以及高密度脂蛋白濃度(mg/dL)的測定。

有關低密度脂蛋白/高密度脂蛋白比率(LDL/HDL ratio)是藉由將所測得之各組大鼠的血清低密度脂蛋白以及高密度脂蛋白濃度(mg/dL)代入下列公式(4)而被計算出：公式 (4) ： J ＝ K/L其中：J＝LDL/HDL比率 K＝血清低密度脂蛋白濃度(mg/dL) L＝血清高密度脂蛋白濃度(mg/dL)

之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 J、 天門冬胺酸轉胺酶 / 丙胺酸轉胺酶 (AST/ALT) 比率 [ aspartate aminotransferase / alanine aminotransferase (AST/ALT) ratio] 的測定：

在上面第B項中所得到之各組大鼠的血清樣品是委託財團法人國家實驗研究院國家實驗動物中心並依據製造商的操作指南使用一HITACHI 7080全自動生化分析儀來進行血清天門冬胺酸轉胺酶以及丙胺酸轉胺酶濃度(mg/dL)的測定。

有關天門冬胺酸轉胺酶/丙胺酸轉胺酶比率(AST/ALT ratio)是藉由將所測得之各組大鼠的血清中天門冬胺酸轉胺酶以及丙胺酸轉胺酶濃度(mg/dL)代入下列公式(5)而被計算出：公式 (5) ： M ＝ N/O其中：M＝AST/ALT比率 N＝血清天門冬胺酸轉胺酶濃度(mg/dL) O＝血清丙胺酸轉胺酶濃度(mg/dL)

之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 K、 肝臟組織的組織病理學檢驗 (histopathological examination) ：

首先，在4℃下以10%福馬林(formalin)來對在上面第B項中所得到之各組大鼠的肝臟組織進行固定處理(fixation)歷時48小時，繼而將一部分經固定的組織樣品浸泡於20%蔗糖水溶液中歷時48小時。之後，將組織樣品以Tissue-Tek ^®O.C.T.複合物(Tissue-Tek ^®O.C.T. Compound)予以包埋(embedding)，繼而進行切片處理，藉此而得到具有一厚度為8 μm的組織切片(tissue sections)。所得到的組織切片以異丙醇(isopropanol)予以洗滌，並藉由使用Oil Red O染色試劑[其是藉由將0.5 g Oil Red O配於100 mL異丙醇中，繼而與蒸餾水以一為3：2 (v/v)的比例混合而被製得]來對組織內累積的油滴(lipid droplets)進行染色。經染色的組織切片是藉由使用一光學顯微鏡(Olympus)並在一為200倍的放大倍率下來進行觀察以及拍照。

之後，將另一部分經固定的組織樣品以石蠟(paraffin)予以包埋，然後進行切片處理，藉此而得到具有一厚度為3 μm的組織切片。所得到的組織切片藉由使用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin)並且依據熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術來進行染色。經染色的組織切片是藉由使用一光學顯微鏡(Olympus)並在一為200倍的放大倍率下來進行觀察以及拍照。 結果： A、 體重增加比率的測定：

本實驗所測得的結果被顯示於下面表3中。表3. 各組大鼠的體重增加比率

組別	體重增加比率
正常對照組	0.54±0.02
病理對照組	0.72±0.01 ^*
實驗組1	0.64±0.01 ^#
實驗組2	0.57±0.01 ^#

^*：當與正常對照組作比較， p＜0.05。 ^#：當與病理對照組作比較， p＜0.01。

從表3可見，與正常對照組相較之下，病理對照組的大鼠的體重增加比率有顯著的增加，這表示HFD會成功地誘發大鼠產生肥胖。而與病理對照組相較之下，各個實驗組的大鼠的體重增加比率都有顯著的降低，特別地，實驗組2的大鼠的體重增加比率是近似於正常對照組所具者。這個實驗結果顯示：本發明的副乾酪乳酸桿菌LM-141具有減輕體重的效用。 B、 體脂肪百分比的測定：

本實驗所測得的結果被顯示於下面表4中。表4. 各組大鼠的體脂肪百分比

組別	體脂肪百分比(%)
正常對照組	2.69±0.14
病理對照組	5.24±0.08 ^***
實驗組1	3.93±0.12 ^##
實驗組2	3.46±0.15 ^##

^***：當與正常對照組作比較， p＜0.001。 ^##：當與病理對照組作比較， p＜0.01。

從表4可見，與正常對照組相較之下，病理對照組的大鼠的體脂肪百分比有顯著的增加，這表示HFD會成功地誘發大鼠產生體脂肪堆積(body fat accumulation)。而與病理對照組相較之下，各個實驗組的大鼠的體脂肪百分比都有顯著的降低。這個實驗結果顯示：本發明的副乾酪乳酸桿菌LM-141具有降低體脂肪的效用。

綜合上面第A與B項的實驗結果可知，本發明的副乾酪乳酸桿菌LM-141能夠有效地降低體重與體脂肪，而可用於對抗肥胖(obesity)。 C、 口服葡萄糖耐受性試驗：

圖1顯示各組大鼠藉由口服葡萄糖耐受性試驗所得到的血糖濃度-時間曲線。從圖1可見，在被投予葡萄糖溶液之後的第0分鐘至第30分鐘內，各組大鼠的血糖濃度皆會隨著時間的增加而呈現上升的情形，其中病理對照組的大鼠的血糖濃度的上升幅度是顯著高於正常對照組所具者，這表示HFD會成功地誘發大鼠產生葡萄糖耐受性不良(impaired glucose tolerance)。而各個實驗組的大鼠的血糖濃度-時間曲線則是逐漸趨近於正常對照組所具者，特別是實驗組2的大鼠。這個實驗結果顯示：本發明的副乾酪乳酸桿菌LM-141具有改善葡萄糖耐受性不良的效用。 D、 禁食血糖位準的測定：

圖2顯示在開始投藥之後的第4、9以及14週結束之時，各組大鼠所測得的禁食血糖位準。從圖2可見，在開始投藥之後的第4週至第14週，病理對照組的大鼠的禁食血糖位準會隨著時間的增加而有顯著的升高，而正常對照組則無明顯的變化，這表示HFD會成功地誘發大鼠產生禁食血糖位準異常的升高。而與病理對照組相較之下，各個實驗組的大鼠的禁食血糖位準都有顯著的降低，並且近似於正常對照組所具者。這個實驗結果顯示：本發明的副乾酪乳酸桿菌LM-141具有降低禁食血糖位準的效用。 E、 恆定模式評估胰島素抗性 (HOMA-IR) 指數的測定：

圖3顯示在開始投藥之後的第14週結束之時，各組大鼠所測得的恆定模式評估胰島素抗性(HOMA-IR)指數。從圖3可見，與正常對照組相較之下，病理對照組的大鼠的HOMA-IR指數有顯著的升高，這表示HFD會成功地誘發大鼠產生胰島素抗性(insulin resistance)。而與病理對照組相較之下，各個實驗組的大鼠的HOMA-IR指數都有明顯的降低，特別是實驗組1的大鼠。這個實驗結果顯示：本發明的副乾酪乳酸桿菌LM-141具有改善胰島素抗性的效用。

綜合上面第C至E項的實驗結果可知，本發明的副乾酪乳酸桿菌LM-141能夠有效地降低血糖以及改善葡萄糖耐受性與胰島素抗性，而可用於減緩高血糖症(hyperglycemia)以及糖尿病(diabetes mellitus)。 F、 血清總膽固醇 (TC) 以及三酸甘油酯 (TG) 濃度的測定：

圖4與圖5分別顯示在開始投藥之後的第14週結束之時，各組大鼠所測得的血清中總膽固醇(TC)以及三酸甘油酯(TG)濃度。從圖4與圖5可見，與正常對照組相較之下，病理對照組的大鼠的血清中的TC與TG濃度都有顯著的升高，這表示HFD會成功地誘發大鼠產生血脂異常(dyslipidemia)。而與病理對照組相較之下，各個實驗組的大鼠的血清中的TC與TG濃度都有明顯的降低，並且近似於正常對照組所具者，特別地，實驗組2的大鼠的血清中的TG濃度更是低於正常對照組所具者。這個實驗結果顯示：本發明的副乾酪乳酸桿菌LM-141具有改善血脂異常的效用。 G、 低密度脂蛋白 / 高密度脂蛋白 (LDL/HDL) 比率的測定：

圖6顯示在開始投藥之後的第14週結束之時，各組大鼠所測得的血清中低密度脂蛋白/高密度脂蛋白(LDL/HDL)比率。從圖6可見，與正常對照組相較之下，病理對照組的大鼠的血清中的LDL/HDL比率有顯著的升高，這表示HFD會成功地誘發大鼠產生脂蛋白代謝異常。而與病理對照組相較之下，各個實驗組的大鼠的血清中的LDL/HDL比率都有顯著的降低，甚至是低於正常對照組所具者。這個實驗結果顯示：本發明的副乾酪乳酸桿菌LM-141具有改善脂蛋白代謝異常的效用。

綜合上面第F與G項的實驗結果可知，本發明的副乾酪乳酸桿菌LM-141能夠有效地改善血脂與脂蛋白代謝的異常，而可用於減緩血脂異常以及高血脂症(hyperlipidemia)。 H、 天門冬胺酸轉胺酶 / 丙胺酸轉胺酶 (AST/ALT) 比率的測定：

圖7顯示在開始投藥之後的第14週結束之時，各組大鼠所測得的血清中天門冬胺酸轉胺酶/丙胺酸轉胺酶(AST/ALT)比率。從圖7可見，與正常對照組相較之下，病理對照組的大鼠的血清中的AST/ALT比率有顯著的升高，這表示HFD會成功地誘發大鼠產生肝損傷(liver injury)。而與病理對照組相較之下，各個實驗組的大鼠的血清中的AST/ALT比率都有顯著的降低。這個實驗結果顯示：本發明的副乾酪乳酸桿菌LM-141具有改善肝損傷的效用。 I、 肝臟組織的組織病理學檢驗：

圖8顯示在開始投藥之後的第14週結束之時，各組大鼠的肝臟組織藉由Oil Red O染色而被觀察到的結果。從圖8可見，與正常對照組相較之下，病理對照組的肝臟組織切片會出現大量的油滴，這表示HFD會造成肝臟組織內油滴的累積。而與病理對照組相較之下，各個實驗組的肝臟組織切片當中所出現的油滴都有顯著的減少。

圖9顯示在開始投藥之後的第14週結束之時，各組大鼠的肝臟組織藉由蘇木精-伊紅染色而被觀察到的結果。從圖9可見，與正常對照組相較之下，病理對照組的肝臟組織切片會出現大量的脂肪液泡(fat vacuoles)，這表示HFD會造成肝臟組織內脂肪液泡的累積。而與病理對照組相較之下，各個實驗組的肝臟組織切片當中所出現的脂肪液泡都有顯著的減少。

這些實驗結果顯示：本發明的副乾酪乳酸桿菌LM-141具有改善肝臟組織內脂肪堆積的效用。

綜合上面第H與I項的實驗結果，本發明的副乾酪乳酸桿菌LM-141能夠有效地改善肝臟的損傷與脂肪堆積，而可用於減緩脂肪肝(fatty liver)。

基於上述的實驗結果，申請人認為：本發明的副乾酪乳酸桿菌LM-141可供用於預防和/或治療代謝症候群關聯性疾病(metabolic syndrome-related disorders)。

於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。

雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。

本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯，其中：圖1顯示各組大鼠藉由口服葡萄糖耐受性試驗(oral glucose tolerance test)所得到的血糖濃度-時間曲線(blood glucose concentration-time curve)，其中正常對照組表示未經任何處理的大鼠；病理對照組表示被餵食以高脂肪飼料(high fat diet, HFD)的大鼠；實驗組1表示被投藥以副乾酪乳酸桿菌LM-141的試驗菌液1以及被餵食以HFD的大鼠；實驗組2表示被投藥以副乾酪乳酸桿菌LM-141的試驗菌液2以及被餵食以HFD的大鼠；“*”表示：當與正常對照組作比較， p＜0.05；以及“#”表示：當與病理對照組作比較， p＜0.05；圖2顯示在開始投藥之後的第4、9以及14週結束之時，各組大鼠所測得的禁食血糖位準，其中正常對照組表示未經任何處理的大鼠；病理對照組表示被餵食以HFD的大鼠；實驗組1表示被投藥以副乾酪乳酸桿菌LM-141的試驗菌液1以及被餵食以HFD的大鼠；實驗組2表示被投藥以副乾酪乳酸桿菌LM-141的試驗菌液2以及被餵食以HFD的大鼠；“*”與“***”分別表示：當與正常對照組作比較， p＜0.05與 p＜0.001；以及“##”表示：當與病理對照組作比較， p＜0.01；圖3顯示在開始投藥之後的第14週結束之時，各組大鼠所測得的恆定模式評估胰島素抗性(HOMA-IR)指數，其中正常對照組表示未經任何處理的大鼠；病理對照組表示被餵食以HFD的大鼠；實驗組1表示被投藥以副乾酪乳酸桿菌LM-141的試驗菌液1以及被餵食以HFD的大鼠；實驗組2表示被投藥以副乾酪乳酸桿菌LM-141的試驗菌液2以及被餵食以HFD的大鼠；“*”表示：當與正常對照組作比較， p＜0.05；以及“#”表示：當與病理對照組作比較， p＜0.05；圖4顯示在開始投藥之後的第14週結束之時，各組大鼠所測得的血清中總膽固醇濃度，其中正常對照組表示未經任何處理的大鼠；病理對照組表示被餵食以HFD的大鼠；實驗組1表示被投藥以副乾酪乳酸桿菌LM-141的試驗菌液1以及被餵食以HFD的大鼠；實驗組2表示被投藥以副乾酪乳酸桿菌LM-141的試驗菌液2以及被餵食以HFD的大鼠；“*”表示：當與正常對照組作比較， p＜0.05；以及“#”表示：當與病理對照組作比較， p＜0.05；圖5顯示在開始投藥之後的第14週結束之時，各組大鼠所測得的血清中三酸甘油酯濃度，其中正常對照組表示未經任何處理的大鼠；病理對照組表示被餵食以HFD的大鼠；實驗組1表示被投藥以副乾酪乳酸桿菌LM-141的試驗菌液1以及被餵食以HFD的大鼠；實驗組2表示被投藥以副乾酪乳酸桿菌LM-141的試驗菌液2以及被餵食以HFD的大鼠；“*”表示：當與正常對照組作比較， p＜0.05；以及“#”與“##”分別表示：當與病理對照組作比較， p＜0.05與 p＜0.01；圖6顯示在開始投藥之後的第14週結束之時，各組大鼠所測得的血清中低密度脂蛋白/高密度脂蛋白(LDL/HDL)比率，其中正常對照組表示未經任何處理的大鼠；病理對照組表示被餵食以HFD的大鼠；實驗組1表示被投藥以副乾酪乳酸桿菌LM-141的試驗菌液1以及被餵食以HFD的大鼠；實驗組2表示被投藥以副乾酪乳酸桿菌LM-141的試驗菌液2以及被餵食以HFD的大鼠；“*”表示：當與正常對照組作比較， p＜0.05；以及“#”表示：當與病理對照組作比較， p＜0.05；圖7顯示在開始投藥之後的第14週結束之時，各組大鼠所測得的血清中天門冬胺酸轉胺酶/丙胺酸轉胺酶(AST/ALT)比率，其中正常對照組表示未經任何處理的大鼠；病理對照組表示被餵食以HFD的大鼠；實驗組1表示被投藥以副乾酪乳酸桿菌LM-141的試驗菌液1以及被餵食以HFD的大鼠；實驗組2表示被投藥以副乾酪乳酸桿菌LM-141的試驗菌液2以及被餵食以HFD的大鼠；“*”表示：當與正常對照組作比較， p＜0.05；以及“#”表示：當與病理對照組作比較， p＜0.05；圖8顯示在開始投藥之後的第14週結束之時，各組大鼠的肝臟組織藉由Oil Red O染色而被觀察到的結果，其中正常對照組表示未經任何處理的大鼠；病理對照組表示被餵食以HFD的大鼠；實驗組1表示被投藥以副乾酪乳酸桿菌LM-141的試驗菌液1以及被餵食以HFD的大鼠；實驗組2表示被投藥以副乾酪乳酸桿菌LM-141的試驗菌液2以及被餵食以HFD的大鼠；以及紅色箭頭指示代表有油滴(lipid droplets)的累積；以及圖9顯示在開始投藥之後的第14週結束之時，各組大鼠的肝臟組織藉由蘇木精-伊紅染色而被觀察到的結果，其中正常對照組表示未經任何處理的大鼠；病理對照組表示被餵食以HFD的大鼠；實驗組1表示被投藥以副乾酪乳酸桿菌LM-141的試驗菌液1以及被餵食以HFD的大鼠；實驗組2表示被投藥以副乾酪乳酸桿菌LM-141的試驗菌液2以及被餵食以HFD的大鼠；以及紅色箭頭指示代表有脂肪液泡(fat vacuoles)的累積。

TW中華民國；食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)；2021/01/29；BCRC 911037。

Claims

一種副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei)LM-141，其以寄存編號BCRC 911037被寄存於財團法人食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心。
一種如請求項1的副乾酪乳酸桿菌LM-141供應用於製備一用來預防和/或治療肥胖之組成物的用途。
如請求項2的用途，其中副乾酪乳酸桿菌LM-141可同時預防和/或治療一選自於由下列所構成之群組中的代謝症候群關聯性疾病：高血糖症、糖尿病、血脂異常、高血脂症、脂肪肝，以及它們的組合。
如請求項2的用途，其中該組成物是一食品組成物。
如請求項2的用途，其中該組成物是一藥學組成物。
如請求項5的用途，其中該藥學組成物進一步包含有一藥學上可接受的載劑。
如請求項5的用途，其中該藥學組成物是呈一供非經腸道投藥、口服投藥或局部投藥的劑型。