TWI776433B - 戴白氏乳桿菌乳酸亞種ldl557分離株及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明揭示一株戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557分離株，它以寄存編號BCRC 910780被寄存於財團法人食品工業發展研究所(FIRDI)的生物資源保存及研究中心(BCRC)。該戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557分離株可被用來治療發炎-相關疾病。
Description
本發明是有關於一株戴白氏乳桿菌乳酸亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis)LDL557分離株，它以寄存編號BCRC 910780被寄存於財團法人食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute,FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center,BCRC)，以及以寄存編號DSM 33617被寄存於德國微生物以及細胞培養物收集中心有限公司(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,DSMZ)。該戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557分離株可被用來治療發炎-相關疾病(inflammation-related disorders)。
發炎(inflammation)意指生物體中的細胞或組織為了對抗外部壓力刺激(external stressful stimuli)或病原體(pathogen)所產生的一種保護反應。而當發炎持續過久時，則會使得組織中的活性氧族(reactive oxygen species,ROS)以及自由基
(free radicals)累積過多而形成氧化性壓力與損害，進而造成慢性發炎(chronic inflammation)，最後可能導致發炎-相關疾病(inflammation-related disorders)，例如，過敏(allergy)、氣喘(asthma)、結腸炎(colitis)，以及關節炎(arthritis)等。
雖然目前已存在許多抗發炎藥物[諸如皮質類固醇(corticosteroids)]可供用於緩解發炎反應，但這些抗發炎藥物在臨床應用上仍存在有療效不佳以及容易產生副作用(side effect)的問題。因此，本領域的相關研究人員皆致力於發展出可以有效地抗發炎並且不會產生非所欲的副作用的藥物。
乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是屬於一般被公認為安全的(generally recognized as safe,GRAS)並且是為人所熟悉與廣泛使用的益生菌(probiotics)，其已被發現到具有抑制腸胃道病原菌生長、緩和乳糖不耐症(lactose intolerance)、抗癌(anti-cancer)以及降血壓等功效。目前可作為益生菌使用的乳酸菌有許多種類，例如乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、小球菌屬(Pediococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、雙叉桿菌屬(Bifidobacterium)以及酵母菌屬(Saccharomyces)等。
已有研究嘗試使用不同的戴白氏乳桿菌分離株來預防和/或治療不同的發炎-相關疾病。例如，在Watanabe T.et al.
(2009),J.Nutr.Sci.Vitaminol.,55：271-278中，Watanabe T.等人發現從南亞國家命名為“Dahi”的發酵乳(fermented milk)中分離出的戴白氏乳桿菌乳酸亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis)R-037具有減緩異位性皮膚炎(atopic dermatitis)的效用。在Santos Rocha C.et al.(2014),PLoS One,9(1)：e85923中，Santos Rocha C.等人發現從乾酪(cheese)中分離出的戴白氏乳桿菌乳酸亞種CNRZ327具有治療發炎性腸道症(inflammatory bowel diseases,IBD)的效用。在Kano H.et al.(2002),J.Food Prot.,65：153-160中，Kano H.等人發現戴白氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)OLL1073R-1能夠抑制關節炎的發生。
雖然已存在有上述文獻報導，本技藝中仍然存在有一需要去篩選出具有抗發炎效用的微生物以供產業界之用。
於本發明中，申請人意外地分離出1株戴白氏乳桿菌乳酸亞種分離株(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis isolate)，它被申請人命名為“戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557”(又被稱為乳酸乳桿菌LDL557 BCRC 910780)，相較於同種不同亞種或同亞種的不同分離株，戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557具有更為
優異的免疫調節能力，並且能有效地治療過敏(allergy)、氣喘(asthma)、結腸炎(colitis)以及關節炎(arthritis)等發炎-相關疾病(inflammation-related disorders)。戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557已於西元2017年05月17日以寄存編號BCRC 910780被寄存於財團法人食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)，並且亦有依據布達佩斯條約(the Budapest Treaty)的規定，於西元2020年08月10日以寄存編號DSM 33617被寄存於德國微生物以及細胞培養物收集中心有限公司(DSMZ)。
於是，在第一個方面，本發明提供一種戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557，其以寄存編號BCRC 910780被寄存於財團法人食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心，以及以寄存編號DSM 33617被寄存於德國微生物以及細胞培養物收集中心有限公司。
在第二個方面，本發明提供一種如上所述的戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557(BCRC 910780)供應用於製備一用來預防和/或治療發炎-相關疾病之組成物的用途。
在第三個方面，本發明提供一種用於治療一具有或被懷疑具有發炎-相關疾病之個體的方法，其包括對該個體投予一如上所述的戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557(BCRC 910780)。
本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯，其中：圖1至圖4分別顯示各組小鼠的脾臟細胞所測得的IL-4、IL-6、IL-13以及IL-17A濃度，其中“*”表示當與病理對照組作比較，p<0.05；圖5與圖6分別顯示各組細胞所測得的IL-6以及IL-10濃度；圖7與圖8分別顯示在開始投藥之後的第21天結束之時，正常對照組、病理對照組以及實驗組的小鼠的血清所測得的IgE與OVA-專一性的IgE濃度，其中“*”與“***”分別表示當與病理對照組作比較，p<0.05與p<0.001；圖9顯示在開始投藥之後的第21天結束之時，各組小鼠的糞便所測得的IgA濃度；圖10至圖12顯示在開始投藥之後的第30天結束之時，各組小鼠在不同濃度的乙醯甲膽鹼下所測得的呼吸參數，其中“***”表示當與病理對照組作比較，p<0.001；圖13顯示在開始投藥之後的第30天結束之時，各組小鼠的支氣管肺泡灌洗液所測得的IL-10濃度，其中“*”與“**”分別表示當與病理對照組作比較，p<0.05與p<0.01；
圖14顯示在開始投藥之後的第30天結束之時，各組小鼠的肺部組織所測得的細胞浸潤指數，其中“**”與“***”分別表示當與病理對照組作比較，p<0.01與p<0.001；圖15顯示在開始投藥之後的第21天結束之時，各組小鼠所測得的FITC-D4000濃度，其中“*”表示當與病理對照組作比較，p<0.05；圖16顯示在開始投藥之後的第21天結束之時，各組小鼠所測得的結腸長度，其中“***”表示當與病理對照組作比較，p<0.001；圖17顯示在開始投藥之後的第21天結束之時，各組小鼠的結腸經由組織病理學評估而得到的分數，其中“*”與“***”分別表示當與病理對照組作比較，p<0.05與p<0.001；圖18顯示在開始投藥之後的第21天結束之時，各組小鼠的結腸組織所測得的TNF-α濃度，其中“*”表示當與病理對照組作比較，p<0.05；圖19至圖21分別顯示在開始投藥之後的第42天結束之時，各組大鼠的血清所測得的第II型膠原蛋白(CII)-專一性的IgG2a、IgG2b以及IgG含量，其中“*”、“**”與“***”分別表示當與病理對照組作比較，p<0.05、p<0.01與p<0.001；圖22顯示各組大鼠的腳掌組織所測得的SIRT1的相對表現量，其中“***”表示當與病理對照組作比較，p<0.001；以及
圖23顯示各組大鼠的腳掌組織所測得的COX-2的相對表現量，其中“*”表示當與病理對照組作比較，p<0.05。
要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。
為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。
除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。
本發明提供一種戴白氏乳桿菌乳酸亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis)LDL557，其以寄存編號BCRC 910780被寄存於財團法人食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)，以及以寄存編號DSM
33617被寄存於德國微生物以及細胞培養物收集中心有限公司(DSMZ)。
本發明亦提供一種如上所述的戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557(BCRC 910780)供應用於製備一用來預防和/或治療發炎-相關疾病之組成物的用途。
如本文中所使用的，術語“發炎-相關疾病(inflammation-related disorders)”與“免疫-相關疾病(immune-related disorders)”可被交換地使用。
依據本發明，該發炎-相關疾病可包括，但不限於：過敏(allergy)[諸如過敏性鼻炎(allergic rhinitis)]、氣喘(asthma)、關節炎(arthritis)、牛皮癬(psoriasis)、異位性皮膚炎(atopic dermatitis)、紅斑性狼瘡(lupus erythematosus)、發炎性腸道症(inflammatory bowel disease,IBD)[諸如結腸炎(colitis)以及克隆氏症(Crohn’s disease)]，以及它們的組合。
如本文中所使用的，術語“預防(preventing)”或“預防(prevention)”發炎-相關疾病意指一個體在還沒有被診斷具有該疾病時，消除(eliminate)或減少(reduce)該疾病的發生率(incidence)，以及減緩(slow)、延遲(delay)、控制(control)或減少(decrease)該疾病的可能性(likelihood)或機率(probability)。
如本文中所使用的，術語“治療(treating)”或“治療(treatment)”發炎-相關疾病意指該疾病的嚴重性(severity)或症狀(symptom)被減少(reduced)，或是該疾病被部分地(partially)或完全地(entirely)消除(eliminated)。
依據本發明，戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557(BCRC 910780)可以是活菌或死菌、經濃縮的(concentrated)或未經濃縮的(non-concentrated)、液態(liquid)、糊狀(paste)、半固態(semi-solid)，或固態(solid)[例如，丸(pellet)、細顆粒(granule)或粉末(powder)]，並且可以是經熱去活的(heat-inactivated)、經冷凍的(frozen)、經乾燥的(dried)，或經冷凍-乾燥的(freeze-dried)[例如，可呈冷凍乾燥形式或噴霧/流化床乾燥(spray/fluid bed dried)形式]。在本發明的一個較佳具體例中，戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557(BCRC 910780)是呈活菌的形式存在。在本發明的另一個較佳具體例中，戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557(BCRC 910780)是經熱去活而呈死菌的形式存在。
依據本發明，該組成物可以是一食品組成物(food composition)，例如，呈一食品添加物(food additive)的形式，其可以被添加至一可食性材料(edible material)中以製備一供人類或動物食用的食品產品。依據本發明，該食物產品的種類可包括，但不限於：奶粉(milk powder)、發酵乳(fermented milk)、優格
(yogurt)、乳酪(butter)、飲料(beverages)(例如，茶、咖啡)、機能性飲料(functional beverages)、麵製品(flour product)、烘焙食品(baked foods)、甜點(confectionery)、糖果(candies)、發酵食品(fermented foods)、動物飼料(animal feeds)、保健食品(health foods)，以及膳食補充品(dietary supplements)。
依據本發明，該組成物可以是一藥學組成物(pharmaceutical composition)。
依據本發明，該藥學組成物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於口服投藥(oral administration)、非經腸道投藥(parenteral administration)、呼吸道投藥(respiratory tract administration)或局部投藥(topical administration)之劑型(dosage form)，這包括，但不限於：注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、無菌的粉末(sterile powder)、錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pellet)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、滴劑(drop)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)、噴霧劑(spray)[例如，鼻噴劑(nasal spray)、口腔噴劑(oral spray)]、外
部製劑(external preparation)[例如，軟膏(ointment)、乳霜(cream)、乳液(lotion)、凝膠(gel)以及泡沫(foam)]以及類似之物。
依據本發明，該藥學組成物可以一選自於由下列所構成的群組中的非經腸道途徑來投藥：腹膜內注射(intraperitoneal injection)、胸膜內注射(intrapleural injection)、肌肉內注射(intramuscular injection)、靜脈內注射(intravenous injection)、動脈內注射(intraarterial injection)、關節內注射(intraarticular injection)、滑液內注射(intrasynovial injection)、椎管內注射(intrathecal injection)、顱內注射(intracranial injection)、表皮內注射(intraepidermal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、皮內注射(intradermal injection)、病灶內注射(intralesional injection)以及舌下投藥(sublingual administration)。
依據本發明，該藥學組成物可以一選自於由下列所構成的群組中的呼吸道途徑來投藥：經口吸入(oral inhalation)以及經鼻吸入(nasal inhalation)。較佳地，該藥學組成物被製造成適於經鼻吸入而被投藥的劑型。
依據本發明，該藥學組成物可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之藥學上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，該藥學上可接受的載劑可包含一或多
種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、抗結塊劑(anti-caking agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
本發明亦提供一種用於治療一具有或被懷疑具有發炎-相關疾病之個體的方法，其包括對該個體投予一如上所述的戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557(BCRC 910780)。
如本文中所使用的，術語“投予(administering)”以及“投藥(administration)”可被交換地使用，並且意指藉由任何合適的途徑來對一個體導入(introducing)、提供(providing)或遞送(delivering)一預定的活性成分以執行其預期的效用。
如本文中所使用的，術語“個體(subject)”意指任何感興趣的哺乳類動物以及禽類(poultry)。適用於本發明的哺乳類動物包括，但不限於：人(humans)、猴子(monkeys)、牛(cows)、綿羊
(sheeps)、馬(horses)、豬(pigs)、山羊(goats)、狗(dogs)、貓(cats)、小鼠(mice)以及大鼠(rats)。適用於本發明的禽類包括，但不限於：雞(chicken)、鴨(duck)、鵝(goose)以及鴿子(pigeon)。
依據本發明，戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557(BCRC 910780)的投藥劑量與投藥次數會視下列因素而變化：要被治療的疾病之嚴重性，投藥途徑，以及要被治療的個體之年齡、身體狀況與反應。一般而言，戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557(BCRC 910780)可呈單一劑量或是分成數個劑量的形式而被口服地或非經腸道地投藥。
本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。
在下面實施例中用來培養乳桿菌所使用的MRS肉湯培養基是購自於啟新生物科技股份有限公司(廠牌為BD Difco，貨號為288130)。
在下面實施例中用來培養乳桿菌所使用的MRS瓊脂培養基是藉由對該MRS肉湯培養基添加以1.5%的瓊脂(agar)而被製得。
對健康人類志願者進行血液的抽取，並以檸檬酸葡萄糖(ACD)溶液[acid citrate dextrose(ACD)solution]作為抗凝血劑(anticoagulants)。接著，添加至含有Histopaque®-1077(廠牌為Sigma，貨號為10771)的離心管中並於4℃下以900g來進行密度-梯度離心(density-gradient centrifugation)歷時30分鐘，然後收取淋巴細胞層(lymphocyte layer)。之後，以紅血球溶解緩衝溶液(RBC lysis buffer)來溶解紅血球。而由此所得到的人類PBMCs細胞以含有10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的RPMI1640培養基(Gibco)來將濃度調整至2×106細胞/mL備用。
將20μg卵白蛋白(OVA)(廠牌為Sigma，貨號為A5503)溶於200μL的氫氧化鋁佐劑(ImjectTM Alum adjuvant)(廠牌為Thermo Fisher Scientific，貨號為77161)中來進行乳化，俾以獲得一OVA乳劑。
在下面實施例中所使用的雌性BALB/c小鼠、雌性C57BL/6小鼠以及雌性Sprague Dawley(SD)大鼠皆是購自於樂斯科生物科技股份有限公司(BioLasco Taiwan Co.,Ltd)。所有的實驗動物個別地被飼養於一個光照與黑暗各為12小時、室溫維持在22-25℃以及相對濕度維持在40-60%的動物房中，而且水分與飼料被充分地供給。有關實驗動物的一切實驗程序是由行政院農業委員會畜產試驗所(Livestock Research Institute)的實驗倫理委員會所認可，並依據美國國家衛生研究院(National Institutes of Health,NIH)的實驗動物飼養管理及使用規範(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)來進行。
在下面的實施例中，各組的實驗數據是以“平均值(mean)±平均值的標準差(standard deviation,SD)”來表示。所有的數據是藉由單因子變異數分析(one-way analysis of variance,one-way ANOVA)合併鄧肯氏多變域檢定(Duncan's multiple range test)來進行分析，俾以評估各組之間的差異性。若所得到的統計分析結果是p<0.05，代表有統計學顯著性(statistical significance)。
申請人使用取自於台灣台南牧場的玉米青貯料(corn silage)作為樣品來源來進行乳桿菌的分離與篩選。首先，將玉米青貯料與無菌的0.85%生理鹽水混合，繼而使用一均質機(型號為6642，廠牌為Oster)來進行均質處理。接著，對所得到的均質物進行10倍連續稀釋(10-fold serial dilution)而配製成不同稀釋倍數(10-2-10-7倍)，然後分別取出0.1mL並將之均勻塗佈於MRS瓊脂培養基上，繼而於37℃下予以培養歷時48小時。待菌落(colony)形成後，挑選出在該MRS瓊脂培養基上之菌落，而得到20-30株的乳桿菌分離株。
為尋找具有可用於治療發炎-相關疾病(inflammation-related disorders)之潛力的益生菌，申請人隨機挑選出15株乳桿菌分離株並將它們拿來進行免疫調節活性的分析，並且使用干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)以及介白素-10(interleukin-10,IL-10)作為篩選標記。
首先，將依據上面第A項中所得到的15株乳桿菌分離株分別以一為1%(v/v)的接種量接種至含有9mL的MRS肉湯培養
基中，並於37℃下進行培養歷時16-18小時。之後，所得到的各個乳桿菌培養物以3,500rpm來進行離心歷時10分鐘，接著去除上澄液，而沉澱物(pellets)以適量的磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline,PBS)予以洗滌。接著，使用適量的PBS來予以散浮並將各個乳桿菌分離株調整成具有一為109CFU/mL的細菌濃度(以平板計數培養基來進行菌數計數)，繼而在100℃下進行熱致死(heat-killing)歷時30分鐘，藉此而得到15個熱致死的乳桿菌分離株的試驗菌液。
之後，將依據上面“一般實驗材料”的第3項當中所製得的人類PBMCs細胞分成1個對照組以及15個實驗組(亦即實驗組1至15)，繼而將各組的人類PBMCs細胞以一為2×106細胞/井的數量分別培養於含有1mL的RPMI 1640培養基(添加有10% FBS)的24-井培養盤(24-well plate)的各井中，並在培養箱(37℃、5% CO2)中進行培養歷時24小時。接著，對該15個熱致死的乳桿菌分離株的試驗菌液各取100μL並分別加入至實驗組1至15的細胞培養物中。至於對照組的細胞培養物則不作任何處理。
各組細胞在培養箱(37℃、5% CO2)中進行培養歷時24小時之後，將所形成的培養物以3,000rpm來進行離心歷時15分鐘，繼而收取上澄液，接著使用IFN-γ ELISA套組(廠牌為eBioscience，貨號為88-7316)以及IL-10 ELISA套組(廠牌為
eBiosciencc，貨號為88-7106)並依據製造商的操作指南來進行IFN-γ以及IL-10濃度的測定。
所得到的結果被顯示於下面的表1中。由表1可見，部分試驗菌株在刺激人類PBMCs細胞上具有較佳的效用。申請人挑選出IFN-γ的濃度在3,000pg/mL以上或者IFN-γ與IL-10的濃度皆在1,000pg/mL以上的乳桿菌分離株(亦即菌株編號為008、221、554、556、557以及558者)來作進一步的試驗。
參照上面第B項當中所述的方法來製備熱致死的副乾酪乳桿菌33(Lactobacillus paracasei 33,LP33)的試驗菌液(它具有一為109CFU/mL的細菌濃度)，以供下面的實驗之用。
有關過敏的誘發大體上是參考LeeJ.et al.(2013),J.Microbiol.Biotechnol.,23：724-730當中所述的方法來進行，並略作修改。首先，將雌性BALB/c小鼠隨機地分成9組(每組n=12)，其中包括1個正常對照組、1個病理對照組、6個實驗組(亦即實驗組1至6)以及1個比較實驗組，其中病理對照組、實驗組以及比較實驗組的小鼠被腹膜內注射(intraperitoneally injected)以依據上面“一般實驗材料”的第4項當中所製得的OVA乳劑(劑量為200μL/隻)，而正常對照組的小鼠則被腹膜內注射以PBS(劑量為200μL/隻)。在OVA乳劑注射之後的第7天之時，各組小鼠依照上述方式再被注射1次。
在OVA乳劑注射之後的第14天結束之時，各組小鼠藉由CO2而被麻醉，然後予以犧牲。接著，取出致敏小鼠的脾臟並予以研磨，繼而分別置於含有RPMI 1640培養基(添加有10%FBS)的24井-培養盤中，並在培養箱(37℃、5% CO2)中進行培養歷時24小時。
將所得到之各組的脾臟細胞以一為2×106細胞/井的數量分別培養於含有1mL的RPMI 1640培養基(添加有10% FBS、
100μg/mL OVA)的24-井培養盤的各井中，並在培養箱(37℃、5% CO2)中進行培養歷時48小時，俾以完成過敏的誘發。接著，對在上面第B項當中所挑選出的6個熱致死的乳桿菌分離株的試驗菌液各取100μL並分別加入至實驗組1至6的細胞培養物中。至於正常對照組以及病理對照組的細胞培養物則不作任何處理。另外，比較實驗組的細胞培養物被添加以100μL之熱致死的副乾酪乳桿菌33試驗菌液。
各組細胞在培養箱(37℃、5% CO2)中進行培養歷時48小時之後，將所形成的培養物以3,000rpm來進行離心歷時15分鐘，繼而收取上澄液，接著使用IL-4 ELISA套組(廠牌為Invitrogen，貨號為BMS613TEN)、IL-6 ELISA套組(廠牌為Invitrogen，貨號為88-7064-88)、IL-13 ELISA套組(廠牌為Invitrogen，貨號為88-7137-86)以及IL-17A ELISA套組(廠牌為Invitrogen，貨號為BMS6001TEN)並依據製造商的操作指南來進行IL-4、IL-6、IL-13以及IL-17A濃度的測定。
所得到的結果被顯示於圖1至圖4中。從圖1至圖4可見，與正常對照組相較之下，病理對照組的IL-4、IL-6、IL-13以及IL-17A濃度皆有顯著的升高，這表示OVA成功地誘發小鼠產生過敏。而與病理對照組相較之下，實驗組4與實驗組5的IL-4、IL-6、IL-13以及IL-17A濃度皆有呈現顯著的降低，特別地，實驗組5的
IL-4、IL-6、IL-13以及IL-17A濃度不僅明顯低於其他實驗組所具者，還顯著地低於比較實驗組所具者。申請人據此而認為：乳桿菌分離株557是最具開發潛力的菌株，故將它拿來進行下面的特徵鑑定。
為了確認在上面實施例中所篩選出的乳桿菌分離株557之所屬菌種，乳桿菌分離株557被拿來進行下面的初步試驗、醣類發酵型態(carbohydrate fermentation profile)分析、16S rDNA序列分析(16S rDNA sequence analysis)以及多基因座序列分型(multilocus sequence typing,MLST)。
對乳桿菌分離株557進行初步試驗，試驗項目包括：革蘭氏染色(Gram staining)、形態觀察(morphological observation)、運動性(motility)、觸酶(catalase)反應、在好氧(aerobic)與厭氧(anaerobic)條件下的生長情形，以及是否會形成內生孢子(endospore)等。
依據初步試驗結果，該乳桿菌分離株557為革蘭氏陽性桿菌、不具運動性、不具觸酶的活性、在厭氧條件下可生長，以及不會形成內生孢子。
關於醣類發酵型態的分析是使用API 50 CHL鑑定系統(API 50 CHL identification system)(bioMérieux)並參照廠商所提供的操作指引來進行，而所得到的分析結果被顯示於下面的表2中。
將上述分析結果與APIWEBTM線上資料庫(APIWEBTM on-line database)進行比對後發現：本發明的乳桿菌分離株557的醣類發酵型態與戴白氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)所具者之間具有84.9%的相同性(identity)。
首先，使用一基因組DNA Mini套組(Genomic DNA Mini Kit)(廠牌為Geneaid，貨號為GB300)來萃取乳桿菌分離株557的基因組DNA，繼而以所得到的基因組DNA作為模板(template)，並使用一組針對細菌的16S rDNA基因而設計之具有下面所示的核苷酸序列的引子對(primer pair)前向引子27F與反向引子1492R來進行聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)，俾以擴增出乳桿菌分離株557的16S rDNA片段。有關PCR的反應條件被顯示於下面表3中。
5’-agagtttgatcctggctcag-3’(序列辨識編號：1)
5’-ggttaccttgttacgact-3’(序列辨識編號：2)
於完成PCR之後，藉由2%瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis)來確認有否得到一大小約為474bp的PCR擴增產物，並從凝膠回收純化該經確認的PCR產物。
之後，委託基龍米克斯生物科技股份有限公司(Genomics Biosci & Tech)來進行定序分析，而得到乳桿菌分離株557的16S rDNA序列(序列辨識編號：3)。經與NCBI網站中的基因資料庫比對後發現，乳桿菌分離株557的16S rDNA序列與戴白氏乳桿菌乳酸亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis)之間具有最高的序列相似性(sequence similarity)。
依據上面第B至C項的實驗結果，本發明的乳桿菌分離株557被初步鑑定是戴白氏乳桿菌乳酸亞種，因而命名為戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557，而為了確認它是否為一種新穎的戴白氏乳桿菌乳酸亞種分離株，進一步將之拿來進行下面的分析。
有關MLST主要是參考Tanigawa K. and Watanabe K.(2011),Microbiology(Reading),157：727-738當中所述的方法來進行。首先，以在上面第C項當中所得到的戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557的基因組DNA作為模板，並分別使用七組習知所揭示之針對細菌的7個內控基因(housekeeping genes)(包括fusA、gyrB、hsp60、ileS、pyrG、recA以及recG基因)而設計之具有下面表4中所示的核苷酸序列的引子對來進行PCR。有關PCR的反應條件被顯示於下面表5中。
於完成PCR之後，所得到7個PCR擴增產物分別被拿來進行2%瓊脂糖凝膠電泳，俾以確認是否可得到如上面表4中所示之既定大小的PCR產物。接著，從凝膠回收純化該等經確認的PCR產物，並委託基龍米克斯生物科技股份有限公司來進行定序分析，而得到戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557的fusA、gyrB、hsp60、ileS、pyrG、recA以及recG基因的序列片段(序列辨識編號：18至24)。
為供比對，申請人另外使用8株習知的戴白氏乳桿菌乳酸亞種分離株(包括BCRC 12256、10699、14033、14078、16067、16057、14032以及11051)來進行相同的實驗，藉此而分別得到這8株戴白氏乳桿菌乳酸亞種分離株的fusA、gyrB、hsp60、ileS、pyrG、recA以及recG基因的序列片段。
之後，使用一DNASTAR Lasergene軟體第15版的SeqMan Pro程式來進行序列片段的組合(assembly)，繼而使用分子演化遺傳學分析軟體第7.0版(molecular evolutionary genetics analysis software version 7.0,MEGA 7.0)(Pennsylvania State University,USA)來進行序列比對分析。接著，依據不同的內控基因的遺傳變異來進行序列分型，並將所得到的結果整理於下面的表6中。從表6可見，綜合該9株戴白氏乳桿菌乳酸亞種分離株在不同內控基因的對偶基因型(allele type)，該等分離株被鑑別為具有不同序列型(sequence type,ST)的9種分離株。
a：每一行中不同的數字代表藉由對應的內控基因而被鑑別為不同的對偶基因型。
b：每一行中不同的符號代表藉由這7個內控基因而被鑑別為不同的序列型。
據此，申請人認為：戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557是一種新穎的戴白氏乳桿菌乳酸亞種分離株，它已於西元2017年5月17日以寄存編號BCRC 910780被寄存於台灣的食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute,FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center,BCRC)(300新竹市食品路331號，台灣)，故又
被稱為戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557 BCRC 910780(或乳酸乳桿菌LDL557 BCRC 910780)。另外，它已有於西元2020年8月10日以寄存編號DSM 33617被寄存於德國微生物以及細胞培養物收集中心有限公司(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,DSMZ)。
選用在上面實施例1當中所得到的戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557(BCRC 910780)以及下面表7中所示之11株申請人先前所自行分離的戴白氏乳桿菌菌株，並大體上參照上面實施例1的第B項當中所述的方法來製備12個熱致死的戴白氏乳桿菌菌株的試驗菌液(分別具有108CFU/mL的細菌濃度)。
首先，將得自於BCRC的THP-1細胞(BCRC 60430)以一為5×105細胞/井的數量培養於含有1mL的RPMI 1640培養基[添加有10% FBS、10ng/mL佛波醇-12-十四烷醯-13-乙酸酯(phorbol 12-myristate-13-acetate,PMA)]的24井-培養盤中，並在培養箱(37℃、5% CO2)中進行培養歷時48小時。之後，將培養基更換以不含有PMA的新鮮的RPMI 1640培養基(添加有10% FBS)，並在培養箱(37℃、5% CO2)中進行培養歷時72小時，俾以誘發THP-1細胞分化為巨噬細胞。
接著，將巨噬細胞分成1個實驗組以及11個比較實驗組(亦即比較實驗組1至11)，繼而分別更換以新鮮的RPMI 1640培養
基(900μL)，其中實驗組的培養基額外添加有100μL之熱致死的戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557(BCRC 910780)的試驗菌液，而比較實驗組1至11的培養基則額外添加有100μL之如上面表7中所示的各個熱致死的戴白氏乳桿菌菌株的試驗菌液。
各組細胞在培養箱(37℃、5% CO2)中進行培養歷時24小時之後，將所形成的培養物以3,500rpm來進行離心歷時15分鐘，繼而收取上清液，然後使用IL-6 ELISA套組(廠牌為invitrogen，貨號為88-7066-88)以及IL-10 ELISA套組(廠牌為invitrogen，貨號為88-7106-88)並依據製造商的操作指南來進行IL-6以及IL-10濃度的測定。
圖5與圖6分別顯示各組細胞所測得的IL-6以及IL-10濃度。從圖5與圖6可見，實驗組的IL-6以及IL-10濃度皆是明顯高於各個比較實驗組所具者。這個實驗結果顯示：本發明的戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557(BCRC 910780)相較於同種不同亞種或同亞種的不同分離株具有更為優異的免疫調節能力。
將戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557(BCRC 910780)接種至一MRS肉湯培養基中，並於37℃下進行培養歷時16-18小時。之後，所得到的培養物在4℃下以5,000rpm進行離心歷時10分鐘，接著去除上澄液，而沉澱物以適量的PBS予以洗滌。在以平板計數培養基來進行菌數計數之後，進行冷凍乾燥處理，藉此得到戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557(BCRC 910780)的冷凍乾燥菌粉。
之後，使用適量的0.85%生理鹽水來將所得到的戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557(BCRC 910780)的冷凍乾燥菌粉調整成一具有一為109CFU/mL的細菌濃度之活的戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557(BCRC 910780)的試驗菌液，以供下面的實驗之用。
參照上面第1項當中所述的方法來製備活的鼠李糖乳酸桿菌GG的試驗菌液(它具有一為109CFU/mL的細菌濃度)，以供下面的實驗之用。
有關過敏的誘發大體上是參考Lee J.et al.(2013)(同上述)當中所述的方法來進行，並略作修改。首先，將雌性BALB/c小鼠(6週大，體重約為19-20g)隨機地分成4組(每組n=6)，其中包括1個正常對照組、1個病理對照組、1個實驗組以及1個比較實驗組，其中病理對照組、實驗組以及比較實驗組的小鼠被腹膜內注射以依據上面“一般實驗材料”的第4項當中所製得的OVA乳劑(劑量為200μL/隻)，而正常對照組的小鼠則被腹膜內注射以氫氧化鋁佐劑(廠牌為Thermo Fisher Scientific，貨號為77161)(劑量為200μL/隻)。在OVA乳劑注射之後的第14天之時，各組小鼠依照上述方式再被注射1次。
接著，在進行第2次OVA乳劑的注射之後，隨即藉由口服胃管灌食法(oral gavage)的方式，對實驗組與比較實驗組的小鼠分別投藥以在上面“實驗材料”的第1與2項當中所得到之活的戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557(BCRC 910780)的試驗菌液(劑量為：9-10 log CFU/kg)以及鼠李糖乳酸桿菌GG的試驗菌液(劑量為：9-10 log CFU/kg)。至於正常對照組以及病理對照組的小鼠則被投藥以0.85%生理鹽水。各組小鼠每天被投藥一次，投藥時間總共歷時21天。
在開始投藥之後的第21天結束之時，藉由穿刺(puncture)而從正常對照組、病理對照組以及實驗組的小鼠的面靜脈(facial vein)來採集血液，並在4℃下以10,000rpm進行離心歷時5分鐘，由此所得到的上清液即為血清樣品。接著，對該血清樣品進行50倍稀釋，然後使用IgE ELISA套組(廠牌為Bethyl Laboratories Inc.，貨號為E90-115)並依據製造商的操作指南來進行IgE濃度的測定。
另外，將上面所得到之經稀釋的血清樣品拿來進行OVA-專一性的IgE濃度的測定，其大體上是參考Kim J.Y.et al.(2008),J.Microbiol.Biotechnol.,18：1393-1400當中所述的方法來進行，並略作修改。首先，以每井100μL的體積將10μg/mL的OVA(配於PBS中)分別添加至一96-井培養盤的各井中，並於4℃下靜置歷時24小時。之後，移除各井中的液體並以PBST(含有0.05% Tween 20的PBS)予以洗滌3次，接著在每井中分別加入200μL的封阻緩衝液(blocking buffer)[含有1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的PBST]，於室溫下進行封阻(blocking)歷時2小時。之後，對各個經稀釋的血清樣品各取0.1mL並將之添加至該96-井培養盤的各井中，繼而於室溫下反應歷時1小時，接著使用OVA-專一性IgE ELISA套組(廠牌為Bethyl Laboratories
Inc.，貨號為E90-115)並依據製造商的操作指南來進行OVA-專一性IgE濃度的測定。
之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。
在開始投藥之後的第21天結束之時，各組小鼠藉由CO2而被麻醉，然後予以犧牲。接著，自各組小鼠的大腸中取出糞便，繼而大體上參考Kim J.Y.et al.(2008)(同上述)當中所述的方法來進行糞便中IgA的含量分析。簡言之，使用適量之無菌的PBS將所收集到的糞便調整為一具有一濃度為100mg/mL的糞便樣品，接著使用IgA ELISA套組(廠牌為Bethyl Laboratories Inc.，貨號為E90-103)並依據製造商的操作指南來進行IgA濃度的測定。
之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。
在開始投藥之後的第21天結束之時，在犧牲各組小鼠之後，取出正常對照組、病理對照組以及實驗組的小鼠的十二指腸與迴腸並量測它們的絨毛長度以及腺窩深度，繼而計算出絨毛長度相對於腺窩深度的比率。
圖7與圖8分別顯示在開始投藥之後的第21天結束之時，正常對照組、病理對照組以及實驗組的小鼠的血清所測得的IgE與OVA-專一性的IgE濃度。從圖7與圖8可見，與正常對照組相較之下，病理對照組的IgE與OVA-專一性的IgE濃度皆有顯著的升高，這表示OVA成功地誘發小鼠產生過敏。而與病理對照組相較之下，實驗組的IgE與OVA-專一性的IgE濃度皆有明顯的降低。這個實驗結果顯示：本發明戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557(BCRC 910780)能夠有效地降低血清中的過敏指標。
圖9顯示在開始投藥之後的第21天結束之時，各組小鼠的糞便所測得的IgA濃度。從圖9可見，與正常對照組相較之下，病理對照組的IgA濃度有顯著的降低，這表示OVA成功地誘發小鼠產生過敏。而與病理對照組相較之下，實驗組的IgA濃度有顯著的升高並且是近似於正常對照組所具者，至於比較實驗組的IgA濃度則是顯著地降低。這個實驗結果顯示：本發明戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557(BCRC 910780)能夠有效地提升糞便中的抗過敏指標IgA表現量。相對地，已知具有抗過敏活性的習知鼠李糖乳酸桿菌GG不但無法提升糞便中的IgA表現量，反而會產生反效果。
下面的表8顯示在開始投藥之後的第21天結束之時，正常對照組、病理對照組以及實驗組的小鼠的十二指腸以及迴腸分別所測得之絨毛長度相對於腺窩深度的比率。
從表8可見，無論是十二指腸或迴腸，與正常對照組相較之下，病理對照組的絨毛長度相對於腺窩深度的比率皆呈現顯著地降低，這表示OVA成功地誘發小鼠產生過敏。而與病理對照組相較之下，實驗組的絨毛長度相對於腺窩深度的比率則呈現顯著地升高，並且是近似於正常對照組所具者。這個實驗結果顯示：本發明戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557(BCRC 910780)能夠有效地改善十二指腸與迴腸的過敏症狀。
綜合以上的實驗結果可知：本發明的戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557 BCRC 910780能夠有效地保護小鼠對抗過敏。
將歐洲室塵蟎(DerP)拿來進行超音波震盪處理(ultrasonically vibrating treatment)，而得到DerP粉末。接著，將50μg DerP粉末溶於200μL的氫氧化鋁佐劑(廠牌為Thermo Fisher Scientific，貨號為77161)中來進行乳化，俾以獲得一DerP乳劑。
將雌性BALB/c小鼠(6週大，體重約為18-22g)隨機地分成6組(每組n=12)，其中包括1個正常對照組、1個病理對照組、3個實驗組(亦即活菌實驗組1、活菌實驗組2與熱致死菌實驗組)以及1個比較實驗組。接著，藉由口服胃管灌食法的方式，對活菌實驗組1與活菌實驗組2的小鼠分別投藥以在上面實施例4的“實驗材料”的第1項當中所得到之活的戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557(BCRC 910780)的試驗菌液(劑量分別為：5×109CFU/kg與5×1010
CFU/kg)，對熱致死菌實驗組的小鼠投藥以在上面實施例3的“實驗材料”的第1項當中所得到之熱致死的戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557(BCRC 910780)的試驗菌液(劑量為：5×1010CFU/kg)，以及對比較實驗組的小鼠投藥以地塞米松(dexamethasone)(劑量為：1mg/kg)。至於正常對照組以及病理對照組的小鼠則被投藥以0.85%生理鹽水。各組小鼠每天被投藥一次，投藥時間總共歷時30天。
在完成第14天與第21天的投藥後，病理對照組、比較實驗組以及各個實驗組的小鼠隨即藉由腹膜內注射以依據上面“實驗材料”的第1項當中所製得的DerP乳劑(劑量為100μL/隻)而被免疫接種(immunized)。接著，在完成第22天的投藥後，病理對照組、比較實驗組以及各個實驗組的小鼠隨即經由鼻內滴注(intranasal instillation)而被處理以該DerP乳劑(劑量為20μL/隻)，且每天被滴注一次，滴注時間總共歷時5天。最後，在完成第28天的投藥後，病理對照組、比較實驗組以及各個實驗組的小鼠隨即經由氣管內滴注(intratracheal instillation)而被處理以該DerP乳劑(劑量為40μL/隻)，俾以誘發氣喘的發生。至於正常對照組的小鼠則不作任何處理。
在開始投藥之後的第30天結束之時，各組小鼠藉由舒泰(Zoletil)而被麻醉，然後進行氣管切開術(tracheotomy)以接上一flexiVent呼吸參數測定儀(廠牌為SCIREQ)，接而進行乙醯甲膽鹼-誘發的氣流阻塞(methacholine-induced airflow obstruction)。簡言之，使小鼠吸入漸增濃度之經氣溶膠化(aerosolized)的乙醯甲膽鹼(廠牌為Sigma-Aldrich，貨號為PHR1943，0至8mg/mL)，並且藉由測量下列呼吸參數(respiratory parameters)隨著乙醯甲膽鹼濃度的變化來評估肺功能：呼吸系統阻力(respiratory system resistance,Rrs)、呼吸系統彈性(respiratory system elastance,Ers)以及組織阻尼係數(tissue damping,G)。
在開始投藥之後的第30天結束之時，各組小鼠藉由舒泰而被麻醉，然後予以犧牲。接著，藉由下列步驟來對各組小鼠進行支氣管肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage,BAL)：首先，使用一支氣管鏡(bronchoscope)來將2mL之無菌的鹽水液體經由各組小鼠的氣管而注射至肺臟中。接著，收集被注射的液體[亦即，支氣管肺泡灌洗液(BALF)]，並在4℃下以300g進行離心歷時15分鐘，由此所得到的上清液即為支氣管肺泡灌洗液樣品。之後，對各個樣
品各取100μL並將之添加至一96-井培養盤的各井中，接著使用IL-10 ELISA套組(廠牌為R&D Systems，貨號為DY417)並依據製造商的操作指南來進行IL-10濃度的測定。
之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。
在開始投藥之後的第30天結束之時，在犧牲各組小鼠之後，取出牠們的肺臟組織，並且在室溫下以10%三聚甲醛(paraformaldehyde)(配於PBS中)來進行固定(fixation)歷時48小時，繼而將經固定的組織樣品以石蠟(paraffin)予以包埋(embedding)，然後進行切片處理，藉此而得到具有一厚度為5μm的組織切片(tissue sections)。
之後，所得到的組織切片藉由使用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin)並且依據熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術來進行染色，繼而使用Olympus穿透光正立顯微鏡並在一為100倍的放大倍率下，隨機地從該組織切片中選出144個區域來進行拍照並參考Sung J.E.et al.(2017),Int.J.Mol.Med.,40：1365-1376來進行細胞浸潤指數(cellular infiltration index)的計分。
之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。
圖10至圖12顯示在開始投藥之後的第30天結束之時，各組小鼠在不同濃度的乙醯甲膽鹼下所測得的呼吸參數。從圖10至圖12可見，與正常對照組相較之下，病理對照組的呼吸系統阻力(Rrs)、呼吸系統彈性(Ers)以及組織阻尼係數(G)皆會隨著乙醯甲膽鹼濃度的增加而呈現逐漸升高的情形，這表示乙醯甲膽鹼成功地誘發小鼠產生呼吸道阻塞。而與病理對照組相較之下，各個實驗組的呼吸系統阻力(Rrs)、呼吸系統彈性(Ers)以及組織阻尼係數(G)的上升幅度皆有顯著的降低，至於比較實驗組只有呼吸系統阻力(Rrs)以及呼吸系統彈性(Ers)的上升幅度有顯著的降低，在組織阻尼係數(G)上反而還明顯高於病理對照組所具者。這個實驗結果顯示：本發明的戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557 BCRC 910780不論呈活菌或死菌的形式皆能夠有效地改善小鼠的呼吸道阻塞的情形。
圖13顯示在開始投藥之後的第30天結束之時，各組小鼠的支氣管肺泡灌洗液所測得的IL-10濃度。從圖13可見，與正常對照組相較之下，病理對照組的IL-10濃度有明顯的升高，這表示
DerP成功地誘發小鼠肺部組織產生發炎反應。而與病理對照組相較之下，比較實驗組以及各個實驗組的IL-10濃度皆有顯著的降低，其中又以熱致死菌實驗組的降低程度更為顯著。這個實驗結果顯示：本發明的戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557 BCRC 910780不論呈活菌或死菌的形式皆能夠有效地降低呼吸道中的發炎指標。
圖14顯示在開始投藥之後的第30天結束之時，各組小鼠的肺部組織所測得的細胞浸潤指數。從圖14可見，與正常對照組相較之下，病理對照組的細胞浸潤指數有顯著的升高，這表示DerP成功地誘發小鼠的肺部組織產生浸潤的情形。而與病理對照組相較之下，比較實驗組以及各個實驗組的細胞浸潤指數皆呈現顯著的降低。這個實驗結果顯示：本發明的戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557 BCRC 910780不論呈活菌或死菌的形式皆能夠有效地改善肺部細胞浸潤的情形。
綜合以上的實驗結果可知：本發明的戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557 BCRC 910780不論呈活菌或死菌的形式皆能夠有效地保護小鼠對抗氣喘。
有關於結腸炎的誘發大體上是參考Im E.et al.(2009),J.Nutr.,139：1848-1854當中所述的方法來進行，並略作修改。將雌性C57BL/6小鼠(7週大，體重約為19-21g)隨機地分成5組(每組n=8)，其中包括1個正常對照組、1個病理對照組以及2個實驗組(亦即活菌實驗組、熱致死菌實驗組)。接著，藉由口服胃管灌食法的方式，對活菌實驗組的小鼠投藥以在上面實施例4的“實驗材料”的第1項當中所得到之活的戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557(BCRC 910780)的試驗菌液(劑量為：9-10 log CFU/kg)，以及對熱致死菌實驗組的小鼠投藥以在上面實施例3的“實驗材料”的第1項當中所得到之熱致死的戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557(BCRC 910780)的試驗菌液(劑量為：9-10 log CFU/kg)。至於正常對照組以及病理對照組的小鼠則被投藥以0.85%生理鹽水。各組小鼠每天被投藥一次，投藥時間總共歷時21天。
在進行第14、16、18以及20天的投藥之前，將病理對照組以及各個實驗組的小鼠之飲用水更換成含有2%葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate,DSS)(廠牌為MP biomedical，貨號為9011-18-1)的飲用水，俾以誘發結腸炎的發生。至於正常對照組的小鼠則不作任何處理。
在開始投藥之後的第20天，大體上參考Woo J.K.et al.(2016),BMC Complement Altern.Med.,doi：10.1186/s12906-016-1479-0當中所述的方法來對各組小鼠進行腸道通透性的分析。簡言之，首先，藉由口服胃管灌食法的方式，對各組小鼠投予含有2mg/mL螢光異硫氰酸鹽-葡聚醣4000(Fluorescein isothiocyanate-dextran 4000,FITC-D4000)的0.85%生理鹽水(劑量為：10mL/kg)。在投予FITC-D4000之後的第4小時，藉由穿刺而從各組小鼠的面靜脈來採集血液，並在4℃下以10,000rpm進行離心歷時5分鐘，由此所得到的上清液即為血清樣品。接著，使用一螢光分析儀(型號為Hitachi，廠牌為F7000)並於492nm的激發波長(excitation wavelength)以及525nm的放射波長(emission wavelength)下來測量各組的螢光強度(fluorescence intensity)。由此所測得的螢光強度接而根據預先以具有不同已知濃度(40、20、10、5、2.5、1.25以及0.625μg/mL)的FITC-D4000標準品相對於它們自身的螢光強度所作出的相關曲線而被換算成濃度(μg/mL)來表示。
之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。
在開始投藥之後的第21天結束之時，各組小鼠藉由CO2而被麻醉，然後予以犧牲。接著，取出各組小鼠的結腸，繼而以冰冷的生理食鹽水予以清洗並移除腸內容物(intestinal content)，然後量測各組的結腸長度並拍照。之後，對所得到之各組小鼠的結腸各取大約1-2cm的組織樣品，並在室溫下以10%福馬林(formalin)來進行固定歷時24小時，繼而將經固定的組織樣品以石蠟予以包埋，然後進行切片處理，藉此而得到具有一厚度為3-5μm的組織切片。
之後，所得到的組織切片藉由使用蘇木精-伊紅並且依據熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術來進行染色，繼而使用一光學顯微鏡(Carl Zeiss,Oberkochen,Germany)並在一為200倍的放大倍率下，隨機地從該組織切片中選出1個區域來進行拍照並參考Liu Y.W.et al.(2011),Int.Immunopharmacol.,11：2159-2166來進行組織病理學評估，並且以0至12分來作表示，數值越高表示發炎越嚴重。
之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。
自在上面第C項當中所得到之各組小鼠的結腸末端擷取一長度為1cm的結腸組織，並以含有蛋白酶抑制劑(protease
inhibitor)(廠牌為Sigma，貨號為P1860)的無菌PBS予以清洗，繼而培養於RPMI 1640培養基[補充有100IU/mL盤尼西林(penicillin)、0.1mg/mL鏈黴素(streptomycin)、0.25μg/mL雙性黴素B(amphotericin B)、蛋白酶抑制劑以及1% L-麩胺酸鹽(L-glutamate)]中，並在培養條件設定為37℃與5% CO2的培養箱中進行培養歷時24小時。
之後，將所形成的培養物於3,000rpm下進行離心歷時15分鐘，繼而收取上澄液，然後使用TNF-α ELISA套組(廠牌為Invitrogen，貨號為BMS607-3TEN)並依據製造商的操作指南來進行TNF-α濃度的測定。
圖15顯示在開始投藥之後的第21天結束之時，各組小鼠所測得的FITC-D4000濃度。從圖15可見，與正常對照組相較之下，病理對照組的FITC-D4000濃度有顯著的增加，這表示葡聚糖鈉硫酸成功地誘發小鼠產生結腸炎並且破壞腸道表皮之屏障功能(barrier function)而增加腸道通透性。而與病理對照組相較之下，活菌實驗組與熱致死菌實驗組的FITC-D4000濃度皆有顯著的降低。特別地，熱致死菌實驗組的FITC-D4000濃度是近似於正常對照組所具者。這個實驗結果顯示：本發明的戴白氏乳桿菌乳酸亞種
LDL557(BCRC 910780)不論呈活菌或死菌的形式皆能夠有效地改善結腸炎並保護腸道表皮之屏障功能以及腸道通透性。
圖16顯示在開始投藥之後的第21天結束之時，各組小鼠所測得的結腸長度。從圖16可見，與正常對照組相較之下，病理對照組的結腸長度有明顯的變短，這表示葡聚糖鈉硫酸成功地誘發小鼠產生結腸炎並導致結腸病變。而與病理對照組相較之下，活菌實驗組與熱致死菌實驗組的結腸長度皆較長，這表示本發明的戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557(BCRC 910780)能夠減緩結腸的病變。
圖17顯示在開始投藥之後的第21天結束之時，各組小鼠的結腸經由組織病理學評估而得到的分數。從圖17可見，與正常對照組相較之下，病理對照組的組織病理學評估的分數有顯著的增加，這表示葡聚糖鈉硫酸成功地誘發小鼠產生結腸炎。而與病理對照組相較之下，活菌實驗組與熱致死菌實驗組的組織病理學評估的分數則有顯著的降低，其中又以熱致死菌實驗組的降低程度更為顯著。
綜合以上的實驗結果可知：本發明的戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557(BCRC 910780)不論呈活菌或死菌的形式皆能夠有效地減緩結腸炎病況。
圖18顯示在開始投藥之後的第21天結束之時，各組小鼠的結腸組織所測得的TNF-α濃度。從圖18可見，與正常對照組相較之下，病理對照組的結腸組織會大量地表現TNF-α，這表示葡聚糖鈉硫酸成功地誘發小鼠產生結腸炎。而與病理對照組相較之下，活菌實驗組與熱致死菌實驗組的結腸組織所測得的TNF-α濃度皆有顯著地降低。這個實驗結果顯示：本發明的戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557(BCRC 910780)不論呈活菌或死菌的形式皆能夠有效地降低結腸組織中的發炎指標。
綜合以上的實驗結果可知：本發明的戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557(BCRC 910780)不論呈活菌或死菌的形式皆能夠有效地保護小鼠對抗結腸炎。
首先，將牛第II型膠原蛋白(Bovine type II collagen，簡稱為CII)(廠牌為chondrex，貨號為20022)與不完全弗氏佐劑(Incomplete Freund Adjuvant,IFA)(廠牌為
Sigma-Aldrich，貨號為F5506)以一為1：1(v/v)的比例來進行混合，而得到一CII乳化液。
接著，將雌性SD大鼠(6週大，體重約為160-180g)隨機地分成4組(每組n=12)，其中包括1個正常對照組、1個病理對照組以及2個實驗組(亦即活菌實驗組與熱致死菌實驗組)。接著，藉由口服胃管灌食法的方式，對活菌實驗組的大鼠投藥以在上面實施例4的“實驗材料”的第1項當中所得到之活的戴白氏乳桿菌乳酸亞種BCRC 910780的試驗菌液(劑量為：5×108CFU/kg)，以及對熱致死菌實驗組的大鼠投藥以在上面實施例3的“實驗材料”的第1項當中所得到之熱致死的戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557(BCRC 910780)的試驗菌液(劑量為：5×108CFU/kg)。至於正常對照組以及病理對照組的大鼠則被投藥以0.85%生理鹽水。各組小鼠每天被投藥一次，投藥時間總共歷時42天。
在進行第14天的投藥之後，將200μL的CII乳化液皮下注射至病理對照組與各個實驗組的大鼠尾巴內來做第1次免疫，並於免疫7天後再追加免疫(boost)一次，俾以誘發關節炎的發生。至於正常對照組的大鼠則被注射以PBS。
在開始投藥之後的第28天結束之時，觀察並記錄各組大鼠的四肢腳掌關節的紅腫、脹大等變化情形。
在開始投藥之後的第42天結束之時，藉由動脈穿刺而從各組大鼠的尾部動脈來採集血液，並在4℃下以5,000g進行離心歷時15分鐘，由此所得到的上清液即為血清樣品。接著，對該血清樣品進行106倍稀釋，然後以每井100μL的體積將5μg/mL的CII(配於PBS中)分別添加至一96-井培養盤的各井中，並於室溫下靜置隔夜而使CII被塗覆於各井中。之後，對各個經稀釋的血清樣品各取100μL並將之添加至該96-井培養盤的各井中，繼而於室溫下反應歷時2小時，接著使用ELISA套組(廠牌為Invitrogen，貨號為88-50490-88、88-50510-88、88-50520-88)並依據製造商的操作指南來進行第II型膠原蛋白-專一性的IgG、IgG2a以及IgG2b的含量測定。
之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。
在開始投藥之後的第42天結束之時，各組大鼠被犧牲，繼而剪取大鼠的腳踝組織並以液態氮予以磨碎(0.2g)，然後加入300μL的RIPA溶解緩衝液(RIPA lysis buffer)(廠牌為VWR Life Science，貨號為N653)[添加有蛋白酶抑制劑(protease
inhibitor)(廠牌為VWR Life Science，貨號為M221)、磷酸酶抑制劑(phosphatase inhibitor)(廠牌為BioVision，貨號為K282)以及EDTA]並予以混合均勻。接著，將所形成的混合物置於微量離心管中並於4℃下反應歷時30分鐘，繼而於4℃下以14,000rpm進行離心歷時15分鐘，然後收集上清液並以此作為總蛋白質樣品，接著藉由Bio-Rad蛋白質分析染劑濃縮物(Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate)來測定總蛋白質濃度。
之後，各組組織的總蛋白質樣品是採用熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術來進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析，以及針對SIRT1與COX-2作西方墨點分析(Western Blotting)。另外，β-肌動蛋白(β-actin)被用來作為內部對照組(internal control)。
有關SDS-PAGE分析以及西方墨點分析所使用的儀器與試劑分別如下所述：
(1)SDS-PAGE分析是使用一Bio-Rad電泳系統(Mini-PROTEAN Electrophoresis System,Bio-Rad)來進行。
(2)蛋白質轉印(protein transfer)是使用Bio-Rad濕式電泳轉印槽(Mini Trans-Blot® Cell,Bio-Rad)以及聚二氟乙
烯(PVDF)膜[polyvinylidene difluoride(PVDF)membrane]來進行。
(3)在西方墨點分析中，針對各個蛋白質所使用的一次抗體(primary antibody)以及二次抗體(secondary antibody)分別被顯示於下面表9中。
(4)化學發光染色(chemiluminescence staining)是使用SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate偵測套組(廠牌為Thermo Fisher Scientific，貨號為TG268240A)來進行，並使用一ChemiDocTM成像系統(ChemiDocTM imaging system)(廠牌為Bio-Rad，型號為ChemiDocTM)來偵測訊號。
之後，使用ImageJ成像軟體來進行分析，藉此蛋白質帶(protein band)能夠被半-定量地計算出所對應的蛋白質表現量，SIRT1以及COX-2的表現量接而以對應的β-肌動蛋白蛋白質表現量來予以標準化(normalized)。
各組相對於正常對照組的SIRT1以及COX-2的相對表現量是藉由將經標準化之各組的SIRT1以及COX-2的表現量代入下列公式(1)而被計算出：公式(1)：A=B/C其中：A=SIRT1或COX-2的相對表現量
B=經標準化之各組的SIRT1或COX-2的表現量
C=經標準化之正常對照組的SIRT1或COX-2的表現量
之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。
藉由觀察各組大鼠的四肢腳掌關節的型態可見，病理對照組的大鼠的腳掌與腳趾皆呈現出嚴重的腫脹，而活菌實驗組與熱致死菌實驗組的大鼠的腳掌與腳趾的腫脹程度則皆有呈現出明顯的減輕，其中又以熱致死菌實驗組的減輕情形更為顯著(數據未顯
示)。這個實驗結果顯示：本發明的戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557(BCRC 910780)不論呈活菌或死菌的形式皆能夠改善關節炎病況。
圖19至圖21分別顯示在開始投藥之後的第42天結束之時，各組大鼠的血清所測得的第II型膠原蛋白-專一性的IgG2a、IgG2b以及IgG含量。從圖19至圖21可見，與正常對照組相較之下，病理對照組的第II型膠原蛋白-專一性的IgG2a、IgG2b以及IgG含量皆有顯著的升高，這表示第II型膠原蛋白成功地誘發小鼠產生關節炎。而與病理對照組相較之下，活菌實驗組與熱致死菌實驗組的第II型膠原蛋白-專一性的IgG2a、IgG2b以及IgG含量皆有明顯的降低，其中又以熱致死菌實驗組的降低程度更為顯著。這個實驗結果顯示：本發明的戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557(BCRC 910780)不論呈活菌或死菌的形式皆能夠有效地降低血清中的發炎指標。
圖22顯示各組大鼠的腳掌組織所測得的SIRT1的相對表現量。從圖22可見，與正常對照組的大鼠的腳掌組織相較之下，病理對照組的大鼠的腳掌組織會大幅度地降低SIRT1的表現，這表示第II型膠原蛋白成功地誘發大鼠的腳掌組織產生發炎反應。而與病理對照組相較之下，活菌實驗組與熱致死菌實驗組的SIRT1的相對表現量皆呈現明顯升高的情形。
圖23顯示各組大鼠的腳掌組織所測得的COX-2的相對表現量。從圖23可見，與正常對照組的大鼠的腳掌組織相較之下，病理對照組的大鼠的腳掌組織會大量地表現COX-2，這表示第II型膠原蛋白成功地誘發大鼠的腳掌組織產生發炎反應。而與病理對照組相較之下，活菌實驗組與熱致死菌實驗組的COX-2的相對表現量皆呈現明顯下降的情形。特別地，熱致死菌實驗組的COX-2的相對表現量是近似於正常對照組所具者。這個實驗結果顯示：本發明的戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557(BCRC 910780)不論呈活菌或死菌的形式皆能夠有效地降低病灶處的發炎指標。
綜合以上的實驗結果可知：本發明的戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557(BCRC 910780)不論呈活菌或死菌的形式皆能夠有效地保護大鼠對抗關節炎。
於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。
雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。
TW中華民國；食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)；2017/05/17；BCRC 910780。
DE德國；德國微生物以及細胞培養物收集中心有限公司(DSMZ)；2020/08/10；DSM 33617。
Claims (6)
- 一種戴白氏乳桿菌乳酸亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis)LDL557，其以寄存編號BCRC 910780被寄存於財團法人食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心。
- 一種如請求項1的戴白氏乳桿菌乳酸亞種LDL557(BCRC 910780)供應用於製備一用來預防和/或治療發炎-相關疾病(inflammation-related disorders)之組成物的用途，其中該發炎-相關疾病是選自於由下列所構成的群組：過敏(allergy)、氣喘(asthma)、關節炎(arthritis)，以及它們的組合。
- 如請求項2的用途，其中該組成物是一食品組成物。
- 如請求項2的用途，其中該組成物是一藥學組成物。
- 如請求項4的用途，其中該藥學組成物進一步包含有一藥學上可接受的載劑。
- 如請求項4的用途，其中該藥學組成物是呈一供一選自於下列的投藥途徑之劑型：口服投藥、非經腸道投藥、呼吸道投藥，以及局部投藥。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| GD4A | Issue of patent certificate for granted invention patent |