BRPI0811973B1 - Processo para a seleção de probióticos, cepa probiótica, sobrenadante, composição, produto farmacêutico, alimento ou produto nutricional e uso de uma cepa probiótica - Google Patents

Abstract

PROCESSO PARA A SELEÇÃO DE PROBIÓTICOS, CEPA PROBIÓTICA, SOBRENADANTE, COMPOSIÇÃO, PRODUTO FARMACÊUTICO, ALIMENTO OU PRODUTO NUTRICIONAL E USO DE UMA CEPA PROBIÓTICA A presente invenção refere-se a uma nova abordagem para prevenir ou tratar a mastite, em seres humanos e animais, através do uso de microorganismos derivados do leite de mamíferos obtidos a partir de hospedeiros saudáveis das espécies homólogas; a aqueles novos microorganismos probióticos obtidos do leite capazes de reduzir a mastite infecciosa e o método de seleção utilizado para a sua obtenção; ao uso dessas bactérias mastite e outras doenças; e, finalmente, às composições contendo estes compostos.

Description

Campo da Invenção

Refere-se a presente invenção a uma nova abordagem para prevenir ou tratar mastite tanto em seres humanos quanto em animais através do uso de microorga-nismos derivados do leite de mamíferos obtidos a partir 10 de hospedeiros saudáveis das espécies homólogas; aos novos microorganismos probióticos obtidos a partir de leite capazes de reduzirem mastite infecciosa; ao uso destas bactérias prohiõticas para a profilaxia ou tra-tamento contra mastite e outras enfermidades; e final- 15 mente, às composições que compreendem estes compostos.

Antecedentes da Invenção

A mastite é uma inflamação e infecção da glândula mamária que é particularmente freqüente nas mulheres e outras fêmeas mamíferas durante a lactação.

A mastite é causada principalmente por seleção e super- crescimento de estafilococos e/ou estreptococos nos condutos mamários e glândulas aureolares mamárias. A mastite humana afeta até 30% das mulheres lactantes e conduz frequentemente a um desaleitamento precoce e 25 indesejável porque ela é uma condição realmente dolorosa .

Além disso, a mastite não é uma patologia específica humana, mas afeta todas as espécies de mamífe- ros. Neste sentido, a mastite infecciosa em espécies e cepas de animais criados para a produção de leite, tais como vacas, ovelhas ou cabras, constitui um importante problema econômico uma vez que o leite produzido duran- 5 te o processo infeccioso deve ser descartado devido às altas contagens bacterianas e de células somáticas. A- lém disso, a mastite pode ser um importante problema naquelas espécies domésticas (porcos, coelhos...) e espécies (por exemplo, bovinas produtoras de carne) não de- 10 dicadas à produção de leite uma vez que um suprimento de leite reduzido de baixa qualidade bacteriológica pode aumentar notavelmente as taxas de morbidez e mortalidade entre a progénie.

Nestes casos, a terapia baseada em antibióticos 15 emergiu como a única opção terapêutica. Não obstante, os atuais antibióticos de espectro amplo ou rotulados de Gram, positivos são insuficientemente efetivos para as cepas estafilocóquicas e estreptocóquicas causadoras de mastite e, com efeito, tais tratamentos podem ser, 20 em algumas circunstâncias, prejudiciais porque eles u- sualmente eliminam a flora comensal que caracteriza o leite de mamíferos, que poderia exercer alguns efeitos protetores. Além disso, a terapia por antibióticos pode resultar no aparecimento de resíduos antibióticos no 25 leite, que também é prejudicial se ocorrer durante o período de lactação. Alternativamente, também se utilizou GM-CSF bovino recombinante para o tratamento de mastite subclínica causada por S.aureus (Takahashi,H. et al. 2004, Cad. J. Vet. Res. 68:182-187), mas não se mostrou eficiente no tratamento da infecção de S.aureus no estágio posterior.

Uma abordagem alternativa para o tratamento de i mastite consiste no uso de probióticos. Por exemplo, Sytnik,S.I. et al. (Vrach Delo., 1990, 3:98-100) tentaram usar Bifidobacterium para a prevenção de mastite, mas não observaram qualquer inibição no tempo de permanência da microflora do peito, Greene,W.A. et al. (J.Dairy Sci., 1991, 74:2976-2981) descreveram o uso de um preparado de lactobacilos comercial para o tratamento de contagem elevada de células somáticas (SSC) quando administrado por injeção intramamária direta, mas concluíram que o produto de lactobacilos utilizado no 15 ensaio não foi efetivo como um tratamento intramamário de mastite subclínica baseado em SCO. A patente US 4.591.499 descreve um método para o tratamento de mastite utilizando-se uma injeção intramamária de um óleo em uma emulsão aquosa que contém uma cepa de lactobaci- 20 los não-patogênicos ou uma mistura de cepas. Não obstante, as cepas descritas neste documento parecem agir por meio de uma diminuição não específica no pH na glândula mamária e, devido à sua formulação particular como emulsões, precisa ser administrada por injeção in- 25 tramamária direta. A patente russa RU2134583 descreve o uso de composição tópica que contém lactobacterin (massa microbiana de lacto-bactérias que foram líofilizadas / submetidas a secagem vivas em meio de cultura) ou bi- fidumbacteriπ (urn biopreparado liofilizado imobilizado em carvão vegetal ativado especial) para o tratamento de disseminação maciça de micróbios de leite de peito. Entretanto, este preparado é adequado somente para a 5 administração tópica e forma parte de um tratamento de várias partes que inclui massagem de relaxamento e a- plicação de uma suspensão de organismos derivados da flora normal do intestino que contém adicionalmente um meio de formação de película protetora. O pedido de pa- tente internacional WO 05/34970 descreve o tratamento de mastite por injeção intramamária direta de uma cepa de Lactococcus lactis.

Portanto, toda a técnica anterior descrita retro refere-se ao uso de cepas probióticas seja por in- 15 jeção intramamária ou aplicação tópica. Desta forma, existe uma necessidade na técnica quanto a abordagens adicionais para permitirem a prevenção e tratamento de mastite ande de outras patologias das glândulas mamárias, nas mulheres e em outras fêmeas mamíferas, que 20 possam ser mais facilmente aplicadas e por meios menos invasivos.

Sumário da Invenção

A presente invenção é baseada na descoberta i- nesperada e surpreendente de que o leite de mamíferos 25 contém cepas probióticas que têm a capacidade de ser transferidas para a glândula mamária depois da sua ingestão oral, e exercem um efeito terapêutico localmente contra os agentes patogênicos que causam mastite, aju dando assim a reduzir a incidência de mastite. Além disso, estas cepas têm um número de propriedades vantajosas adicionais inesperadas que as tornam benéficas para o tratamento de outras enfermidades. A presente 5 invenção é vantajosa com relação aos métodos conhecidos na técnica em vista das propriedades valiosas que a lactação pode proporcionar, e devido ao interesse econômico da produtividade do leite para os fazendeiros.

Em um primeiro aspecto, a invenção proporciona 10 um processo para a seleção de probióticos que compreende as etapas de: (i) isolar as cepas de bactérias ou bifidobac- térias de ácido láctico presentes no leite fresco proveniente de uma espécie mamífera, por 15 seleção em meios de cultura de ácido láctico, (ii) selecionar as cepas provenientes da etapa (i) que são capazes de serem transferidas para a glândula mamária depois de ingestão oral e/ou colonizar a glândula mamária depois da sua a- 20 plicação tópica, (iii) selecionar as cepas provenientes da etapa (ii) que são capazes de reduzir as taxas de sobrevivência e/ou as taxas de aderência às células epiteliais de Staphylococcus aureus e (iv) selecionar as cepas provenientes da etapa (iii) que são capazes de proteger os animais contra a mastite.

Em outro aspecto, a invenção proporciona cepas probióticas capazes de ser obtidas pelo processo da invenção .

Em outro aspecto, a invenção proporciona um so- 5 brenadante de uma cultura de uma cepa ou de uma mistura de cepas de acordo com a invenção.

Em outro aspecto, a invenção proporciona uma composição, um produto farmacêutico, um alimento ou um produto de nutrição que compreende pelo menos uma cepa 10 probiótica da invenção ou um sobrenadante de uma cultura de uma ou mais cepas da invenção.

Em outro aspecto, a invenção proporciona o uso das cepas probióticas da invenção ou a cultura sobrenadante para a manufatura de um medicamento para o trata- 15 mento e/ou profilaxia de uma infecção ou infestação crônica ou aguda, ou de uma colonização microbiana indesejável, em que a infecção, infestação ou colonização é causada por parasitas, bactérias, lêvedo, fungos ou vírus, que afetam qualquer superfície do corpo ou mu- 20 cosa em um paciente ou animal com necessidade do mesmo.

Em outro aspecto, a invenção proporciona o uso de uma cepa probiótica ou de uma mistura de cepas probióticas da invenção ou da cultura sobrenadante para a manufatura de um medicamento para o tratamento e/ou 25 profilaxia de reações de hipersensibilidade a alimento e intolerância metabólica; de constipação e outros distúrbios gastrintestinais; de distúrbios inflamatórios ou auto-imunes selecionados a partir do grupo de IBD, colite ulcerativa, artrite, aterosclerose, esclerose múltipla, psoríase ou sarcoidose; e de crescimento de tumores, metástase e câncer em pacientes ou animais com necessidade dos mesmos.

Em outro aspecto, a invenção proporciona o uso de uma cepa probiótica ou de uma mistura de cepas pro- bióticas ou da cultura sobrenadante da invenção para a manufatura de um medicamento para o tratamento e/ou profilaxia de distúrbios alérgicos e asma em um pacien- 10 te ou animal com necessidade do mesmo.

Em outro aspecto, a invenção proporciona o uso de uma cepa probiótica ou de uma mistura de cepas pro- bióticas ou da cultura sobrenadante da invenção para a manufatura de um medicamento para o tratamento e/ou 15 profilaxia de níveis imunes temporariamente abaixados em indivíduos ou animais submetidos a estresse fisiológico e derivado de gerenciamento.

Descrição Breve dos Desenhos

A Figura 1 proporciona as sequências das se- 20 qüências 16S rRNA das bactérias de cepas probióticas incluídas nesta invenção e seu perfil PCR-RAPD.

A Figura 2 é um gráfico de barras que mostra a capacidade de transferência para a glândula mamária e da colonização de intestino pelas cepas da presente in- 25 venção em camundongos. O número de lactobacilos (barras de cor cinza), bifidobactérias (barras pretas) e ente- rococos (barras brancas) em amostras de leite emitido e de fecais em camundongos em amamentação suplementada diariamente, durante 14 dias, com 108 cfu das cepas rotuladas geneticamente foi analisado por chapeamento de colônia bacteriana. As amostras de leite e fecais foram coletadas no dia 0, 5 e 10 da suplementação probiõtica.

As colônias PCR-positivas no leite estão indicadas como % (percentagem).

A Figura 3 é um gráfico de barras que mostra a inibição da sobrevivência de estafilococos e aderência produzida depois de co-cultura dos estafilococos com as 10 cepas incluídas nesta invenção. A) O efeito inibitório dos probióticos incluídos nesta invenção na sobrevivência de Staphylococcus aureus foi avaliado in vitro por um ensaio de difusão de cavidade de ágar em placas TSA. O diâmetro do halo de inibição (em milímetros) causado 15 pelos sobrenadantes bacterianos determina o efeito an- timicrobiano. B) A aderência da cepa Staphylococcus aureus patogênica às células Caco-2 foi avaliada na presença das cepas probióticas desta invenção. Contaram-se dez campos aleatórios e os resultados expressos como a 20 média da % das bactérias gram negativas aderentes vinculadas às células comparadas com o número de bactérias patogênicas aderentes na ausência de probióticos.

A Figura 4 é um gráfico de barras que mostra a proteção em. relação a mastite de estafilococos. A mas- 25 tite foi induzida em camundongos em amamentação 10 dias após-parto por injeção de 10s cfu de S. aureus no quarto par mamário. A carga de estafilococos no leite extraído (A) e a contagem mamária inflamatória (B) foi avaliada depois de 5 e 10 dias da infecção.

A Figura 5 é um grafico de barras que mostra a aderência de cepas probióticas às células intestinais. A aderência das cepas probióticas desta invenção foi 5 avaliada utilizando-se linhas de células intestinais Caco-2 (barras de cor cinza) ou HT-29 (barras pretas). Contaram-se vinte campos aleatórios e os resultados expressos como a média do número de bactérias vinculadas às células por campo ±SD.

A Figura 6 é um gráfico de barras que mostra a sobrevivência das cepas probióticas às condições que lembram a digestão. A resistência das cepas probióticas desta invenção ao teor ácido (barras de cor cinza) e alto teor de sal de bílis (barras pretas) foi avaliada in vitro por cultura das bactérias em MRS pH 3,0 ou 0,15% sais de bílis durante 90 minutos. Os resultados estão representados como a ±SD média de três experiências independentes.

A Figura 7 mostra o efeito das cepas probióti- 20 cas em um modelo de infecção por Salmonella induzida oralmente. A) Gráfico de barras que mostra o efeito do tratamento probiótico na inibição da translocação de Salmonella para a passarinha. O número de colônias de Salmonella foi medido nas passarinhas de camundongos 25 tratados com os probióticos, com vacinação (barras de cor cinza) ou sem vacinação (barras pretas) com 10s cfu de Salmonella desativada, depois de 24 horas de uma provocação oral com 1010 cfu de Salmonella. B) Curvas de sobrevivência dos animais depois da infecção por Salmonella.

A Figura 8 é um gráfico de barras que mostra o efeito de cepas probióticas na expressão G de citoquina 5 e imunoglobulina. A produção de citoquinas TNF-a (A) e IL-10 (B) foi analisada em macrófagos derivados de medula óssea estimulados com LPS e a cepa probiótica indicada durante 12 horas, enquanto a expressão de IgG (C) foi analisada em linfócitos obtidos a partir da 10 passarinha de camundongos Balb/c (idade de 6-8 semanas) estimulados com LPS e a probiótica de cepas indicadas durante 6 dias. A produção tanto de citoquinas quanto de IgG foi detectada por ELISA.

Descrição Detalhada da Invenção

A invenção proporciona um novo método para o tratamento profilático e terapêutico de mastite infecciosa tanto em mulheres quanto em outras fêmeas mamíferas com necessidade do mesmo. O método é baseado no uso de cepas probióticas específicas selecionadas especial- 20 mente para essa aplicação particular.

Em um primeiro aspecto, a invenção proporciona um processo para a seleção de probióticos que compreende as etapas de: (i) isolar as cepas de bactérias ou bifidobac- 25 térias de ácido láçtico presentes no leite fresco proveniente de uma espécie mamífera, por seleção em meios de cultura de ácido láctico, (ii) selecionar as cepas provenientes da etapa (i) que são capazes de serem transferidas para a glândula mamária depois de ingestão oral e/ou colonizar a glândula mamária de- 5 pois da sua aplicação tópica, (iii) selecionar as cepas provenientes da etapa (ii) que são capazes de reduzir as taxas de sobrevivência e/ou as taxas de aderência às células epiteliais de Staphylococcus aureus 10 e (iv) selecionar as cepas provenientes da etapa (iii) que são capazes de proteger os animais contra a mastite.

Na etapa (i), qualquer leite obtido a partir de 15 um organismo de mamífero pode ser usado como material de partida para o processo da invenção. Em uma concretização preferida, o leite usado é leite humano, bovino, porcino, de ovelha, gato ou canino. Além disso, qualquer meio de cultura ácida láctica conhecido na 20 técnica pode ser usado para selecionar as cepas. Prefe- rentemente, os meios de cultura de ácido láctico são selecionados a partir do meio MRS, meio APT, meio RCM, meio LM17, meio GM17 e meio Elliker. Com maior preferência, os meios de cultura de ácido láctico compreen- 25 dem o meio MRS.

Na etapa (ii), as cepas isoladas na etapa (i) são selecionadas com base na sua capacidade de serem transferidas para a glândula mamária depois de oral e/ou colonização da glândula mamária depois de aplicação tópica. Para a detecção da capacidade de serem transferidas para a glândula mamaria, pode ser usado um ensaio tal como descrito em W02004003235 para detectar 5 a transferência de um microorganismo para o leite depois da ingestão oral.

Na etapa (iii), poderá ser usado qualquer ensaio conhecido na técnica para medir percentagens de sobrevivência de Staphylococcus e para medir percenta- 10 gens de aderência de S.aureus às células epiteliais.

Em uma concretização preferida, o efeito dos probióti- cos nas percentagens de aderência é medido utilizando- se uma cultura confluente de uma linha de células intestinais às quais são adicionadas as células S.aureus 15 e os probiôticos da invenção e o número de células S. aureus vinculadas é medido por meio de qualquer técnica adequada. Tipicamente, a linha de células intestinais é a Caco-2 e o número de células vinculadas é medido por inspeção direta das monocamadas de células sob 20 microscopia luminosa. Além disso, a etapa de seleção (iii) pode também ou alternativamente envolver a medição da viabilidade de S.aureus na presença das cepas probióticas. Poderá ser usado qualquer ensaio adequado para medir a inibição de crescimento das cepas bacteri- 25 anas. Tipicamente, a avaliação da viabilidade de S.aureus é realizada por meio de um ensaio de difusão em cavidade de ágar.

Na etapa (iv), pode utilizar-se qualquer ensaio para medir a proteção de mastite. Preferentemente, o ensaio envolve a utilização de um modelo de mastite de animal, em que pelo menos um dos agentes patogênicos conhecidos como agente causador de mastite é injetado 5 dentro da glândula mamária. Com maior preferência, o modelo de animal é um camundongo e o agente patogênico que precisa ser administrado para provocar a mastite ê S.aureus.

Em outro aspecto, a invenção proporciona uma 10 cepa probiótica que é capaz de ser obtida pelo processo da invenção. Preferentemente, a cepa probiótica é sele-cionada a partir do grupo de Bifidobacterium breve depositado no CECT sob o N° de Acesso 7263, Bifidobacterium breve depositado no CECT sob o N° de Acesso 7264, 15 Lactobacillus reuteri depositado no CECT sob o Ne de Acesso 7260, Lactobacillus plantarum depositado no CECT sob o N° de Acesso 7262, Lactobacillus fermentum depositado no CECT sob o N° de Acesso 7265, Lactobacillus reuteri depositado no CECT sob o N’ de Acesso 7266, 20 Lactobacillus salivarius depositado no CECT sob o N“ de Acesso 7409, Enterococos hirae depositado no CECT sob o N° de Acesso 7410, Enterococcus faecalis depositado no CECT sob o N' de Acesso 7411, Lactobacillus plantarum depositado no CECT sob o N° de Acesso 7412, Lactobacil- 25 lus reuteri depositado no CECT sob o N° de Acesso 7413.

Em outro aspecto, a invenção proporciona um sobrenadante de uma cultura de uma ou mais das cepas de acordo com a invenção. 0 sobrenadante pode ser obtido a partir da cultura por quaisquer meios disponíveis para a pessoa versada na técnica, incluindo centrifugação, filtragem, flotação e assemelhados.

Em outro aspecto, a invenção proporciona uma 5 cepa probiõtica ou uma mistura de cepas probióticas de acordo com a invenção ou um sobrenadante de uma cultura de uma ou mais das cepas de acordo com a invenção para o uso como um medicamento.

Em outro aspecto, a invenção proporciona uma 10 composição que compreende pelo menos uma das cepas bac- terianas da invenção. Preferentemente, a composição compreende pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5 ou pelo menos 6 das cepas da invenção, e em que cada uma das cepas é representada em uma compo- 15 sição em uma proporção de 0,1% a 99,9%, preferentemente desde 1% até 99%, com maior preferência desde 10% até 90%. Em outra concretização, a composição compreende qualquer uma das cepas bacterianas da invenção em conjunto com outra cepa ou mistura de cepas e onde cada 20 uma das cepas é representada em uma composição em uma proporção de 0,% até 99,9%, preferentemente desde 1% até 99%, com maior preferência desde 10% até 90%. Em outro aspecto, a invenção proporciona uma composição que compreende um sobrenadante de uma cultura de uma ou 25 mais das cepas de acordo com a invenção. Preferentemente, o sobrenadante é representado em uma composição em uma proporção de 0,1% até 99,9%, com maior preferência desde 1% até 99% e ainda com maior preferência desde 10% até 90%,

Em outro aspecto, a invenção proporciona uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente efetiva de pelo menos uma cepa ou uma. composição da invenção ou de um sobrenadante de uma cultura de uma ou mais das cepas de acordo com a invenção. O preparado farmacêutico pode assumir a forma de comprimidos, cápsulas, suspensões bacterianas líquidas, suplementos orais secos, suplementos orais úmidos, su- 10 primento em tubo seco ou um suprimento em tubo úmido.

Preferentemente o probiótico, a composição que contém probiótico ou que contém sobrenadante e o produto farmacêutico é encaminhado para a superfície de mucosa o- ral, gástrica e/ou intestinal; não obstante, ele poderá 15 ser igualmente dirigido para a mucosa naso-faríngea, respiratória, reprodutora ou glandular, e/ou para a glândula mamária e ele poderá ser administrado às mulheres e animais por uma rota oral, nasal, ocular, retal, tópica e/ou vaginal,

Em outro aspecto, a invenção proporciona um a- limento ou um produto nutritivo que compreende pelo menos uma cepa probiótica de acordo com a invenção ou de um sobrenadante de uma cultura de uma ou mais das cepas de acordo com a invenção. Exemplos não limitativos de 25 produtos alimentícios que podem ser usados na presente invenção são leite, iogurte, queijo, coalho, leites fermentados, produtos fermentados baseados em leite, produtos fermentados baseados em cereal fermentando, produtos de carne fermentados, outros pós baseados em leite ou baseados em cereais, fórmulas de nutrição clínicas, sorvetes, sucos, pão, bolos ou doces, formulações de alimentação para animais, formulações para die- 5 ta semi- ou sintéticas, fórmulas para crianças, fórmulas de nutrição clínicas, sorvetes, sucos, farinhas, pão, bolos, doces ou gomas de mascar.

A quantidade de dosagem requerida das cepas probióticas em uma composição, alimento ou composição 10 farmacêutica descrita anteriormente será variável de acordo com a natureza do distúrbio ou do uso proposto de uma composição, seja ela usada profilaticamente ou terapeuticamente e do tipo de organismo envolvido.

Qualquer dosagem adequada dos probióticos ou 15 suas combinações pode ser usada na presente invenção a partir do momento em que os efeitos tóxicos não excedam os efeitos terapêuticos, A eficácia terapêutica e a toxicidade podem ser determinadas por meio de procedimentos farmacêuticos padrão com animais experimentais, 20 tais como pelo cálculo estatístico de ED, (a dose terapeuticamente efetiva em 50% da população) ou LD (a dose letal para 50% da população). A proporção de dosagem de efeitos tóxicos para terapêuticos constitui o índice terapêutico, o qual pode ser expresso como a relação 25 LD/ED. Não obstante, a atividade dos novos microorganismos no indivíduo é dependente, naturalmente, da dose. Ou seja, quanto mais dos novos microorganismos são incorporados por meio da ingestão ou administração do material alimentício ou da composição farmacêutica mencionados retro, mais alta será a atividade protetora e/ou terapêutica dos microorganismos. Uma vez que os microorganismos desta invenção não são prejudiciais pa- 5 ra a raça humana e animais e foram eventualmente a partir de leite do peito humano saudável, uma alta quantidade do mesmo pode ser incorporada de maneira que essencialmente uma alta proporção da mucosa do indivíduo será colonizada pelos novos microorganismos. São prefe- 10 ridas as composições que exibem altos índices terapêu ticos. Os dados obtidos a partir de estudos de animais são usados para formular uma faixa de dosagem para o uso humano ou em animais. A dosagem contidas em tais composições está preferentemente dentro de uma faixa de 15 concentrações circulantes que incluem a ED, com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem varia dentro desta faixa na dependência da forma de dosagem empregada, da sensibilidade do paciente, e da via de administração. A dosagem exata será determinada do clínico, à luz de fa- 20 tores relacionados com o paciente que requer tratamento. Por exemplo, para preparar uma composição alimentícia de acordo com a presente invenção pelo menos uma das cepas probióticas da presente invenção é incorporada em um suporte adequado, em uma quantidade que vai de 25 105 cfu/g até cerca de 1012 cfu/g de material de supor te, preferentemente desde cerca de 106 cfu/g até cerca de 1011 cfu/g de material de suporte, com maior preferência desde cerca de 106 cfu/g até cerca de IO10 cfu/g de material de suporte.

No caso de uma composição farmacêutica, a dosagem da cepa probiótica deverá variar desde cerca de 105 cfu/g atê cerca de IO14 cfu/g de material de suporte, 5 preferentemente desde cerca de 10s cfu/g até cerca de IO13 cfu/g de material de suporte, com maior preferência desde cerca de 107 cfu/g até cerca de 1012 cfu/g de material de suporte. Para o propósito da presente invenção a abreviatura cfu designará uma "unidade de for- 10 mação de colônia" gue é definida como o número de células bacterianas tais como reveladas por contagens mi- crobiológicas em placas de ágar.

A dosagem e administração são ajustadas para proporcionarem níveis suficientes da metade ativa ou 15 para manterem o efeito desejado. Os fatores que podem ser levados em consideração incluem a seriedade da condição enferma, a saúde geral do paciente, a idade, peso, e sexo do paciente, tempo e freqüência de administração, combinação(s) de drogas, sensibilidades de rea- 20 ção, e resposta à terapia. Composições de longa ação podem ser administradas a cada 3 a 4 dias, a cada semana, ou bi-semanalmente na dependência da semi-vida e taxa de liberação da formulação particular.

Em uma concretização preferida, a invenção tam- 25 bém se refere às composições das cepas desta invenção em uma forma seca, submetida a secagem por congelamento, liofilizada, que pode ser obtida por qualquer méto do convencional conhecido na técnica.

Em outro aspecto, a invenção proporciona uma composição, produto farmacêutico, alimento ou produto nutritivo em que a cepa probiótica ou a sua mistura en-contra-se em uma forma parcialmente ou totalmente desa- 5 tivada.

Muitas pessoas têm uma microflora intestinal perturbada, ou seja, o equilíbrio entre bactérias intestinais benéficas e prejudiciais está perturbado. Um número de fatores, entre outros estresse, a presença de 10 sais de bílis, e especialmente dieta, influenciam a flora bacteriana. Nestas situações o processo de fermentação poderá ser perturbado e o número de bactérias benéficas será reduzido, com a consegüência de que a mucosa do cólon fica seca e deixa de funcionar ao mesmo 15 tempo em que bactérias potencialmente malignas crescem rapidamente em número. As cepas probióticas da invenção são capazes de prevenir a aderência da S.aureus às células epiteliais, bem como de reduzir as taxas de sobrevivência das células S.aureus e de muitos outros a- 20 gentes patogênicos. Desta forma, as cepas probióticas da invenção são particularmente benéficas para o tratamento das ditas enfermidades uma vez que elas contribuem efetivamente para a matança dos agentes patogênicos; aô mesmo tempo em que contribuem para a repovoação da 25 superfície da mucosa com a microflora fisiológica.

Por esta razão, um aspecto um aspecto desta invenção consiste no uso de probióticos da invenção e dos sobrenadantes de uma cultura de uma ou mais cepas da invenção para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento profilático ou terapêutico de infecção crônica ou aguda, ou infestação ou de colonização microbiana indesejável, de uma superfície de mu- 5 cosas ou qualquer outra localização humana, em que a infecção, infestação ou colonização é provocada por parasitas, bactérias, lêvedo, fungos ou vírus, afetando qualquer superfície ou mucosa do corpo, o dito tratamento terapêutico compreendendo a administração de uma 10 quantidade efetiva de um probiótico, ou uma composição que contém probiótico, a um paciente com necessidade do mesmo. De acordo com uma concretização preferida, a infecção ou colonização é causada por parasitas, bactérias, lêvedo, fungos ou vírus, de qualquer superfície 15 ou mucosa do corpo em um paciente ou animal com necessidade da mesma.

Os probióticos da invenção foram selecionados com base na sua capacidade de colonizar a glândula mamária depois de ingestão oral e para prevenir a aderên- 20 cia às células epiteliais e para diminuir a sobrevivência de S. aureus. Assim, as cepas são adequadas para tratamento de mastite. Conseqüentemente, em outro aspecto, a invenção proporciona o uso das cepas probióticas da invenção e dos sobrenadantes de uma cultura de 25 uma ou mais cepas da invenção para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento ou profilaxia de mastite infecciosa em seres humanos e animais. Este processo consiste no uso de cepas probióticas selecio nadas a partir de leite fresco homólogo e na capacidade destas cepas serem transferidas para a glândula mamaria e exercer ali seus benefícios, tais como a inibição da infecção estafilocóquica.

Além disso, as cepas probióticas da invenção mostraram também possuir algumas das características atribuídas a um cepa probiótica potencial, tais como segurança e boa resistência ao processo de digestão e a capacidade de colonização do intestino. Portanto, as 10 cepas são capazes de alcançar o trato intestinal depois da ingestão oral e ali exercer as suas propriedades terapêuticas. Consequentemente, em uma concretização preferida, a invenção proporciona o uso das cepas probióticas da invenção e do sobrenadante de uma cultura de 15 uma ou mais das cepas da invenção para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de diarréia neonatal.

As cepas probióticas são conhecidas por reduzirem a produção de citoquinas pró-inflamatórias por ma- 20 crófagos ativados durante distúrbios inflamatórios crônicos. Consequentemente, em outro aspecto, a invenção proporciona o uso das cepas bacterianas, composições da invenção e sobrenadantes da cultura de uma ou mais cepas da invenção para a preparação de uma composição 25 farmacêutica para a manufatura de um medicamento para o tratamento de distúrbios inflamatórios ou auto-imunes. Exemplos não limitativos de tais enfermidades inflamatórias e auto-imunes incluem IBD, colite ulcerosa, ar- trite, aterosclerose, esclerose múltipla, psoríase ou sarcoidose.

As cepas probióticas de acordo com a invenção são capazes de repopular a barreira do intestino imune 5 depois de ingestão oral e desta forma, elas também são particularmente adequadas para o aperfeiçoamento da barreira do intestino imune em um paciente ou animal com necessidade da mesma. Consequentemente, de acordo com outro aspecto, a invenção proporciona o uso de uma 10 ou mais cepas probióticas da invenção e dos sobrenadan- tes de uma cultura de uma ou mais cepas da invenção para a preparação de uma composição farmacêutica adequada para a preparação de um medicamento para o tratamento e/ou profilaxia de reações de hipersensibilidade a ali- 15 mento e intolerância metabólica, tal como intolerância a lactose; de constipação e de outros distúrbios gas-trintestinais . Sabe-se que os probióticos são benéficos para neutralizar o câncer devido aos seus efeitos na inibi- 20 ção das toxinas carcinogênicas nos intestinos, tais como nitrosaminas, mas também para o efeito destes probióticos na modulação da resposta imune natural. Consequentemente, em outro aspecto, a invenção proporciona o uso das cepas estabelecidas nesta invenção e dos sobre- 25 nadantes de uma cultura de uma ou mais cepas da invenção para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento profilático ou terapêutico de alguns tipos de câncer e para a inibição de crescimento de tu mores, metástase e câncer em paciente ou animal com necessidade do mesmo.

As cepas da invenção são capazes de modular a resposta imune e o equilíbrio entre as citoquinas Thl e 5 Th2 . Consequentemente, em outro aspecto, a invenção proporciona o uso da cepa, composições e sobrenadantes da invenção na manufatura de um medicamento para o tratamento e/ou profilaxia de distúrbios alérgicos, asma e distúrbios relacionados com o desenvolvimento de tole- 10 rância contra proteínas ingeridas.

Em outro aspecto, a invenção proporciona o uso das cepas, composições e sobrenadante da invenção na manufatura de um medicamento para o tratamento e/ou profilaxia de níveis imunes temporariamente deprimidos 15 em indivíduos, tais como aqueles produzidos durante o envelhecimento ou em indivíduos saudáveis que estão sujeitos a esforço intenso ou em geral a uma grande tensão fisiológica ou estresse.

Em outro aspecto, a invenção proporciona o uso 20 terapêutico da cepa probiõtica, das combinações de cepas e dos sobrenadantes, em que a cepa ou cepas são administradas via oral, tópica, nasal, entérica, ocular, urogenital, retal ou vaginal.

Além disso, devido à presença das cepas sele- 25 cionadas no leite do peito, os pacientes com necessidade de tratamento poderão ser não somente aqueles que ingerem diretamente as cepas selecionadas, mas também os fetos ou bebês alimentados no peito. Consequentemen- te, ainda em outro aspecto, a invenção proporciona o uso das cepas, composições e sobrenadante da invenção na manufatura de um medicamento concebido para ser ad-ministrado à mulher em amamentação para o tratamento 5 terapêutico ou profilático de seus fetos e/ou seus bebês alimentados no peito.

Os métodos e exemplos expostos em seguida ilustram a invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1: Isolamento de probióticos em relação ao leite de mamífero

Amostras de leite fresco (coletaram-se 2 ml, exceto no caso das cadelas, foram de somente 0,5 ml) foram obtidas a partir de 23 mulheres saudáveis no dia 15 6-14 depois do trabalho; 8 porcas no dia 5 depois do trabalho, 9 cadelas no dia 2-10 depois do trabalho e 4 vacas no dia 2 depois do trabalho. Nenhuma das mulheres nem dos animais teve complicações durante o trabalho e nenhuma terapia de antibiótico foi administrada nas úl~ 20 timas duas semanas antes da coleta de amostra de leite. Todas as amostras de leite foram imediatamente congeladas a -80°C.

A fim de se isolarem as cepas bacterianas em relação a estas amostras, diluições em série de 0,1 ml 25 em água de peptona foram chapeadas em placas de ágar MRS, APT, RCM, LM17, GM17 e Elliker a 37°C nas condições tanto aeróbias quando anaeróbias durante 24-48 horas. Entre as aproximadamente 1200 colônias inicialmen- te obtidas, 120 (10%; incluem representativos de diferentes morfologias observadas nas placas) foram selecionadas e subcultivadas em ágar MRS a 37°C em condições anaeróbias. Entre elas, selecionaram-se ainda 68 5 isolados com as seguintes características: hastes não formadoras de esporos, catalase- e Gram positiva oxida- se -negativa .

Estes 68 isolados selecionados foram ainda caracterizados tanto fenotipicamente (API CH50, APIZYM e 10 avaliação de resistência antibiótica) quanto geneticamente (sequência 16S rRNA e perfil RAPD-PCR). Esta caracterização resultou em 59 diferentes cepas bacteria- nas que foram ainda avaliadas através do processo de peneiramento descrito nesta invenção a fim de se obte- 15 rem candidatos probióticos potenciais capazes de exercerem proteção contra mastite.

Depois deste processo de peneiramento, somente 6 cepas (2 provenientes de mulher, 2 provenientes de cadelas e 2 provenientes de porcas) preencheram todos 20 os critérios definidos. Outras cepas de bactérias de ácido láctico foram obtidas a partir de outras espécies de mamíferos, tais como cabra, ovelha, gata, rato e camundongos, mas elas não conseguiram preencher todos os critérios de peneiramento e por esta razão elas estão 25 incluídas nesta invenção. • Bifidobacterium breve as ditas bactérias foram obtidas a partir de leite humano • Bifidobacterium breve as ditas bactérias foram obti das a partir de leite humano • Lactobacillus reuteri as ditas bactérias foram obtidas a partir de leite porcino • Lactobacillus plantarum as ditas bactérias foram ob- 5 tidas a partir de leite porcino • Lactobacillus reuteri as ditas bactérias foram obtidas a partir de leite canino • Lactobacillus fermentum as ditas bactérias foram obtidas a partir de leite canino • Lactobacillus salivarius as ditas bactérias foram obtidas a partir de leite porcino • Enterococcus hirae as ditas bactérias foram obtidas a partir de leite felino • Enterococcus faecalis as ditas bactérias foram obti- 15 das a partir de leite felino • Lactobacillus plantarum as ditas bactérias foram obtidas a partir de leite felino • Lactobacillus reuteri as ditas bactérias foram obtidas a partir de leite canino

Exemplo 2: Caracterização fisiológica e genética

Todos estes isolados foram caracterizados fisiológica e geneticamente. Para a identificação de cada cepa probiõtica, os inventores realizaram uma análise de fermentação API 50CH (BioMerieux) das cepas a 37°C 25 em condições anaeróbias durante 24 e 48 horas, seguindo-se as instruções do fabricante. Os resultados de 24 horas foram sumariados na Tabela I. Um substrato capaz de ser fermentado positivo é aquele com um valor mais alto do que 3.

Devido à baixa especificidade da caracterização API, os inventores também realizaram a análise das sequências 16S rRNA das cepas bacterianas selecionadas. A 5 sequência 16S RNA das bactérias selecionadas e seu perfil RAPD-PCR estão ilustrados na Figura 1. Os resultados obtidos conduzem à classificação das cepas bacterianas tais como indicadas anteriormente. Com esta classificação, as cepas bacterianas da invenção foram depo- 10 sitadas de acordo com o Acordo de Budapeste na CECT - Colección Espanola de Cultivos Tipo-, Valencia (Spain) em 17 de abril de 2007 e corresponderam aos seguintes números de aprovação: * Bifidobacterium breve CECT7263 • Bifidobacterium breve CECT7264 • Lactobacillus reuteri CECT7260 • Lactobacillus plantarum CECT7262 • Lactobacillus reuteri CECT7265 • Lactobacillus fermentum CECT7266

As cepas bacterianas seguintes da invenção fo ram depositadas de acordo com o Budapest Agreement na CECT -Colección Espanola de Cultivos Tipo-, Valencia (Spain) em 30 de maio de 2008 • Lactobacillus salivarius CECT 7409 • Enterococcus hirae CECT 7410 • Enterococcus faecalis CECT 7411 • Lactobacillus plantarum CECT 7412 • Lactobacillus reuteri CECT 7413 Tabela I: Padrão de fermentação das diferentes cepas probióticas da invenção. Os substratos suscetíveis de fermentar positivos estão indicados na cor cinza.

Exemplo 3: Peneiramento seletivo das cepas Exemplo 3a: Transferência para a glândula mamária depois de ingestão oral

Uma vez que as diferentes cepas candidatas fo ram obtidas a partir de leite de mamífero como indicado nos primeiros critérios de seleção, a etapa seguinte no processo de seleção descrito na presente invenção é que as bactérias deverão ser capazes de ser transferidas para o leite depois de ingestão oral ou aplicação tópi- 5 ca. A fim de se testar esta capacidade, as cepas supostas foram rotuladas geneticamente tal como descrito an- teriormente (WO 2004/003235) e administradas oralmente a ratos prenhes como modelo de animal. Os lactobacilos, bifidobactérias e enterococos totais foram medidos no 10 leite e amostras fecais neonatais. Além disso, a transferência específica de bactérias foi analisada por pe- neiramento PCR das colônias obtidas a partir do leite de ratos lactantes e a partir de fezes neonatais.

Quatro ratos Wistar prenhes foram inoculados 15 via oral com 108 cfu cepas rotuladas geneticamente veiculadas em 0,5 ml de leite a cada dois dias duas semanas antes do trabalho. Depois do trabalho, a transferência das bactérias rotuladas geneticamente para o leite de peito foi analisada por comparação das bacté- 20 rias isoladas a partir das fezes neonatais no dia 0, 5 e 10 depois do trabalho. Todas as placas foram incubadas durante 24 horas a 37"C sob condições anaeróbias. Para cada amostra obtida, realizou-se a contagem das medições de bifidobactérias, lactobacilos e enterococos 25 totais. Entre as colônias que se desenvolveram nas placas MRS, selecionaram-se 50 aleatoriamente a partir de cada amostra e subcultivaram-se em placas Cm-MRS. Finalmente, as colônias resistentes a Cm- foram usadas como gabaritos para detectar as colônias de rótulo genético específico (Figura 2) . A transferência foi considerada positiva quando pelo menos 1% das colônias obtidas foram PCR-positivas.

Exemplo 3b: Inibição de Staphylococcus aureus sobreviventes

As cepas probióticas desta invenção foram avaliadas quanto à sua capacidade de produzir metabolitos bactericidas capazes de reduzirem a sobrevivência de 10 Staphylococcus aureus utilizando-se um ensaio de difusão de cavidade de ágar. Prepararam-se placas de ágar TSA contendo 106 cfu/ml de S. aureus. Cortaram-se no ágar cavidades com um diâmetro de 5 mm utilizando-se um saca-rolha estéril. Então, adicionaram-se 50 μ.l de uma 15 solução de sobrenadante concentrado 2 vezes de cada cepa probiótica às cavidades e deixou-se espalhar no ágar durante um período de pré-incubação de 2 horas a 4°C, seguido por incubação aeróbia das placas a 37°C durante 16-18 horas. Depois do período de incubação, observou- 20 se um halo inibidor e mediu-se (em milímetros) para a- valiar-se o efeito bactericida dos candidatos probióti- cos (Figura 3A).

Exemplo 3c: Inibição de aderência de Staphylococcus aureus às células epíteliais

Cultivaram-se linhas de células intestinais Ca co- 2 para confluência em bandejas de plástico de 35 mm que continham 2 ml de meio sem antibióticos. No dia 10-14 após-confluência, substituiu-se 1 ml do meio com 1 ml de uma suspensão de 10s de bactérias de probiótico em DMEM. As culturas foram incubadas 1 hora a 3 7°C. Depois disso, adicionou-se às culturas 1 ml de uma suspensão de 108 bactérias patogênicas (S. aureus) em DMEM 5 e incubou-se durante 1 hora mais a 3 7 °C. As células foram lavadas duas vezes com P0S e fixadas com metanol a 70% gelado durante 30 minutos. As placas submetidas a secagem ao ar e Gram coloridas. As bactérias fixadas foram visualizadas utilizando-se um microscópio óptico 10 Axiovert 200 (Zeiss) sob ampliação lOOOx em imersão de óleo. 0 número de bactérias Gram negativas em 10 campos randomizados foi contado e os resultados expressos como a média da percentagem das bactérias patogênicas vinculadas às células comparados com culturas de controle 15 sem cepas probióticas (Figura 3B).

Exemplo 3d: Proteção de mastite

Para avaliar a eficácia dos candidatos probió- ticos para proteção contra mastite, os inventores usaram um modelo de camundongos desta patologia. Em resu- 20 mo, 10 ratos prenhes Wistar por grupo foram suplementados diariamente por alimentação oral com 10a cfu/dia de cada cepa probiõtica veiculada em 200 μl de leite durante duas semanas depois do trabalho. Uma semana depois do trabalho, induziu-se infecção de mastite nos 25 animais por injeção de 106 cfu de S. aureus no quarto par de glândulas mamárias. O leite emitido foi coletado nos dias 0, 5 e 10 após infecção para se medir a carga bacteriana (Figura 4A); e 5 animais de cada grupo foram sacrificados nos dias 5 e 10 após infecção, a fim de serem obtidas biópsias de glândula mamária para se avaliar o processo inflamatório por exame histológico.

As glândulas inteiras foram fixadas em formali- 5 na a 5% e desidratadas com álcool, e finalmente encerradas em parafina. Seções de tecido foram coloridas com hematoxilina-eosina e examinadas de uma maneira cega (Figura 4B). Para se avaliarem qualitativamente e alterações da histologia de glândula mamária, determinou-se 10 um valor de índice inflamatório (IIV) como exposto em seguida: Contagem 0: Sem infiltração Contagem 1: Infiltração intersticial de células PMN suave em áreas isoladas de seções de 15 tecido, epitêlio tubular não danificado Contagem 2; Infiltração intersticial cobrindo a maior parte dos campos, áreas dispersas de tecido danificadas com perda de estrutura de tecido, e imagens insufici- 20 entes de formação de abscesso Contagem 3: Infiltração grave cobrindo a maior parte dos campos, áreas frequentes de tecido danificado com perda de arquitetura de tecido, e imagens frequentes de 25 formação de abscesso.

Exemplo 4: Potencial probiótico das cepas

As cepas selecionadas foram ainda analisadas quanto a diferentes características que podiam aumentar a sua capacidade de funcionar como cepas probióticas. Os resultados obtidos estão descritos nos exemplos indicados .

Exemplo 4a; Aderência ao Caco-2 e células HT-29

Para os ensaios de aderência utilizaram-se as linhas de células Caco-2 (ATCC HTB-37) e HT-29 (ATCC HTB-38) como um modelo de células de intestino. As duas linhas de células apresentaram aspectos característicos para células de intestino, tais como polarização, 10 expressão de enzimas do intestino, produção de polipep- tídios estruturais particulares e mucinas.

As células foram desenvolvidas em balões de plástico (75 cm2, Nunc) em DMEM como meio de cultura suplementado com FCS desativado a 10%, aminoácidos não 15 essenciais, 100 U/ml penicilina/estreptomicina, 1 μg/ml anfotericina. A cultura foi realizada a 37°C em uma atmosfera compreendendo 95% de ar e 5% de CO2. O meio foi trocado em uma base de duas vezes diárias e as células foram divididas uma vez por semana.

Linhas de células intestinais Caco-2 e HT-29 foram divididas em bandejas de plástico de 35 mm em meio de 2 ml sem antibióticos para confluência. 10-14 dias após confluência, 1 ml de meio foi substituído com 1 ml de uma suspensão de 108 bactérias em DMEM (PAA) .

As culturas foram incubadas 1 hora a 37°C. Depois disso, as células foras lavadas duas vezes com PBS e fixadas com metanol gelado a 70% durante 30 minutos. As placas foram submetidas a secagem a ar e Gram colori- das. As bactérias fixadas foram visualizadas utilizando-se um microscópio óptico Axiovert 200 (Zeiss) sob ampliação lOOOx em imersão de óleo. Contaram-se vinte campos randomizados o e os resultados expressos como a 5 média do número de bactérias vinculadas às células por campo ±SD (Figura 5)

Exemplo 4b: Resistência ao ácido e sais de bílis

Para, se analisar a resistência das cepas probióticas desta invenção ao alto teor de ácido e sais de 10 bílis, condições que estas bactérias encontrarão durante o trânsito digestivo, as bactérias foram cultivadas em meio de caldo MRS pH 3,.0 ou com sais de bílis a 2% (Sigma) durante 90 minutos. A sobrevivência foi calculada por chapeamento em ágar MRS de diluições em série 15 e comparada ao número de colônias obtidas nas condições de controle (caldo MRS, pH 5,8). As placas foram cultivadas durante 24 horas a 36 “C em condições anaeróbias extremas. Repetiu-se a experiência três vezes (Figura 6) .

Exemplo 4c: Resistência aos antibióticos

O uso de modernos antibióticos conduz a uma redução da microflora de intestino comensal que por vezes refere-se a diarréia e outros distúrbios do intestino. Além disso, esta redução na quantidade de bactérias do 25 intestino poderia ser uma consequência de bactérias patogênicas e vírus oportunistas infectarem o hospedeiro. O uso de antibióticos para bloquear a infecção não resolve este distúrbio, sendo que em vez disso passa a complicá-lo. Em outras situações, tais como inflamação intestinal onde os probióticos poderiam exercer uma função benéfica, este efeito potencial é por vezes limitado a terapia simultânea com antibióticos. Por todas 5 estas razões, a seleção de cepas probióticas potenciais que foram capazes de resistir a antibióticos comuns seria claramente interessante.

Para se analisar a resistência das cepas probióticas desta invenção os inventores usaram um ensaio de 10 difusão de cavidade de ágar. Prepararam-se placas de ágar Müeller-Hinton contendo 106 cfu/ml de cada cepa probiõtica. Então, adicionaram-se discos comerciais antibióticos às cavidades e deixaram espalhar-se no ágar durante um período de pré-incubação de 10 minutos sob 15 temperatura ambiente, seguida por incubação anaeróbia extrema das placas a 36°C durante 16-18 horas.

A resistência antibiótica das cepas probióticas desta invenção está sumariada na Tabela II. Tabela IX: Resistência antibiótica das diferen- tes cepas probióticas da invenção

Exemplo 4d: Produção de metabolites antimicrobianos

Sugeriu-se que o mecanismo principal usado pelos probióticos é controlar o equilíbrio entre as bactérias intestinais benéficas e prejudiciais no intestino. Quando o número de bactérias benéficas é reduzido, 5 as bactérias oportunistas poderão crescer excessivamente e perturbar o bem estar do hospedeiro ou mesmo induzir uma infecção. A maior parte dos organismos bacteri- anos adquiriram características ou mecanismos que reduzem as capacidades de crescimento de outros microorga- 10 nismos que coabitam com eles e desta forma, possibilitam o seu crescimento seletivo. A redução do pH através da produção de ácido por bactérias de ácido láctico é um desses mecanismos. Além disso, algumas bactérias de ácido láctico também produzem componentes de peptídios 15 bioativos e outros metabolites que inibem o crescimento seletivo de outras bactérias, lêvedo ou fungos. Este é o caso do reuterin (um aldeído) ou bacteriocinas (pep- tídeos, tais como nisina ou pediocina PA-1).

As cepas probióticas desta invenção foram ava- 20 liadas quanto à sua capacidade de produzirem metabolites bactericidas utilizando-se um ensaio de difusão de cavidade de ágar. Prepararam-se placas de ágar TSA que continham 106 cfu/ml de diferentes cepas de bactérias patogênicas e ensaiaram-se tal como indicado anterior- 25 mente no Exemplo 3b para S. aureus. Os resultados obtidos encontram-se expostos na Tabela III. Tabela III: Potencial inibidor de agentes patogênicos das diferentes cepas probióticas da invenção

Exemplo 5: Efeito das cepas probióticas desta invenção na translocação de Salmonella typhimurium em camundongos em seguida à imunização com vacina de Salmonella desativada

A translocação de bactérias gram-negativas a- través do epitélio do intestino pode ocorrer especial- mente em pacientes em seguida a infecção gastrintestinal, enfermidade ou cirurgia. Deixar sem tratar pode conduzir a endotoxemia. Neste exemplo, examinou-se o 10 efeito da alimentação das cepas probióticas desta invenção na translocação do agente patogênico Salmonella typhimurium no intestino. Camundongos machos Balb/c (6-8 semanas de idade) foram fasted diariamente com 1x10® cfu em 0,2 ml de 15 leite ou somente leite durante duas semanas. Depois disso, os camundongos foram ou imunizados via oral ou não com uma vacina de Salmonella desativada (10® cfu desativada com paraformaldeido em 0,2 ml de leite). Depois de imunização, os camundongos foram fasted duas 20 semanas mais com os preparados probióticos em dias alternados durante duas semanas mais. Duas semanas depois da imunização oral, todos os camundongos foram provocados via oral com S. typhimurium vivo (1010 cfu em 0,2 ml de leite). Então, depois de 24-48 horas, o nível de 25 colonização de S. typhimurium na passarinha foi determinado em metade dos animais. O restante dos animais foram seguidos durante duas semanas adicionais a fim de avaliar a sobrevivência dos animais depois da infecção por Salmonella.

Os resultados obtidos demonstram que a maior parte dos probióticos testados potência o efeito benéfico da vacinação de camundongos com a vacina Salmonel- 5 la desativada conforme ilustrado na Figura 7.

Exemplo 6: Efeito de L. plantarum CECT7262 ou L. reuteri CECT7260 na prevenção de diarréia neonatal em leitões neonatais.

O desmame de leitões com 3-4 semanas de idade 10 correlaciona-se com a alta taxa de mortalidade nesses animais principalmente devido a um aumento na incidência de infecções diarrêicas. Provavelmente, esta alta mortalidade refere-se a uma desregulagem das suas defesas devido à modificação estressante de seu estado nu- 15 tricional e tratamento e ã mudanças importantes em uma composição da sua microbiota intestinal.

Por esta razão, os fazendeiros têm procurado solucionar este problema com o uso de várias abordagens tais como o uso de antibióticos, componentes imune- 20 estimulantes ou protetores das mucosas, tais como co- listina ou ZnO. Entretanto, a proibição nos EU do uso de antibióticos para produção animal em 2006 agravou a situação. Por esta razão, o uso de probióticos capazes de modularem a microbiota do intestino e a resposta i- 25 mune parece ser uma alternativa potencial.

Os inventores compararam o efeito protetor da administração de 3xl09 cfu/dia de L. reuteri CECT7260 e L. plantarum CECT7262 contra a administração de uma formulação de alimentação de animal que contém 3000 ppm de ZnO e 40 ppm de colistina em dois grupos de 48 e 45, respectivamente, porcos desmamados durante um período de 34 dias.

Nos dois grupos, nenhum dos animais sofreu de diarréia nem morreu durante o estudo, e a evolução do peso corpóreo também foi similar entre os dois tratamentos, sugerindo que a formulação de alimentação do animal suplementada com estes probióticos é, pelo me- 10 nos, tão boa quanto aqueles que contêm antibióticos convencionais e imune moduladores.

Exemplo 7; Efeito das bactérias probióticas na produção de citoquinas inflamatórias e IgQ

Além da redução do risco de infecção, muitos 15 efeitos clínicos associados com os tratamentos de probióticos são devidos às capacidades imunomoduladoras das cepas probióticas selecionadas. A regulagem da resposta imune é usualmente mediada através de uma mudança no equilíbrio entre citoquinas pró-inflamatórias (Thl) tais como TNF-a, citoquinas humorais (Th2) tais como IL-4 ou IL-13, e citoquinas reguladoras (Th3) tais como IL-10 e TGF-β. Além disso, a tendência na resposta imune modulará também a secreção de imunoglobulinas durante a resposta humoral subsequente. Por esta razão, os 25 inventores também testaram o efeito de algumas das cepas probióticas desta invenção na regulagem da expressão de alguns destas citoquinas chave e IgG.

Os inventores usaram macrófagos derivados de medula espinal estimulados com 100 ng/ml de LPS (Sigma) como um modelo celular. Cultivaram-se 10s macrófa- gos/cavidade em placas plásticas de 24-cavidades (Nunc) com 1 ml de DMEM. Uma vez vinculados, os macrófagos fo- 5 ram estimulados ou não com 100 ng/ml LPS e com 107 cfu/ml das cepas probióticas indicadas durante 12 horas a 37°C em uma atmosfera a 5% de CO2. Os sobrenadantes foram coletados e a produção de citoquinas foi analisada utilizando-se um TNF-a de camundongo ou IL-10 ELISA 10 (Biosource) de camundongo. Os resultados obtidos estão sumariados nas Figuras 8A e B.

A análise do efeito das cepas probióticas desta invenção na produção de imunoglobulina foi realizada utilizando-se culturas de linfôcitos obtidas a partir 15 da passarinha de camundongos machos Balb/c (6-8 semanas de idade). Cultivaram-se 2xl06 linfôcitos em 1 ml DMEM em placas plásticas de 24 cavidades e estimulados com culturas probióticas desativadas (108 cfu/ml) na presença ou ausência de 25 μg/ml de LPS durante 6 dias. A 20 produção de IgG por linfôcitos foi avaliada utilizando- se um IgG ELISA de camundongo proveniente da Bethyl (Figura 8C).

Claims (7)

1. Processo para a seleção de uma cepa selecionada do grupo de Bifidobacterium breve depositado no CECT sob N° de Acesso 7263, Bifidobacterium breve depositado no CECT sob N° de Acesso 7264, Lactobacillus reuteri depositado no CECT sob N° de Acesso 7260, Lactobacillus plantarum depositado no CECT sob N° de Acesso 7262, Lactobacillus fermentum depositado no CECT sob N° de Acesso 7265 e Lactobacillus reuteri depositado no CECT sob N° de Acesso 7266, Enterococcus hirae depositado no CECT sob N° de Acesso 7410, Lactobacillus plantarum depositado no CECT sob N° de Acesso 7412, Enterococcus faecalis depositado no CECT sob N° de Acesso 7411, Lactobacillus salivarius depositado no CECT sob N° de Acesso 7409, Lactobacillus reuteri depositado no CECT sob N° de Acesso 7413, o processo caracterizado por compreender as etapas de: (i) isolar as bactérias de ácido lático ou de cepas de bifidobactérias presentes no leite fresco de uma espécie mamífera por seleção em meio de cultura de ácido láctico; (ii) selecionar as cepas da etapa (i) que são capazes de serem transferidas para a glândula mamária após a ingestão oral e/ou de colonizar a glândula mamária após a sua aplicação tópica; (iii) selecionar as cepas da etapa (ii) que são capazes de reduzir as taxas de sobrevivência e/ou as taxas de adesão às células epiteliais de Staphylococcus aureus; e (iv) selecionar as cepas da etapa (iii) que são capazes de proteger os animais da mastite; em que o leite usado na etapa (i) é selecionado dentre leite humano, suíno, canino e de gato.

2. Uso de uma cepa selecionada do grupo de Bifidobacterium breve depositado no CECT sob N° de Acesso 7263, Bifidobacterium breve depositado no CECT sob N° de Acesso 7264, Lactobacillus reuteri depositado no CECT sob N° de Acesso 7260, Lactobacillus plantarum depositado no CECT sob N° de Acesso 7262, Lactobacillus fermentum depositado no CECT sob N° de Acesso 7265 e Lactobacillus reuteri depositado no CECT sob N° de Acesso 7266, Enterococcus hirae depositado no CECT sob N° de Acesso 7410, Lactobacillus plantarum depositado no CECT sob N° de Acesso 7412, Enterococcus faecalis depositado no CECT sob N° de Acesso 7411, Lactobacillus salivarius depositado no CECT sob N° de Acesso 7409, Lactobacillus reuteri depositado no CECT sob N° de Acesso 7413, ou de uma mistura destas, o uso caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou para a profilaxia de uma infecção ou infestação aguda ou crônica, ou uma colonização microbiana indesejável, em que a infecção, a infestação ou a colonização é causada por bactérias em um indivíduo humano, suíno, canino ou gato.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a infecção é mastite e a cepa probiótica foi selecionada na etapa (i) conforme definida na reivindicação 1, usando o leite da mesma espécie que se pretende tratar.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a infecção é a diarréia neonatal.

5. Uso de uma cepa probiótica selecionada do grupo de Bifidobacterium breve depositado no CECT sob N° de Acesso 7263, Bifidobacterium breve depositado no CECT sob N° de Acesso 7264, Lactobacillus reuteri depositado no CECT sob N° de Acesso 7260, Lactobacillus plantarum depositado no CECT sob N° de Acesso 7262, Lactobacillus fermentum depositado no CECT sob N° de Acesso 7265 e Lactobacillus reuteri depositado no CECT sob N° de Acesso 7266, Enterococcus hirae depositado no CECT sob N° de Acesso 7410, Lactobacillus plantarum depositado no CECT sob N° de Acesso 7412, Enterococcus faecalis depositado no CECT sob N° de Acesso 7411, Lactobacillus salivarius depositado no CECT sob N° de Acesso 7409, Lactobacillus reuteri depositado no CECT sob N° de Acesso 7413, ou de uma mistura destas, o uso caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou a profilaxia de doenças alérgicas em um indivíduo humano, suíno, canino ou gato.

6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, caracterizado pelo fato de que a cepa é administrada por via oral.

7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 5, caracterizado pelo fato de que a cepa é planejada para ser administrada a mulher ou animal lactantes para o tratamento terapêutico ou profilático de seus bebês ou filhotes em amamentação.