CN111698913A - 抑制脂肪蓄积用组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种含有属于副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)的乳酸菌的菌体、其培养物或发酵物、或者其产生的多糖类来作为有效成分的组合物，其对抑制脂肪蓄积有效，能够用作用于预防或改善肥胖、脂肪肝和肝功能障碍的饮食品、药品、饲料。

Description

抑制脂肪蓄积用组合物
技术领域
本发明涉及一种抑制脂肪蓄积用组合物。进一步详细而言，本发明涉及一种组合物，用于抑制脂肪蓄积，该组合物以属于副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)的乳酸菌的菌体、其培养物或发酵物、或者其产生的多糖类为有效成分。
背景技术
近年来，在日本和欧美各国，患有称作代谢综合征的病症的患者正在增加，这种代谢综合征表现为脂肪肝、糖尿病、高血压、动脉硬化等症状。通常认为，代谢综合征与肥胖有密切联系。肥胖是指因暴饮暴食导致的能量过度摄取和/或因运动不足导致的消耗热量下降等而脂肪细胞数增加的状态和/或在脂肪细胞内脂肪过量蓄积的状态。因此，通常认为，通过抑制这样的脂肪蓄积等可以预防改善肥胖。
此外，脂肪肝是指中性脂肪在肝脏或肝细胞中过度蓄积的状态，通常认为它与肥胖、高血脂、糖尿病等生活方式病密切相关。例如，游离脂肪酸被吸收(uptake)并蓄积为中性脂肪，通常被认为是中性脂肪在肝脏或肝细胞中蓄积的原因之一。
为了预防改善肥胖，提出了摄取能够促进人体脂肪的燃烧、抑制脂肪蓄积的食材和/或保健品(supplement)、服用医药领域的抗肥胖剂等各种方案。此外，对于预防治疗脂肪肝的方法，提出了抑制在肝脏的蓄积脂肪的方法等。但现状是，从安全性、实用性的方面等考虑，有效地预防改善肥胖、脂肪肝的手段很少。
另一方面，自很久以前，乳酸菌就被用于制造发酵乳、乳酸菌饮料、发酵黄油等乳制品等食品，并且，乳酸菌本身也具有整肠效果等各种药理作用，因此，乳酸菌也被用作健康食品、药品等的材料。作为乳酸菌对脂肪蓄积的作用，有如下报道：乳杆菌属、乳球菌属乳酸菌中发现了具有减少内脏脂肪作用的菌株(专利文献1)、属于格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)的乳酸菌有抑制脂肪肝的作用(专利文献2)等。此外，作为来自于植物的乳酸菌，也已知具有改善脂肪肝和抑制体内脂肪的蓄积效果的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)LP28菌株(非专利文献3)等。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2008-214253号公报；
专利文献2：日本特开2008-24680号公报。
非专利文献
非专利文献1：Appl.Microbiol.Biotechnol.,84,341-347(2009)。
发明内容
发明要解决的问题
在这样的背景技术下，期望开发以乳酸菌为有效成分的、用于抑制脂肪蓄积的新组合物。因此，本发明的课题在于提供一种新组合物，用于抑制脂肪蓄积，该组合物以乳酸菌为有效成分，对肥胖、脂肪肝、肝功能障碍的预防或改善有效。
用于解决问题的方案
本发明人等以开发用于抑制脂肪蓄积的新组合物为目的而进行了深入研究，结果发现，属于副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)的乳酸菌产生的多糖类有抑制肝细胞摄取游离脂肪酸而蓄积为中性脂肪的作用，并且，属于副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)的乳酸菌显示出抑制体重增加和内脏脂肪蓄积、抗肥胖作用，基于该见解，发明人等进一步重复研究，完成了本发明。
在本发明的一个方式中，本发明涉及一种组合物，用于抑制脂肪蓄积，该组合物以属于副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)的乳酸菌的菌体、其培养物或发酵物、或者其产生的多糖类为有效成分。
本发明的组合物能够优选用于预防或改善肥胖，并且能够优选用于预防或改善脂肪肝或肝功能障碍。
在本发明的组合物中，优选乳酸菌为来自于无花果的乳酸菌，特别是，优选为Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株(保藏号NITE BP-02242)或与之等效的乳酸菌。
在本发明的组合物中，乳酸菌的培养物或发酵物优选在凤梨(pineapple)属植物果汁的存在下将乳酸菌培养或发酵而得到。
在本发明的组合物中，作为乳酸菌产生的多糖类，可举出具有N-乙酰葡萄糖胺通过α-1,6键连接的结构的中性多糖、或主要由葡萄糖和甘露糖构成的酸性多糖。
本发明的组合物优选为饮食品组合物，作为饮食品，优选可举出饮料、功能性食品、发酵食品或保健品。
此外，本发明的组合物优选为药物组合物。
进而，本发明的组合物优选为饲料组合物。
发明效果
本发明的组合物对抑制脂肪蓄积有效，能够用于预防或改善肥胖，并且，能够用于预防或改善脂肪肝或肝功能障碍。本发明的组合物能够用作用于预防或改善肥胖、脂肪肝或肝功能障碍的饮食品、药品、饲料。而且，本发明的组合物由于以属于副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)的乳酸菌的菌体、其培养物或发酵物、或者其产生的多糖类为有效成分，因此安全性高、能够长期使用、且能够廉价地大量供给，其有用性和实用性极高。
附图说明
图1为Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株的显微镜照片。图1中的(A)为革兰氏染色显微镜照片、(B)为扫描型电子显微镜(SEM)照片。
图2为Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株的多糖类的阴离子交换色谱(TOYOPEARL DEAE-650M树脂(Tosoh Corporation))的分离曲线。通过0mM～500mM的梯度浓度的NaCl(虚线)使多糖类洗脱，通过苯酚硫酸法，在490nm监测各个组分中的多糖类的存在(实线)。
图3表示通过阴离子交换柱色谱来纯化Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株的多糖类而得到中性多糖，将得到的中性多糖进行H-NMR和C-NMR后分别示出得到的NMR曲线。图3中的(A)为H-NMR的NMR曲线，(B)为C-NMR的NMR曲线。
图4表示由NMR曲线得到的中性多糖的结构解析结果。根据该结构解析结果可知，Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株的中性多糖具有N-乙酰葡萄糖胺通过α-1,6键连接的结构。
图5为示出Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株产生的多糖类具有浓度依赖性抑制脂肪蓄积作用的图表。
图6为示出摄取由Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株发酵的凤梨果汁发酵液的高脂饮食诱导肥胖模型小鼠的体重增加的推移的图表。
图7为示出通过摄取由Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株发酵的凤梨果汁发酵液从而高脂饮食诱导肥胖模型小鼠的体重增加受到抑制的图表。
图8为示出通过摄取由Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株发酵的凤梨果汁发酵液从而高脂饮食诱导肥胖模型小鼠的内脏脂肪量受到抑制的图表。
具体实施方式
以下，对本发明提供的、以属于副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)的乳酸菌的菌体、其培养物或发酵物、或者其产生的多糖类为有效成分的、用于抑制脂肪蓄积的组合物进行详细说明。
1、在本发明中作为对象的乳酸菌
在本发明中作为对象的乳酸菌为属于副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)的乳酸菌，优选为来自于无花果的乳酸菌。具体而言，根据本发明，可举出从无花果的叶子中分离并鉴定的Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株。该菌株于2016年4月19日在国家技术评估学会专利微生物保藏中心(千叶县木更津市Kazusa镰足2-5-8 122号室〒292-0818)国内保藏，保藏号为NITE P-02242，其后基于布达佩斯条约移交到国际保藏，于2017年5月26日被赋予国际保藏的保藏号NITE BP-02242。
Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株如图1的照片所示，其为过氧化氢酶阴性的革兰氏阳性杆菌，且具有白色菌落形成性，具有带有条件性异乳酸发酵的特性的菌学性质。进一步地，还具有产生多糖的能力。
在本发明中，与Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株等效的乳酸菌也作为对象。在此，等效的乳酸菌是指，为属于Lactobacillus paracasei的乳酸菌，与Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株同样地具有抑制脂肪蓄积作用，并且，产生与Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株产生的多糖类同样地具有抑制脂肪蓄积作用的多糖类。这些等效的乳酸菌能够通过例如对Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株进行突变、基因重组等常规的变异处理技术而得到，并且，也可以是通过选择Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株的自然突变体后进行育种得到的菌株。
2、本发明的有效成分
本发明的组合物包含上述的乳酸菌的菌体、其培养物或发酵物、或者其产生的多糖类作为有效成分。
乳酸菌能够使用通常使用的MRS培养基、其改良培养基等，通过液体静置培养等常规使用的培养方法进行培养。通过在凤梨属植物果汁或其提取物的存在下培养乳酸菌，能够促进乳酸菌的增殖(国际公开第WO2011/046194)，并且，在酒糟、酒糟提取物或酒糟的酶分解物的存在下培养乳酸菌，也能够促进其增殖(日本特开平3-172171号公报、日本特开平5-15366号公报和日本特许第2835548号公报)。培养乳酸菌后，可以将得到的培养物直接用作有效成分，也可以将得到的培养液稀释或浓缩使用，还可以使用从培养物回收的菌体。此外，只要不损害本发明的效果，也能够在培养后进行加热和冻干等各种追加操作。此外，乳酸菌的菌体可以是在其细胞表层附着有多糖类的活菌，也可以是在其细胞表层附着有多糖类的死菌，也可以包括在其细胞表层附着有多糖类的活菌和在其细胞表层附着有多糖类的死菌这两者。死菌可以是匀浆，但优选在其表层附着有多糖类。此外，乳酸菌的发酵物通常能够将葡萄糖等作为营养源，根据需要进一步添加酵母提取物、凤梨属植物的果汁、酒糟、烧酒酒糟等植物乳酸菌的增殖促进物质，使其发酵，从而得到。
乳酸菌产生的多糖类能够通过常规的方法从属于副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)的乳酸菌的培养物中分离纯化得到。具体而言，例如，能够使用乙醇、丙酮等使多糖类从通过离心分离从属于副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)的乳酸菌的培养物中除去菌体而得到的培养物中沉淀而得到。此外，也能够通过离子交换色谱进一步分离纯化而得到。
在本发明中，作为乳酸菌产生的多糖类，具体而言，可举出具有N-乙酰葡萄糖胺通过α-1,6键连接的结构的中性多糖、或主要由葡萄糖和甘露糖构成的酸性多糖。该中性多糖如后述实施例2记载的那样，能够利用阴离子交换色谱将从Lactobacillus paracaseiIJH-SONE68菌株的培养物中得到的多糖类分离纯化，从而得到。从图3所示的H-NMR和C-NMR的NMR曲线中明确可知，该中性多糖具有N-乙酰葡萄糖胺通过α-1,6键连接的结构。此外，Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株将主要由葡萄糖和甘露糖构成的酸性多糖分泌到菌体外。更具体而言，该酸性多糖由葡萄糖、甘露糖、半乳糖和鼠李糖构成，它们的组合比大致为10∶170∶2∶1。
3、本发明的组合物
本发明的组合物能够以饮食品组合物、药物组合物、饲料组合物等各种形态使用。
作为饮食品组合物中的饮食品，无特别限制，可例示：软饮料、碳酸饮料、营养饮料、果汁饮料、乳酸菌饮料等饮料，这些饮料的浓缩原液、制备用粉体等；奶油冰激凌、果汁冰激凌、刨冰等冷冻甜品；饴糖、软糖、麦片、泡泡糖、砂糖、口香糖、巧克力、片状糖、点心、饼干、果冻、果酱、奶油和烘焙食品等糕点类；加工乳、乳饮料、发酵乳、酸奶饮料、黄油等乳制品；面包；肠内营养剂、流食、婴儿牛奶、运动饮料；果泥等食品；甜酒；其他功能性食品等。此外，饮食品可以是保健品，可以是例如颗粒状、粉末状、片状的保健品。
上述那样的饮食品能够通过向饮食品原料中添加乳酸菌的菌体、其培养物或发酵物、或者其产生的多糖类来制造，或者，与通常的饮食品同样地制造。可以在饮食品的制造工序的任一阶段添加乳酸菌的菌体、其培养物或发酵物、或者其产生的多糖类。也可以经过添加的乳酸菌的发酵工序后制造饮食品。作为这样的饮食品，可举出乳酸菌饮料、发酵乳等发酵食品等。
在饮食品组合物中，乳酸菌的菌体、或者其培养物或发酵物的含量根据饮食品的形态来适当设定，但是通常，在饮食品组合物中，优选所包含的菌体含量在1×106～1×1012cfu/g或1×106～1×1012cfu/ml的范围内，更优选含量在1×107～1×1011cfu/g或1×107～1×1011cfu/ml的范围内。在乳酸菌为死菌的情况下，cfu/g或cfu/ml能够替换为个细胞/g或个细胞/ml。在饮食品组合物中使用乳酸菌产生的多糖类的情况下，以多糖类的重量换算计，通常包含0.001重量％以上的多糖类，优选包含0.01重量％以上的多糖类。
药物组合物通常将乳酸菌的菌体、其培养物或发酵物、或者其产生的多糖类添加在通常使用的、生理上可接受的、液体或固体的制剂载体上，进行制剂化，从而使用。药物组合物的剂型没有特别限制，能够例示：片剂、丸剂、散剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、胶囊剂、糖浆剂、栓剂、注射剂、软膏剂、贴剂、滴眼剂以及滴鼻剂等。
在本发明的药物组合物的制剂中，乳酸菌的菌体、或其培养物或发酵物的含量根据剂型、用法、对象年龄、性别、疾病种类、疾病程度和其他条件等进行适当设定，通常优选药物组合物所包含的菌体含量在1×106～1×1012cfu/g或1×106～1×1012cfu/ml的范围内，更优选含量在1×107～1×1011cfu/g或1×107～1×1011cfu/ml的范围内。在乳酸菌为死菌的情况下，cfu/g或cfu/ml能够替换为个细胞/g或个细胞/ml。在药物组合物的制剂中使用乳酸菌产生的多糖类的情况下，以多糖类的重量换算计，通常包含0.001重量％以上的多糖类，优选包含0.01重量％以上的多糖类。
本发明的药物组合物的给药时机无特别限定，能够根据应用对象选择适当的给药时机。此外，可以预防给药，也可以用于维持治疗。给药方式优选根据制剂形态、给药对象的年龄、性别、其他条件、给药对象的症状的程度等适当确定。本发明的药物组合物在任意情况下都能够1日1次、或分为多次进行给药，此外，也可以数日或数个星期给药1次。
作为饲料组合物的饲料，可举出宠物食品、家畜饲料，鱼饲料等。这样的饲料能够通过将乳酸菌的菌体、其培养物或发酵物、或者其产生的多糖类与通常的饲料例如谷物、糟类、糠类、鱼粉、骨粉、油脂类、脱脂粉乳、乳清(whey)、卤水、矿物质饲料、酵母类等进行混合，从而制造。此外，也可以像例如青贮饲料那样，经过添加乳酸菌的发酵工序后，再制造饲料。制造的饲料能够口服喂食给通常的哺乳动物、家畜类、饲养鱼类、宠物等。此外，在饲养鱼类的情况下，也能够采用向养鱼场播撒发酵物的方法，其中，该发酵物添加有乳酸菌的菌体、其培养物或发酵物、或者其产生的多糖类。
在饲料组合物中，乳酸菌的菌体、其培养物或发酵物的含量根据饲料的形态、应用对象进行适当设定，优选饲料组合物所包含的菌体的含量在1×106～1×1012cfu/g或1×106～1×1012cfu/ml的范围内，更优选含量在1×107～1×1011cfu/g或1×107～1×1011cfu/ml的范围内。在乳酸菌为死菌的情况下，cfu/g或cfu/ml能够替换为个细胞/g或个细胞/ml。在饲料组合物中使用乳酸菌产生的多糖类的情况下，以多糖类的重量换算计，通常包含0.001重量％以上的多糖类，优选包含0.01重量％以上的多糖类。
4、本发明的组合物的用途
属于副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)的乳酸菌的菌体、其培养物或发酵物、或者其产生的多糖类具有抑制肝细胞吸收游离脂肪酸而蓄积为中性脂肪的作用，并且具有抑制体重增加和内脏脂肪的蓄积的抗肥胖作用。因此，含有属于副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)的乳酸菌的菌体、其培养物或发酵物、或者其产生的多糖类来作为有效成分的组合物能够用于抑制脂肪蓄积并且能够用于抑制肥胖。具体而言，本发明的组合物能够用于预防或改善肥胖，并且能够用于预防或改善脂肪肝或肝功能障碍。此外，本发明的组合物由于对肥胖的预防或改善有效，因此其尤其能够用作维持健康、增进健康用的饮食品的原料。此外，由于脂肪肝或肝功能障碍的预防或改善与体力的维持、增进、恢复等有关联，所以本发明的组合物特别是也能够用作维持、增进、恢复体力用的饮食品的材料。
实施例
以下，根据实施例对本发明进一步详细说明，但是本发明并不限定于这些实施例。
实施例1
乳酸菌的分离和鉴定
1、乳酸菌样品的分离
选择无花果(品种“とよみつ姫”)的叶、茎和果实，使用杀菌后的镊子和剪刀将其制成2～3mm的小碎片后，在放有灭菌过的MRS液体培养基的每个试管中加入5～6个碎片，在28℃和37℃静置培养直到作为乳酸菌的标准培养基的MRS培养基浑浊(增殖)。此外，需要2～4天能够目视观察到乳酸菌候选菌株的增殖。
通过一次性环，将上述乳酸菌候选菌株的各个培养液的一部分划线接种在MRS琼脂培养基上后进行静置培养。在琼脂培养基上形成的菌落中，挑选出全部“颜色、光泽度、形状不同的菌落”，在新的MRS琼脂培养基上进行划线接种，纯化菌落。
为了对纯化的各种菌落验证是否产生过氧化氢酶，进行H2O2测试。这是观察在将菌体暴露于10％的H2O2溶液时所致的若过氧化氢酶存在所生成的氧的有无的试验法。此外，乳酸菌不产生过氧化氢酶。
作为从无花果尝试探索分离的结果，从将无花果的叶子作为分离源的菌株中，能够得到1株显示过氧化氢酶阴性的乳酸菌候选菌株。
2、分离菌株的鉴定
在MRS液体培养基重新培养上述乳酸菌候选菌株，通过离心取得菌体。通过细胞壁溶解酶进行处理后，使用DNAzol试剂，提取基因组DNA。
根据Lane,D.J.(1991).16S/23S rRNA sequencing.In Nucleic AcidTechniques in Bacterial Systematics、pp.115-175.Edited by E.Stackebrandt&M.Goodfellow.Chichester：Wiley记载的方法，将基因组DNA做成模板，通过使用27f引物和1525r引物的PCR反应使16S rDNA部分扩增，通过NucleoSpin胶/PCR产物纯化试剂盒(MACHEREY-NAGEL GmbH&Co.KG制)，从琼脂糖凝胶中回收目标片段。基于用于碱基测序的终止法测序(Dye terminator)的测序反应通过大染料终止子循环测序人卵泡抑素快速反应试剂盒ver.3.1(Big Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kitver.3.1，ThermoFisher Scientific公司制)进行，通过ABI PRISM 3130xl基因分析仪(ABIPRISM 3130xl Genetic Analyzer，ThermoFisher Scientific公司制)进行解析。对解析的16S rDNA的碱基序列进行基于BLAST程序(BLAST program)的同源性检测，通过与DNA数据库(DDBJ/EMBL/GenBank)的数据库比较，进行分离菌株的分类学的鉴定。
将从无花果的叶子中分离的乳酸菌候选菌株命名为IJH-SONE68菌株，它与已经在DNA数据库(DDBJ/EMBL/GenBank)中记录的“Lactobacillus paracasei R094”的菌株中碱基序列的登录编号为“NR_025880”的碱基序列100％一致，因此，将其鉴定为Lactobacillusparacasei。
该菌株于2016年4月19日在国家技术评估学会专利微生物保藏中心(千叶县木更津市Kazusa镰足2-5-8 122号室〒292-0818)国内保藏，保藏号为NITE P-02242，其后基于布达佩斯条约移交到国际保藏，于2017年5月26日被赋予国际保藏的保藏号NITE BP-02242。
3、分离鉴定的乳酸菌的菌学性质
分离鉴定的上述乳酸菌IJH-SONE68菌株如图1的照片所示，为过氧化氢酶阴性的革兰氏阳性杆菌，且具有白色菌落形成性，具有带有条件性异乳酸发酵的特性，并且具有产生多糖的能力。
4、分离鉴定的乳酸菌对糖类的同化能力
(1)同化能力的试验方法
通过以下的试验方法研究IJH-SONE68菌株对49种糖类的同化能力。
通过MRS液体培养基静置培养IJH-SONE68菌株直至增殖的静止期。通过适量的悬浮介质(bioMérieux SA制)清洗离心分离得到的菌体后，最终悬浮在2mL的悬浮介质中。将其一部分添加到5mL的悬浮介质中，求出麦克法兰浊度变为2的量(n)。接下来，向API 50CHL培养基(bioMérieux SA制)中添加2n的菌液，将其分注到API 50CHL试剂盒(bioMérieux SA制，在各个孔的底部分别涂了49种糖)的各个孔中。最后加一层矿物油，放置在加入灭菌水的托盘。在37℃培养48小时后，通过观察各个孔的色调的变化，从而判断同化能力的有无。
5、同化能力的试验结果
研究IJH-SONE68菌株对49种糖类的同化能力，如表1所示。
[表1]
IJH-SONE68株对糖类的同化能力
Figure BDA0002526190590000111
表中，+表示能够同化，-表示不能够同化。
实施例2
1、IJH-SONE68菌株产生的多糖的分离纯化
通过以下方法分离纯化IJH-SONE68菌株产生的多糖类。
通过MRS液体培养基静置培养IJH-SONE68菌株直至增殖的静止期。将5mL的该培养液作为种子培养液，接种到5L的多糖类产生用半合成培养基(其组成后述)，在37℃静置培养120小时。在将培养液冷却至4℃后，加入202.5mL的100％的三氯乙酸水溶液，混合后静置30分钟，以便使包含于培养液上清液中的蛋白质改性而在之后的步骤中作为沉淀除去。通过离心分离去除沉淀，将等量的丙酮加入到回收的上清液中进行混合后，通过使其在4℃静置过夜，使IJH-SONE68菌株产生的多糖沉淀。通过离心分离将沉淀物回收后，利用250mL的70％乙醇进行沉淀物的清洗。使沉淀物风干后，加入75mL的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)混合1小时，从而使沉淀物溶解。通过离心分离去除不溶性异物后，对回收的上清液分别加入750μL的1mg/mL DNase溶液(Worthington公司)和1mg/mL RNase溶液(nacalai tesque,inc)，在37℃使其反应8小时。接下来，加入750μL的2mg/mL proteinase K溶液(和光纯药工业公司制)，在37℃使其反应16小时。将反应后的溶液冷却至4℃后，加入8.75mL的100％的三氯乙酸水溶液混合，在4℃使其静置1小时，以便使添加的各种酶改性，通过接下来的离心分离作为沉淀除去。通过离心分离去除沉淀物，对得到的上清液加入262.5mL的100％乙醇，充分混合后，通过离心分离作为沉淀物来回收IJH-SONE68菌株产生的多糖类。通过50mL的70％的乙醇清洗沉淀物后，使其风干，加入适量(约25mL)的纯净水，在4℃静置过夜，由此使多糖溶解。对于溶解后的多糖样品，使用10000MWCO的超滤单元(Merck公司)，将溶剂置换为纯净水，并且去除回收的样品中的单糖类等小分子，得到纯化的多糖类样品。
将纯化的多糖类样品上样到填充了预先用50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)平衡过的TOYOPEARL DEAE-650M树脂(Tosoh Corporation)的开放柱(2.5×22cm)，进行用于分离纯化中性多糖组分和酸性多糖组分的柱分离。溶液使用同样的缓冲液，以流速1mL/分钟进行固定。此外，洗脱液回收到以每个相差6mL的不同的试管。首先，从开始到240分钟之间通过相同的缓冲液使其洗脱(试管编号1-40)。接下来，从240分钟的时间点到600分钟的时间点之间，制作使用相同缓冲液的0-500mM NaCl的浓度梯度，继续洗脱(试管编号41-100)。柱分离谱在图2示出。通过苯酚硫酸法(后述)对在试管洗脱的全部样品确认多糖的存在后，分别收集该试管内溶液的中性多糖组分、酸性多糖组分。各个组分使用10000MWCO的超滤单元，将溶剂置换为纯净水，并且去除回收的样品中的单糖类等小分子。
通过以上，作为IJH-SONE68菌株产生的多糖类，将中性多糖组分和酸性多糖组分分离纯化。
多糖类产生用半合成培养基为对Kimmel SA、Roberts RF.Development of agrowth medium suitable for exopolysaccharide production by Lactobacillusdelbrueckii ssp.bulgaricus RR.Int.J.Food Microbiol.、40、87-92(1998)记载的培养基进行如下改变而得到。
Figure BDA0002526190590000131
Figure BDA0002526190590000141
微量元素溶液记载在Kets EPW,Galinski EA,de Bont JAM.Carnitine:a novelcompatible solute in Lactobacillus plantarum.Arch.Microbiol.,192,243-248(1994)中，其组合如下所述。
Figure BDA0002526190590000142
苯酚硫酸法(DuBois M,Gilles KA,Hamilton JK,Rebers PA,Smith F.,Colorimetric method for determination of sugars and related substances.,Anal.Chem.,28,350-356(1956))
将30μL的对象样品和等量的5w/v％苯酚水溶液混合后，添加150μL的浓硫酸，使它们混合，引发反应。10分钟后立即用冰进行冷却，使反应终止。通过测定反应液在490nm的吸光度，从而测定糖类的浓度。另外，使用标准曲线来确定浓度，该标准曲线是通过将葡萄糖作为标准品进行相同的实验，从而制作的。
2、胞外中性多糖的结构解析
通过上述的阴离子交换柱色谱(TOYOPEARL DEAE-650M树脂(TosohCorporation))纯化的中性多糖进行H-NMR和C-NMR，得到的各自的NMR曲线如图3所示。根据这些NMR曲线的中性多糖的结构解析结果示于图4。
从该结构解析结果可知，IJH-SONE68菌株产生的胞外中性多糖具有N-乙酰葡萄糖胺通过α-1,6键连接的结构。
3、胞外酸性多糖的糖组成分析
通过高效液相色谱(HPLC)法，测定利用上述的阴离子交换柱色谱纯化的酸性多糖的糖组成分析，从而进行。
将10μL的纯化的酸性多糖(7.3mg/mL)和60μL的水混合，制备7倍稀释试样溶液，在试管采取20μL制备的稀释试样溶液，进行减压干燥固化，添加100μL的2mo1/L的三氟乙酸而进行溶解，进行氮置换，减压封管，于100℃水解6小时，接下来，进行减压干燥固化。向得到的残渣添加200μL的水，使其溶解，通过0.22μm的过滤器进行过滤，得到测定用试样溶液，通过水将测定用试样溶液稀释10倍，得到稀释的测定用试样溶液。分析50μL的这些测定用试样溶液和稀释的测定用试样溶液。作为分析仪器，使用HPLC系统：LC-20A系统(ShimadzuCorporation)和荧光分光光度计M-10AxL(Shimadzu Corporation)。分析条件如下。
柱：TSK-gel Sugar AXG 4.6mmI.D.×15cm(Tosoh公司制)
柱温：70℃
流动相：0.5mo1/L硼酸钾缓冲液，pH 8.7
流动相流速：0.4mL/分钟
柱后标记：反应试剂：lw/v％精氨酸/3w/v％硼酸
反应试剂流速：0.5mL/分钟
反应温度：150℃
检测波长：Ex.320nm Em.430nm
获得由胞外酸性多糖制备的试样的色谱图和各单糖类的校准曲线数据，由校准曲线求出胞外酸性多糖的糖成分的试样中浓度。得到的结果在表2示出。
[表2]
胞外酸性多糖的糖成分
Figure BDA0002526190590000161
表中n.d.表示未检测出。
实施例3
IJH-SONE68菌株产生的多糖类的抑制脂肪蓄积的作用
通过以下记载的方法研究在实施例2得到的IJH-SONE68菌株产生的多糖类即包含中性多糖组分和酸性多糖组分的多糖类样品的抑制脂肪蓄积作用。
1、试验方法
作为试验对象，使用作为人类肝癌来源细胞系的HuH-7细胞。HuH-7细胞通过包含10v/v％FBS(fetal bovine serum)、100U/mL青霉素G和100μg/mL链霉素的DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)培养基(含有高葡萄糖、L-谷氨酰胺、酚红、丙酮酸钠)进行培养。使融合的细胞在新DMEM培养基悬浮，接种在细胞培养用24孔板使其为8×104细胞/孔。此时，每1孔的液量控制为500μL。24小时培养后，在各孔中添加棕榈酸(PA)∶油酸(OA)(PA/OA)溶液(＝1∶2，溶解在DMSO中)，使最终浓度为600μM(PA：200μM和OA：400μM)，进一步培养24小时，由此开始脂肪酸的吸收。此时，也同时添加各个多糖类样品(最终浓度4-400μg/mL)，评价脂肪酸向细胞的吸收抑制。
经过24小时后，通过抽吸器去除各孔中的培养液，加入500μL的PBS(phosphatebuffered saline)，清洗细胞和孔。去除PBS后，加入250μL的10w/v％福尔马林溶液，固定细胞。接下来利用500μL的PBS清洗两次，去除PBS后，加入150μL的上色剂溶液(甘油三酸酯E-Test Wako)，在37℃进行显色反应30分钟。反应后，通过从各个孔回收100μL的反应液，测定600nm的吸光度，由此，将细胞吸收的脂肪酸的量作为细胞内甘油三酸酯(中性脂肪)的量进行测定、比较。使用植物乳杆菌SN35N菌株(保藏号NITE P-6)产生的多糖类作为对照。
2、试验结果
实施2次脂肪酸吸收评价(1st和2nd)，得到的结果在表3示出。
[表3]
添加了不同EPS的HuH-7细胞中的中性脂肪蓄积量
Figure BDA0002526190590000171
此外，得到的结果也在表5示出。由表3和图5的结果可知，通过仅添加PA/OA溶液，细胞中的甘油三酸酯(中性脂肪)的量明显增加。此外，仅添加作为使PA/OA溶解的溶剂的DMSO(载体，vehicle)的情况与未做任何添加的情况(空白，NC)同样，没有确认到变化。另一方面，在PA/OA存在下添加IJH-SONE68菌株产生的多糖类样品(EPS)(SONE68)的情况下，确认到脂肪蓄积被抑制的状态，其为EPS浓度依赖性细胞内的脂肪酸吸收抑制。另外，就抑制的程度而言，IJH-SONE68菌株产生的多糖类样品比SN35N菌株产生的多糖类样品(EPS)(SN35N)的抑制程度高。
基于以上结果可知，IJH-SONE68菌株产生的多糖类具有抑制脂肪蓄积作用。
实施例4
IJH-SONE68菌株的抗肥胖作用和抑制脂肪蓄积作用
使用高脂饮食诱导肥胖模型小鼠，对IJH-SONE68菌株的抗肥胖活性和抑制脂肪蓄积活性进行评价。其结果是，通过摄取由IJH-SONE68菌株发酵的凤梨果汁发酵液，高脂饮食品诱导肥胖模型小鼠的体重增加和内脏脂肪的蓄积显著地被抑制。
1、试验方法
本试验中，使用C57BL/6Jcl(SPF)雄性小鼠。放入7周龄的小鼠，在每个饲养笼饲养5只。使用常规饲料(MF，Oriental Yeast Co.,Ltd.制)驯化饲养1周后，每5只分为一组(A组～E组)，将饲料变更为高脂肪食品(Research Diets,Inc.,#D12492)，开始肥胖的诱导。另外，饲喂饲料时，预先通过木槌将高脂肪食品粉碎成粘土状，使用玻璃制的粉末喂食器(KN-675-4A)每1次打包120g供给，以1个星期的间隔进行交换。此外，投喂样品在喂食器打包前与高脂肪食品混合，使其均匀。在全部的组中，饲料、饮用水均自由摄取。作为投喂样品，使用IJH-SONE68菌株发酵凤梨果汁原液和其稀释液等，其中，该IJH-SONE68菌株发酵凤梨果汁原液是以121℃、20分钟的条件，对用100％的凤梨果汁(包含1w/v％的烧酒蒸馏残渣)培养IJH-SONE68菌株48小时得到的发酵液进行灭菌处理而得到的。小鼠A组～F组的服用样品的详细内容如下所述。
A组：将IJH-SONE68菌株发酵凤梨果汁原液与高脂肪食品一起摄取的组(该组摄取向120g高脂肪食品中添加7mL发酵凤梨果汁原液并进行混合的投喂样品)
B组：将IJH-SONE68菌株发酵凤梨果汁的10倍稀释液与高脂肪食品一起摄取的组(该组摄取向120g高脂肪食品中添加7mL稀释液的投喂样品，其中，上述稀释液是通过使用无菌蒸馏水将发酵凤梨果汁原液稀释10倍后而得到的)
C组：将IJH-SONE68菌株发酵凤梨果汁的100倍稀释液与高脂肪食品一起摄取的组(该组摄取向120g高脂肪食品中添加7mL稀释液的投喂样品，其中，上述稀释液是通过使用无菌蒸馏水将发酵凤梨果汁原液稀释100倍后而得到的)
D组：将未发酵的凤梨果汁与高脂肪食品一起摄取的组(该组摄取向120g高脂肪食品中添加7mL凤梨果汁并进行混合的投喂样品)
E组：仅以高脂肪食品饲养的组(阳性对照组)(该组摄取向120g的高脂肪食品中添加7mL的无菌蒸馏水并进行混合的投喂样品)
F组：仅以常规饲料饲养的组(阴性对照组)
将饲料的内容由高脂肪食品变更为上述A组～F组的各种饲料后，继续饲养12周。另外，饲养期间，每1周测定一次体重。饲养终止后，通过异氟烷吸入麻醉，使小鼠安乐死，提取内脏脂肪，测定其重量。各个测定数据的显著性差异检验使用无对应的t检验，当p值(危険率)小于0.05时判定为“存在显著性差异”。
2、试验结果和考察
上述A组～F组的各组的每1周的体重增加量(自饲养开始时间点(0周)的体重开始的增加量)的推移在表4和表5示出(表4表示体重增加量平均值(g)，表5表示其标准误差(SE))，将它们图表化示于图6。此外，饲养最后一周(12周)的各组的体重增加量的平均值示于表6，将其图表化示于图7。各数据以平均值±标准误差表示，组间的显著性差异检验使用Tukey-Kramer法，将p值(危険率)小于0.05的组判定为存在显著性差异(以下记载的图6和7中仅描述与阳性对照组的显著性差异)。
[表4]
各种饲料喂养组(各组n＝5)的每经过一周的体重增加量的平均值(g)
经过的周数 A组 B组 C组 D组 E组 F组
0 0 0 0 0 0 0
1 4.26 5.12 3.88 4.60 4.82 3.27
2 5.82 3.48 4.66 5.64 6.02 3.73
3 5.84 6.32 6.04 7.50 7.32 5.00
4 6.98 5.24 6.88 9.62 9.38 5.40
5 7.94 5.52 8.38 11.62 10.22 5.90
6 9.06 5.52 9.44 12.78 11.64 6.63
7 6.38 5.78 9.98 15.46 13.10 6.90
8 8.78 8.02 10.52 16.88 14.38 7.07
9 10.58 8.26 12.58 19.32 15.92 8.60
10 12.32 9.16 14.06 20.92 17.18 8.80
11 11.52 10.54 15.98 22.98 18.28 9.33
12 12.34 11.68 16.94 24.62 19.98 9.50
[表5]
各种饲料喂养组(各组n＝5)的每经过一周的体重增加量的平均值(g)的标准误差(SE)
经过的周数 A组 B组 C组 D组 E组 F组
0 0 0 0 0 0 0
1 0.69 1.06 0.23 1.61 1.20 1.16
2 0.59 0.84 0.37 1.77 1.21 1.42
3 1.11 1.03 0.40 1.97 1.15 1.57
4 1.15 0.69 0.62 2.23 1.16 1.80
5 1.49 1.07 0.82 2.36 1.11 1.67
6 1.60 0.73 0.97 2.69 1.26 1.20
7 1.08 0.80 1.16 2.79 1.28 1.27
8 1.58 1.03 1.22 2.92 1.41 1.52
9 1.88 0.99 1.49 3.12 1.61 1.15
10 2.19 1.09 1.64 3.26 1.84 1.07
11 2.38 1.27 1.71 3.53 1.88 0.90
12 2.55 1.23 1.85 3.50 1.99 0.67
[表6]
经过12周后各种饲料喂养组(各组n＝5)的体重增加量的平均值(g)和标准误差(SE)
12周 A组 B组 C组 D组 E组 F组
平均值 12.34 11.68 16.94 24.62 19.98 9.50
标准误差 2.55 1.23 1.85 3.50 1.99 0.67
由表4～6和图6～7可知，与阴性对照组(F组)相比，阳性对照组(E组)中，确认到存在因摄取高脂肪食品而导致体重显著增加的状态(p＜0.01)。与阳性对照组相比可知，在摄取发酵凤梨果汁的组中，在摄取其原液和10倍稀释液的组(A组和B组)中，因摄取高脂肪食品而导致的体重上升被显著地抑制(且p＜0.05)。此外，在摄取100倍稀释的发酵果汁的情况(C组)下，其效果减弱，但是与阳性对照组相比，增加量仍较少。另一方面，在摄取未发酵的凤梨果汁的组(D组)中，观察到有与阳性对照组相比体重增加的状态，但是，这不能被认为是显著性差异。
接着，在饲养最后一周(12周)的时间点，将各组小鼠的内脏脂肪量重量的测定结果示于表7和图8。
[表7]
饲养12周时各组的内脏脂肪重量的平均值(mg)和标准误差(SE)
A组 B组 C组 D组 E组 F组
平均值 2735 1633 4108 6240 5172 1346
标准误差 828 159 596 789 687 333
由表7和图8可知，与阴性对照组相比，在阳性对照组中，确认到存在因摄取高脂肪食品而导致内脏脂肪量也显著增加的状态(p＜0.01)。此外，与阳性对照组相比，在摄取发酵凤梨果汁的组中，确认到摄取10倍稀释液时(B组)，内脏脂肪量的增加被明显抑制(p＜0.01)，摄取原液的组(A组)中，仍然有抑制倾向(p＜0.1)。另一方面，在摄取100倍稀释的发酵果汁的情况(C组)下，其效果减弱。进而，在摄取未发酵的凤梨果汁的组(D组)中，与体重同样地观察到有与阳性对照组相比增加的状态，但是，这不能被认为是显著性差异。
基于以上结果可知，通过摄取10倍稀释的IJH-SONE68菌株发酵凤梨果汁，由高脂肪食品摄取诱导的体重增加和内脏脂肪量的增加均被显著地抑制。在IJH-SONE68菌株发酵凤梨果汁原液和100倍稀释液的摄取中，可确认到其效果减弱的状态。可以认为，其原因是在100倍稀释液中与小鼠的功能性有关的成分被稀释。由于在摄取未发酵的凤梨果汁的情况下，小鼠体重会增加到阳性对照组的小鼠体重以上，因此可以认为，在使用IJH-SONE68菌株发酵凤梨果汁原液的情况下，其效果减弱可能是因残存在凤梨果汁中的糖分所导致的。
从以上详细说明可知，根据本发明，可以提供以下的发明。
[1]一种组合物，用于抑制脂肪蓄积，其以属于副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)的乳酸菌的菌体、其培养物或发酵物、或者其产生的多糖类为有效成分。
[2]根据上述[1]所述的组合物，其用于预防或改善肥胖。
[3]根据上述[1]所述的组合物，其用于预防或改善脂肪肝或肝功能障碍。
[4]根据上述[1]～[3]中任一项所述的组合物，其中，乳酸菌为来自于无花果的乳酸菌。
[5]根据上述[1]～[4]中任一项所述的组合物，其中，乳酸菌为Lactobacillusparacasei IJH-SONE68菌株(保藏号NITE BP-02242)或与之等效的乳酸菌。
[6]根据上述[1]～[5]中任一项所述的组合物，其中，培养物或发酵物通过在凤梨属植物果汁的存在下将乳酸菌培养或发酵而得到。
[7]根据上述[1]～[5]中任一项所述的组合物，其中，多糖类为具有N-乙酰葡萄糖胺通过α-1,6键连接的结构的中性多糖。
[8]根据上述[1]～[5]中任一项所述的组合物，其中，多糖类为主要由葡萄糖和甘露糖构成的酸性多糖。
[9]根据上述[1]～[8]中任一项所述的组合物，其中，组合物为饮食品组合物。
[10]根据上述[9]所述的组合物，其中，饮食品为饮料、功能性食品、发酵食品或保健品。
[11]根据上述[1]～[8]中任一项所述的组合物，其中，组合物为药物组合物。
[12]根据上述[1]～[8]中任一项所述的组合物，其中，组合物为饲料组合物。
[13]一种组合物的用于抑制脂肪蓄积的用途，上述组合物以Lactobacillusparacasei IJH-SONE68菌株和属于副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)的乳酸菌的菌体、其培养物或发酵物、或者其产生的多糖类为有效成分。
[14]根据上述[13]所述的用途，其中，组合物用于预防或改善肥胖。
[15]根据上述[13]所述的用途，其中，组合物用于预防或改善脂肪肝或肝功能障碍。
[16]根据上述[13]～[15]中任一项所述的用途，其中，乳酸菌为来自于无花果的乳酸菌。
[17]根据上述[13]～[16]中任一项所述的用途，其中，乳酸菌为Lactobacillusparacasei IJH-SONE68菌株(保藏号NITE BP-02242)或与之等效的乳酸菌。
[18]根据上述[13]～[17]中任一项所述的用途，其中，培养物或发酵物通过在凤梨属植物果汁的存在下将乳酸菌培养或发酵而得到。
[19]根据上述[13]～[17]中任一项所述的用途，其中，多糖类为具有N-乙酰葡萄糖胺通过α-1,6键连接的结构的中性多糖。
[20]根据上述[13]～[17]中任一项所述的用途，其中，多糖类为主要由葡萄糖和甘露糖构成的酸性多糖。
[21]根据上述[13]～[20]中任一项所述的用途，其中，组合物为饮食品组合物。
[22]根据上述[21]所述的用途，其中，饮食品为饮料、功能性食品、发酵食品或保健品。
[23]根据上述[13]～[20]中任一项所述的用途，其中，组合物为药物组合物。
[24]根据上述[13]～[20]中任一项所述的用途，其中，组合物为饲料组合物。
[25]一种抑制在对象中脂肪蓄积的方法，所述方法包含如下步骤：将包含Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株和属于副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)的乳酸菌的菌体、其培养物或发酵物、或者其产生的多糖类作为有效成分的组合物应用于需要它的对象。
[26]根据上述[25]所述的方法，其预防或改善肥胖。
[27]根据上述[25]所述的方法，其预防或改善脂肪肝或肝功能障碍。
[28]根据上述[25]～[27]中任一项所述的方法，其中，乳酸菌为来自于无花果的乳酸菌。
[29]根据上述[25]～[28]中任一项所述的方法，其中，乳酸菌为Lactobacillusparacasei IJH-SONE68菌株(保藏号NITE BP-02242)或与之等效的乳酸菌。
[30]根据上述[25]～[29]中任一项所述的方法，其中，培养物或发酵物通过在凤梨属植物果汁的存在下将乳酸菌培养或发酵而得到。
[31]根据上述[25]～[30]中任一项所述的方法，其中，多糖类为具有N-乙酰葡萄糖胺通过α-1,6键连接的结构的中性多糖。
[32]根据上述[25]～[30]中任一项所述的方法，其中，多糖类为主要由葡萄糖和甘露糖构成的酸性多糖。
[33]根据上述[25]～[32]中任一项所述的方法，其中，组合物为饮食品组合物。
[34]根据上述[33]所述的方法，其中，饮食品为饮料、功能性食品、发酵食品或保健品。
[35]根据上述[25]～[32]中任一项所述的方法，其中，组合物为药物组合物。
[36]根据上述[25]～[32]中任一项所述的方法，其中，组合物为饲料组合物。
产业上可利用性
如上述详细说明的那样，本发明的组合物对抑制脂肪蓄积有效，能够用于预防或改善肥胖，并且能够用于预防或改善脂肪肝或肝功能障碍。本发明的组合物能够用作用于预防或改善肥胖、脂肪肝或肝功能障碍的饮食品、药品、饲料。而且，本发明的组合物由于以属于副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)的乳酸菌的菌体、其培养物或发酵物、或者其产生的多糖类为有效成分，因此安全性高、能够长期使用，且能够廉价地大量供给，其有用性和实用性极高。
PCT/RO/134表
Figure QDA0002616610280000011
Figure QDA0002616610280000021

Claims (12)

1.一种组合物，用于抑制脂肪蓄积，所述组合物以属于副干酪乳杆菌即Lactobacillusparacasei的乳酸菌的菌体、其培养物或发酵物、或者所述乳酸菌产生的多糖类为有效成分。
2.根据权利要求1所述的组合物，其用于预防或改善肥胖。
3.根据权利要求1所述的组合物，其用于预防或改善脂肪肝或肝功能障碍。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的组合物，其中，乳酸菌为来自于无花果的乳酸菌。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的组合物，其中，乳酸菌为Lactobacillusparacasei IJH-SONE68菌株或与之等效的乳酸菌，所述Lactobacillus paracasei IJH-SONE68菌株的保藏号为NITE BP-02242。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的组合物，其中，培养物或者发酵物通过在凤梨属植物果汁的存在下将乳酸菌培养或者发酵而得到。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的组合物，其中，多糖类为具有N-乙酰葡萄糖胺通过α-1,6键连接的结构的中性多糖。
8.根据权利要求1～6中任一项所述的组合物，其中，多糖类为主要由葡萄糖和甘露糖构成的酸性多糖。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的组合物，其中，组合物为饮食品组合物。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中，饮食品为饮料、功能性食品、发酵食品或保健品。
11.根据权利要求1～8中任一项所述的组合物，其中，组合物为药物组合物。
12.根据权利要求1～8中任一项所述的组合物，其中，组合物为饲料组合物。
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