KR101804778B1 - 기능성 희소당 알룰로스의 생산능을 가지는 락토바실러스 플란타룸 hy7716 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품 - Google Patents

기능성 희소당 알룰로스의 생산능을 가지는 락토바실러스 플란타룸 hy7716 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품 Download PDF

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Abstract

본 발명은 기능성 희소당 알룰로스의 생산능을 가지는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품에 관한 것으로서, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716은 체중 조절 및 체지방 감소의 효과를 지닌 기능성 희소당 알룰로스의 생산능을 가지므로 이를 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물, 건강기능식품, 기능성음료, 발효제품 등 비만 예방 및 개선 효과를 갖는 제품에 응용될 수 있다.

Description

기능성 희소당 알룰로스의 생산능을 가지는 락토바실러스 플란타룸 HY7716 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품{Lactobacillus plantarum HY7716 having production capability of the rare sugar allulose, and Products containing thereof as effective component}
본 발명은 기능성 희소당 알룰로스의 생산능을 가지는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 체중 조절 및 체지방 감소의 효과를 지닌 기능성 희소당 알룰로스의 생산능을 가지는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품에 관한 것이다.
알룰로스(Allulose, D-psicose)는 과당(D-fructose)의 C-3 에피머(epimer)로서, 자연계에 매우 드물게 극소량이 존재하는 단당류이다. 배당체인 사이코푸라닌(psicofuranine)의 당부분에서 유래되었으며, 커피나 식탁용 소스, 무화과 등에도 소량 발견되기도 한다. 특히, 우수한 감미질과 설탕 대비 70%의 당도를 지니면서도 설탕 대비 0.3%의 에너지를 내는 특징은 매우 중요한 장점 중의 하나이며 당알코올류인 자일리톨, 만니톨, 말티톨, 소르비톨 등과 달리 과량 섭취에 따른 설사와 같은 부작용도 없다(Food Sci Technol Res 12:137-143, 2006).
최근 이를 이용한 기능성에 관련한 보고에 비하여, 양산과 관련한 기술이 개발되지 않아서 이에 대한 관심이 증대되고 있는 실정이다. 기존의 알룰로스 생산은 주로 화학적 기술에 기반하였다. Bilik 등(Chem Zvesti 28:106-109, 1973)은 몰리브산 이온의 촉매 작용을 통하여 과당으로 알룰로스를 생산하였으며 McDonald(Carbohydr Res 5:106-108, 1967)는 화학적 기법을 이용하여 1,2:4,5-di-o-isopropylidene-beta-D-fructopyranose를 알룰로스로 전환하여 생산하였고, Doner(Carbohydr Res 70:209-216, 1979)는 과당을 에탄올과 트리에틸아민(triethylamine)과 함께 끓여 알룰로스의 생산을 시도하였다. 그러나 이러한 화학적 기술은 많은 생산비용과 정제비용이 발생되며 생산물의 안전성 등에서 문제가 있어 왔다.
이에 생물학적 방법 특히, 효소의 촉매 작용을 이용한 생산 기술들이 꾸준히 연구되어 왔다. Ishida 등(J Ferment Bioeng 83:529-534, 1997)은 슈도모나스 치코리(Pseudomonas cichorii) ST-24의 타가토스(tagatose) 에피머화 효소를 이용한 알룰로스의 생산을 확인하였다. 대한민국 출원공개 제10-2006-0125971호(발명의 명칭: 사이코스 에피머화 효소에 의한 사이코스의 생산방법)에는 아그로박테리움 투메패시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 유래의 사이코스 에피머화 효소를 이용한 알룰로스의 생산방법이 게시되어 있다. 대한민국 특허등록 제0832339호(발명의 명칭: 과당을 사이코스로 전환하는 신규한 시노리조비움 속 균주와 이를 이용한 사이코스 생산법)에는 시노리조비움 속(Sinorhizobium sp .) YB-58 균주의 배양 및 배양된 균체를 이용한 알룰로스의 생산방법이 게시되어 있다. Zhang 등(Biotechnol Lett 31:857-862, 2009)은 로도박터 스패로이데스(Rhodobacter sphaeroides)의 D-타가토스-3-에피머화 효소를 이용한 알룰로스의 생산을 보고하였으며, Mu 등(J Agric Food Chem 59:7785-7792, 2011)은 클로스트리디움 셀룰로라이티쿰(Clostridium cellulolyticum) H10 균주의 D-사이코스-3-에피머화 효소의 알룰로스 생산과 관련한 특성을 보고하였다. 그러나, 이러한 생물학적 기술은 식용 유래가 없는 균주를 사용하거나, 또는 해당 균주의 유전자를 이용하여 제작된 유전자 변형 생물체(Genetically Modified Organisms, GMO)를 이용하여 알룰로스를 생산하기 때문에 체내 안전성에 대한 문제 제기와 이로 인한 소비자의 거부감이 높아 상업화에 문제가 있어 왔다.
이에 본 발명자들은 기존의 화학적 및 생물학적 기술의 알룰로스 생산법에서 필수인 별도의 정제과정(탈염, 탈색 등)을 필요로 하지 않고, 대규모 생산설비(균체 고정화 장비, 반응용 연속실 컬럼, 분리정제용 컬럼 등)를 요구치 않는 새로운 알룰로스의 효율적 생산을 위하여 국내의 김치로부터 알룰로스 생산능이 매우 우수한 균주를 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
대한민국 출원공개 제10-2006-0125971호(발명의 명칭: 사이코스 에피머화 효소에 의한 사이코스의 생산방법, 공개일: 2006.12.07) 대한민국 특허등록 제0832339호(발명의 명칭: 과당을 사이코스로 전환하는 신규한 시노리조비움 속 균주와 이를 이용한 사이코스 생산법, 공고일: 2008.05.26)
본 발명은 체중 조절 및 체지방 감소의 효과를 지닌 기능성 희소당 알룰로스(allulose)의 생산능을 가지는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물, 기능성 음료, 발효유, 건강기능식품 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 체중 조절 및 체지방 감소의 효과를 지닌 기능성 희소당 알룰로스(allulose)의 생산능을 가지는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물, 기능성 음료, 발효유, 건강기능식품 등을 제공하는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 신균주는 당발효 실험 결과, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 당발효 실험과 100% 일치하는 것으로 확인되어 본 발명자들은 이를 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716로 명명하고, 2016년 9월 8일자로 생물자원센터(기탁번호: KCTC 13102BP)에 기탁하였다.
한편, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물은 단독 또는 약제학적으로 사용되는 부형제들과 함께 약제학적으로 통상으로 사용되는 방법에 따라 정제, 캡슐제 등과 같은 제재형태로 제제화 하여 사용될 수 있다.
사람의 경우, 통상적인 1일 투여량은 1~30mg/kg 체중의 범위일 수 있고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 실제 투여량은 투여경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 건강상태 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 한다.
물론, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물은 독성 및 부작용은 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
또한, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716을 유효성분으로 함유하는 식품 조성물은 식품, 식품첨가제, 음료, 음료첨가제, 발효유, 건강기능식품 등으로 사용될 수 있다. 식품, 식품첨가제, 음료, 음료첨가제, 또는 건강기능식품으로 사용되는 경우, 각종 식품류, 발효유, 육류, 음료수, 초콜렛, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 알코올 음료, 비타민 복합제, 주류 및 그 밖의 건강기능식품일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
특히, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716을 유효성분으로 함유하는 발효유는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716 동결건조분말, 유산균 배양액 및 혼합과즙시럽을 일정비율로 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 용기에 포장하여 발효유를 제조한다.
또한, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716을 유효성분으로 함유하는 기능성 음료는 혼합과즙시럽, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716 동결건조분말 및 물을 일정한 비율로 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 기능성 음료를 제조한다.
또한, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716을 포함하는 것 이외에 영양보조 성분으로 비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드, 올리고당 등이 첨가될 수 있으며 여타의 식품 첨가물이 첨가되어도 무방하다.
본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716은 체중 조절 및 체지방 감소의 효과를 지닌 기능성 희소당 알룰로스의 생산능을 가지므로 이를 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물, 건강기능식품, 기능성음료, 발효제품 등 비만 예방 및 개선 효과를 갖는 제품에 응용될 수 있다.
또한, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716은 별도의 분리 및 정제와 같은 후처리가 필요치 않고, 바로 식용이 가능한 장점이 있으므로 식품 내 직접 투입할 수 있고, 또한 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716를 통하여 제조된 알룰로스(allulose) 함유 제품은 별도의 균주 제거와 같은 복잡한 공정을 생략할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 김치로부터 선택된 균주의 알룰로스 생산량을 보여주는 HPLC 크로마토그램 그래프이다.
도 2는 본 발명의 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) HY7716의 온도에 따른 알룰로스 생산능을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) HY7716의 pH에 따른 알룰로스 생산능을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716의 알룰로스 전환율을 나타낸 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 다음의 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 당업자에 의한 통상적인 변화가 가능하다.
<실시예 1>
1-1. 신균주의 분리 및 동정
본 발명에 따른 신균주를 분리하기 위하여 하기의 표 1과 같이 서울, 부산, 성남, 용인, 화성 및 강원도, 전라도 등지의 국내 여러 지역에서 총 79종의 김치를 수집하였다. 상기 수집된 다양한 김치의 국물 400μL를 포도당 대신 알룰로스(1%, w/v)가 탄소원인 MRS(MRS+P) 액체배지 10mL에 접종하고 증균(enrichment) 배양을 진행하였다. 1차로 증균된 샘플들을 10- 9으로 희석한 후, MRS(MRS+P) 고체배지에 100μL씩 도말하고 상온에서 2~4일간 배양하였다. 서로 구분 가능한 집락의 형성을 확인한 후, 단일 집락을 분리하여 다시 MRS(MRS+P) 액체 배지 10mL에 접종하고 상온에서 2~4일간 배양하였다. 배양 후, 96 well plate에 well당 200μL씩 분주하고 600nm에서의 흡광도를 측정하여 균수를 비교하였다.
상기 OD600 결과(표 2)를 바탕으로 MRS(MRS+P) 액체배지에서 증균되지 않는 5종을 제외한 나머지 각 균체를 각각 MRS+P 액체 배지에서 활성화시킨 후, 배양 균체를 분리 회수하고 이를 이용하여 전세포 전환 반응(whole cell conversion)을 수행하고, 각 균주의 알룰로스 생산량을 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)를 통하여 확인하였다.
즉, 준비된 균체를 원심분리를 통하여 회수한 후, PBS 용액을 이용하여 현탁 후, 재원심분리하여 전세포반응을 위한 세포를 준비하였다. 준비된 균체에 50% 과당용액을 넣어준 후, 50℃에서 12~48시간 전환반응을 수행하고 반응물의 알룰로스 함량을 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)를 이용하여 분석하였다.
HPLC 분석조건은 다음과 같다. 즉, 반응용 시럽 내의 과당과 알룰로스의 함량은 HPLC 1100 series(Agilent사)에 RI검출기(Refractive Index detecter, Agilent 1200 series)를 장착한 후, SP0810 컬럼(Shodex사)으로 분리한 후 측정하였다. 이동상으로는 필터된 3차수를 탈기(degassing)한 후 사용하였으며, 유속은 분당 1mL, 컬럼 오븐의 온도는 80℃로 설정하였다. 분석 샘플은 0.22㎛ 수준으로 필터한 후, 자동샘플주입기를 이용하여 10㎕씩 주입하였으며 RI 검출기상의 흡광도 면적값을 이용하여 정량을 수행하였다. 표준품의 과당 및 알룰로스를 1mg/mL의 농도로 녹여 정량 분석에 사용하였다.
그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 알룰로스를 생산하는 3종의 미생물(P18A, P18B, P23D)을 확인할 수 있었다. 이 중 식용 가능한 균주 P23D는 이후 균주동정을 통하여 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) HY7716으로 명명된 종이었다.
Figure 112016111938307-pat00001
Figure 112016111938307-pat00002
1-2. 신균주의 동정
상기 실시예 1-1의 균주 중 식용 가능한 균주를 동정하고자 16S rDNA 분석을 통한 분자유전학적인 방법을 실시하여 결과를 하기의 표 3에 나타내었다. 즉, MRS(MRS+P) 액체배지에 배양된 본 발명의 신균주로부터 분리한 유전체 DNA를 주형으로 하여 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'), 1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') 프라이머(primer)를 사용하여 PCR 반응[(95℃, 3분) x 1 cycle, (95℃, 30초; 50℃, 30초; 72℃, 90초) x 30 cycles, (72℃, 10분) x 1 cycle]을 수행하여 1.45kbp의 증폭산물을 얻은 후 정제하여 시퀀싱(sequencing) 반응을 통해 염기서열을 분석한 결과를 토대로 BLAST 검색결과(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)에서 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주로 동정할 수 있었다.
하기의 표 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 신균주의 16S rDNA 유전자는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716의 16S rDNA 유전자와 99% 일치하는 것으로 확인되었다.
Figure 112016111938307-pat00003
또한, 이렇게 분리한 신균주를 동정하고자 Biomerieux 사의 API 50 CH kit를 이용하여 당 발효 실험을 한 결과를 하기의 표 4에 나타내었다.
하기의 표 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 신균주의 당발효 실험 결과, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 당발효 실험과 100% 일치하는 것으로 확인되어 본 발명자들은 이를 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716로 명명하고, 2016년 9월 8일자로 생물자원센터(기탁번호: KCTC 13102BP)에 기탁하였다.
본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716의 특성은 다음과 같다.
1)균의 형태
엠알에스(MRS) 한천평판배지에서 37℃, 2일간 배양했을 때 균의 특성
①세포의 형태: 간균
②운동성: 없음
③포자형성능: 없음
④그람(Gram) 염색: 양성
2)균락의 형태
엠알에스(MRS) 한천평판배지에서 37℃, 2일간 배양했을 때 균락의 형태
①형상: 원형
②융기: 볼록
③표면: 매끄러움(slime)
3)생리적 성질
①생육온도: 생장가능 생육온도 15~40℃
최적 생장온도 32-35℃
②생육 pH: 생장가능 생육 pH 5.0~7.5
최적 pH 5.5~6.5
③산소에 대한 영향: 통성혐기성
4)카탈라제: -
5)가스형성여부: -
6)15℃에서 생육: +
7)45℃에서 생육: +
8)인돌생산: -
9)젖산생산: +
10)당 발효 실험 및 동정
Biomerieux 사의 API 50 CH kit를 이용하여 당 발효 실험을 한 결과를 하기의 표 4에 나타내었다.
Figure 112016111938307-pat00004
<실시예 2>
락토바실러스 플란타룸 ( Lactobacillus plantarum ) HY7716의 동결건조분말의 제조
락토바실러스 플란타룸 HY7716의 동결건조 분말을 얻기 위하여 순수 분리된 균주를 배양 및 동결건조하였다. 먼저, 순수 배양된 10mL의 시드 컬쳐(seed culture)를 MRS 액체배지에서 2회 계대배양하여 활성화시킨 후, 활성화된 10mL의 시드 컬쳐를 아래의 200mL의 본 배양용 배지에 접종하고 배양하여, 본 배양용 마더 스타터(mother starter)를 준비하였다. 본 배양용 배지는 다음과 같다. 정제수에 펩톤(peptone) 20g/L, 효모추출물(yeast extract) 40g/L, 포도당 30g/L, 인산화칼륨 2g/L, 트윈(Tween)-80 1g/L, 황산마그네슘(MgSO4) 0.1g/L를 투입하고 잘 용해하여 준비된 배지를 121℃에서 20분간 멸균하였다. 준비된 배지의 온도를 34℃로 맞춘 후, 락토바실러스 플란타룸 HY7716이 배양된 마더 스타터를 1.0%(vol./vol.) 접종하고 15시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 배양액에서, 원심분리하여 균체를 회수하였으며, 회수된 균체는 동결건조 보호제(10% 말토덱스트린, 식용)와 1:1의 비율로 균일하게 혼합한 후, 20kg급 동결건조기(Freeze dryer, 오페론사)에 투입하고 미리 설정된 프로그램에 따라 3일간 동결건조를 진행하였다. 동결건조의 완료를 확인한 후, 동결건조된 균체를 분쇄하여 균일하게 혼합한 후, 이하의 실시예에 사용하였다.
<실시예 3>
락토바실러스 플란타룸 ( Lactobacillus plantarum ) HY7716을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물의 제조
액제의 제조
상기 실시예 2의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716 동결건조분말 100mg, 이성화당 10g, 만니톨 5g을 통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음, 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.
캡슐제의 제조
상기 실시예 2의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716 동결건조분말100mg에 옥수수 전분 100mg, 유당 100mg, 스테아린산 마그네슘 2mg을 완전히 혼합한 후 약전 제제총칙 중 캡슐제 제조방법에 따라 경질 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<실시예 4>
락토바실러스 플란타룸 ( Lactobacillus plantarum ) HY7716을 유효성분으로 함유하는 발효유의 제조
본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716을 유효성분으로 함유하는 발효유를 제조하는 방법은 다음과 같다.
먼저, 유산균 배양액은 원유 95.36중량%와 탈지분유(또는 혼합분유) 4.6중량%를 교반하여 15℃에서의 비중은 1.0473~1.0475, 적정산도는 0.200~0.220%, pH는 6.55~6.70, 20℃에서의 브릭스(Brix0)는 16.3~16.5% 정도가 되도록 혼합하였다. 혼합 후에 이를 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)하고 40℃로 냉각한 뒤, 스트렙토코커스 써모필러스균과 유당분해효소(Valley laboratory, USA)를 각기 0.02중량%씩 첨가하고 6시간 동안 배양하여 BCP배지에서의 총 유산균 수가 1.0 X 109cfu/㎖이상, 적정산도가 0.89~0.91%, pH는 4.55~4.65가 되도록 하여 제조하였다. 그런 다음, 혼합과즙시럽은 액상과당 13중량%, 백설탕 5중량%, 혼합과즙농축액 56Brix0 10.9중량%, 펙틴 1.0중량%, 후레쉬후르츠 믹스 에센스 0.1중량% 및 정제수 70중량%를 30~35℃에서 교반하여 혼합한 후 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)한 후 냉각하여 제조하였다. 그런 다음, 상기 유산균 배양액 69.5중량%와 상기 실시예 2의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716 동결건조분말 0.1중량% 및 상기 혼합과즙시럽 30.4중량%를 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각하여 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716을 유효성분으로 함유하는 발효유를 제조하였다.
<실시예 5>
락토바실러스 플란타룸 ( Lactobacillus plantarum ) HY7716을 유효성분으로 함유하는 기능성 음료의 제조
본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716을 유효성분으로 함유하는 기능성 음료를 제조하는 방법은 다음과 같다.
먼저, 혼합과즙시럽은 액상과당 13중량%, 백설탕 2.5중량%, 갈색설탕 2.5중량%, 혼합과즙농축액 56Brix0 10.9중량%, 펙틴 1.0중량%, 후레쉬후르츠 믹스 에센스 0.1중량% 및 정제수 70중량%를 30~35℃에서 교반하여 혼합한 후 UHT열처리(135℃에서 2초간 살균)한 후 냉각하여 제조하였다.
그리고, 상기의 방법으로 제조된 혼합과즙시럽 30.4중량%와 상기 실시예 2의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716 동결건조분말 0.1중량% 및 나머지 정제수 69.5중량% 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 이를 유리병, 페트병 등 소포장 용기에 포장하여 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716을 유효성분으로 함유하는 기능성 음료를 제조하였다.
<실시예 6>
락토바실러스 플란타룸 ( Lactobacillus plantarum ) HY7716을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품의 제조
상기 실시예 2의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716 동결건조분말 0.1중량%에 영양보조성분(비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드) 및 올리고당을 상기 실시예 2의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716 동결건조분말 100중량부에 대하여 10중량부가 되도록 첨가하여 고속회전 혼합기에서 혼합하였다. 상기 혼합물에 멸균 정제수 10중량부를 첨가, 혼합하고 직경 1~2mm의 과립상으로 성형하였다. 상기 성형된 과립은 40~50℃의 진공건조기에서 건조시킨 후 12~14메쉬(mesh)를 통과시켜 균일하게 과립을 제조하였다. 상기와 같이 제조된 과립은 적당량씩 압출 성형되어 정제 또는 분말로 되거나 경질캡슐에 충전되어 경질캡슐제품으로 제조하였다.
<시험예 1>
본 발명의 락토바실러스 플란타룸 ( Lactobacillus plantarum ) HY7716의 생육조건에 따른 알룰로스 생산능 확인
본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716의 알룰로스 생산 특성을 확인하고자 온도 및 pH에 따른 알룰로스 생산능을 확인하였다.
1-1. 알룰로스 생산 최적 반응 온도 확인
먼저, 최적 온도를 확인하고자, MRS+P 액체배지에서 배양된 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716 균주를 원심분리를 통하여 균체만을 회수하였다. 2mL씩 동량의 배양액을 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 50% 과당 용액(wt/vol.)을 1mL 씩 투입하고 하부의 균체를 현탁하였다. 이렇게 현탁된 균체-과당 혼합 용액을 각각 30℃, 40℃, 50℃, 60℃, 70℃의 수욕조에 넣은 후, 10분간 과당-알룰로스 전세포 전환반응을 수행하였으며, 반응이 끝난 용액은 곧바로 끓는 물에서 10분간 효소의 실활을 유도하였다. 이어서, 원심분리로 균체와 반응액을 분리한 후, 상층액만을 취하여, 0.22㎛ 크기의 필터로 필터링하고 HPLC로 생성된 알룰로스의 양을 비교하여 최적 온도를 확인하였다.
그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716의 알룰로스 생산량이 40℃, 50℃에서 점차 높아지다가 60℃에서 가장 높게 나타나고, 70℃에서 생산량이 줄어듬을 통해서 60℃가 알룰로스 생산 최적 반응 온도임을 알 수 있었다.
1-2. 알룰로스 생산 최적 반응 pH 확인
상기 시험예 1-1에서와 같은 방법으로 배양된 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716 균체를 원심분리하고, 분리된 균체를 미리 pH가 조절된 인산나트륨 완충 용액과 트리스 완충 용액을 이용하여 반응 최적 pH를 확인하였다.
그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, pH에 따른 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716의 알룰로스 생산능의 측정은 PH 6.0~9.5 구간에서 0.5 간격으로 확인하였으며, 생산능이 가장 높았던 pH 7.5에서의 활성을 100%로 볼 때, pH 7.0과 pH 8.0에서는 pH 7.5에서의 활성에 비하여 각각 77%, 54%의 활성을 나타내었다.
<시험예 2>
본 발명의 락토바실러스 플란타룸 ( Lactobacillus plantarum ) HY7716의 알룰로스 전환율 확인
상기 시험예 1에서 확인한 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716의 알룰로스 생산 최적 반응 온도 및 pH인 60℃와 pH 7.5 조건에서 과당-알룰로스 전환 전세포 반응을 실시하였다. 각각 1시간, 2시간, 3시간, 6시간, 12시간 째에 샘플을 수거하여 반응액 중의 알룰로스의 생산량을 HPLC를 이용하여 분석하고, 반응 기질인 과당 대비 알룰로스의 생산량(생산된 알룰로스의 양/투입된 과당의 양)을 도식화하였다.
그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716의 최대 전환율은 6.2%에 이르렀음을 알 수 있었다.
비록, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716의 알룰로스 생산 전환율이 6.2%로서 유전자 변형 생물체(Genetically Modified Organisms, GMO)를 활용한 알룰로스 생산 전환율 약 20~30% 보다 낮지만, 유전자 변형 생물체를 이용하여 알룰로스를 생산하는 경우에 발생하는 인체내 안전성에 대한 문제와 이로 인한 소비자의 거부감이 높아 상업화에 문제가 없어 훨씬 경제적이라 할 것이다.
생물자원센터 KCTC13102BP 20160908

Claims (4)

  1. 희소당 알룰로스(allulose)의 생산능을 가지는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716(기탁번호: KCTC 13102BP).
  2. 삭제
  3. 제1항의 희소당 알룰로스(allulose)의 생산능을 가지는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HY7716(기탁번호: KCTC 13102BP)를 유효성분으로 함유하는 비만 개선용 식품 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 식품 조성물은 기능성 음료, 건강기능식품, 발효유 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 비만 개선용 식품 조성물.
KR1020160152749A 2016-11-16 2016-11-16 기능성 희소당 알룰로스의 생산능을 가지는 락토바실러스 플란타룸 hy7716 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품 KR101804778B1 (ko)

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